СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С Ig E Российский патент 1997 года по МПК A61K38/02 A61K39/395 

Гиперчувствительность среднего типа, такая, как (экзогенная) астма, сенная лихорадка и аллергические ответы на определенную пищу и лекарства, опосредована первично иммуноглобулином E (Ig E). При Ig E-опосредованном аллергическом ответе аллерген связывается с IgE на поверхности клеток и базофильных лейкоцитов (базофилов). Это связывание вызывает перекрестное сшивание молекул IgE и, следовательно, подлежащих рецепторов F с части IgE (Fc∈R) и, т.о. "включает" высвобождение фармакологических медиаторов, таких как гистамин, медленно влияющее вещество анафилаксиса и серотонин. Высвобождение этих продуктов тучных клеток и базофилов вызывает различные патологические проявления аллергии.

Пациентов, пораженных IgE-опосредованными реакциями гиперчувствительности, часто обрабатывают антагонистами гистамина для смягчения симптомов. Кроме того, во время сезонов сенной лихорадки используются процедуры понижения чувствительности для предупреждения или смягчения устойчиво длящихся аллергических реакций. При этих процедурах инъецируются периодически малые дозы аллергена для индуцирования некоторых не до конца понятных иммунных ответов, которые как-то снижают IgE-опосредованные ответы. Процедуры снижения чувствительности эффективны для некоторых пациентов и лишь незначительно эффективны для других.

Было предложено, что IgE-опосредованная аллергия может лечиться предотвращением связывания IgE с тучными клетками и базофилами. Например, синтетические пептиды, представляющие различные районы IgE (Fc∈), были исследованы в качестве конкурентных ингибиторов связывания IgE с рецепторами на тучных клетках и базофилах. См. например, Stanhworth, D.R, Moles. Immun. 21: 1183-1190(1984); Stauworth D. R. And Burt D. C. Molec. Immun, 23-1231-1235(1986); Burt D.C. et al Molec. Immun, 24:379-389 (1987); Hahn, V.C.Patent N 4.683.292; Hamburger, U.S. Patent Nos 4.171.299 aud 4.161.522. Однако, предположительно из-за намного меньшего сродства этих пептидов к Fc∈R по сравнению с целым IgE, такие пептиды не оказались высокоэффективными в лечении аллергии.

В последние годы для картирования различных антигенных и функциональных эпитопов IgE применялись методологии моноклональных антител. Bauiyach and Eshhar (Eur. 1. Immunol. 14:799-807 (1984). Сообщали, что среди нескольких моноклональных антител крысы, полученных против IgE, три подавляли связывание IgE мыши с базофильными клетками крысы. Поскольку антитела могли вызывать высвобождение серотонина из базофилов, связанных с IgE, антитела предположительно связывали сайты на Fc, расположенные около, но не в сайте связывания с рецепторами IgE на базофилах. Позже те же исследователи получили моноклональное антитело, которое могло подавлять связывание Ig E с базофильными клетками, но не узнавало Ig E на поверхности базофила. Bauiyash et al, Molee Immunol, 25:705 (1988). Siraganiau and colleagues (см. Fed. Proc. 40: 965 (1981), Fed. Proc. 46:1346 (1987) сообщали, что среди приблизительно 10 моноклональных антител мыши, полученные против Ig E человека, несколько не могли связывать Ig E на базофилах. Они также описывали, что некоторые из этих последних моноклональных антител могли подавать связывание Ig E человека с базофилами. Эти исследования относили использование моноклональных антител к определению различных эпитопов или функционально отнесенных пептидных сегментов на Ig E.

Недавно Whitaker описал иммунотоксин, специфический для изотипа Ig E, и его использование в лечении аллергии. U.S. Pateut 4 714 759. Иммунотоксин представлял собой анти-Ig E антитело, связанное с токсином. Подразумеваемый фармакологический механизм лечения таков, что иммунотоксин, специфичный для изотопа Ig E, будет убивать Ig E-продуцирующие B клетки.

Кратное изложение изобретения.

Это изобретение относится к уникальным антигенным детерминантам на молекулах Ig E и к реагентам и методам лечения Ig E-опосредованной аллергии, основанного на открытии этих детерминант. Антигенные детерминанты присутствуют на Ig E-продуцирующих B-лимфоцитах (B клеток), но не на базофилах и тучных клетках.

Хотя Ig E продуцируется только Ig E-продуцирующими B клетками, он присутствует не только на этих клетках, но также на тучных клетках и базофилах. Ig E имеет очень высокое сродство к Fc∈R на поверхности базофилов и тучных клеток (константа ассоциации, Ka, находится в пределах 10⁹ - 10¹⁰ л моль^-1 ), и скорость диссоциации очень мала (полупериод жизни около 20 ч). Т. о. Ig E фактически является поверхностным антигеном базофилов и тучных клеток.

Антигенные эпитопы Ig E данного изобретения присутствуют на Ig E-продуцирующих B клетках, но не на базофилах или тучных клетках, и из-за этого эпитопы являются уникальными поверхностными маркерами Ig E-продуцирующих B клеток. Эпитопы могут быть обозначены ige bL (bL обозначает B лимфоциты), Ig E на B клетках мембраносвязанная форма, которая заякорена в мембране пронизыванием липидного биослоя мембраны; Ig E на базофилах и тучных клетках - секреторная форма, которая заякорена на поверхности клеток связыванием с молекулами Fc∈R. Общие структуры двух форм Ig E слегка различны тем, что мембраносвязанная форма имеет дополнительный сегмент. Топография связи с поверхностью клетки также различна у Ig E на B клетках и на базофилах. Один класс эпитопов ige bL раcположен в Fc районе молекулы Ig E в или около сайта связывания FcCR. Эти эпитопы маскируются связыванием Fc∈R. Другой класс эпитопов ige. bL антигенные эпитопы, которые заключают части внеклеточного сегмента мембрано-связанного района тяжелых цепей иммуноглобулина ∈. В общем, эти сегменты различных мембраносвязанных иммуноглобулинов могут быть обозначены mb/ec. Сегмент mb/ce Ig E может быть обозначен как сегмент e, mb/ec. Настоящее изобретение относится к определению последовательности сегмента.

Идентификация эпитопов ige bL обеспечивает различные формы лечения и диагностики Ig E-опосредованной аллергии, основанные на агентах, которые специфически связываются с эпитопами. Они включают аллергические болезни, такие как экзогенная бронхиальная астма, аллергический насморк или сенная лихорадка, и аллергии на пищу и лекарства. Предпочтенные агенты, которые специфически связываются с эпитопами, моноклональные антитела или их фрагменты. Однако, для целей терапевтических методов данного изобретения специфический связывающий агент может быть любой молекулой, которая специфически связывается с эпитопами (и т.о. связывает Ig E продуцирующие B клетки, но не базофилы). Эти реагенты включают синтетические пептиды, которые идентичны или аналогичны антигенсвязывающему району (вариабельный гипервариабельных районов) анти- ige bL антител. Хотя описание ниже сфокусировано в основном на анти-ige bL антителах, концепция и методологии в равной степени приложимы к другим молекулам, специфичным к описанным здесь уникальным эпитопам.

Моноклональные антитела, специфичные к эпитопам ige bL, могут быть использованы для избирательного разрушения Ig E-продуцирующих клеток. Поскольку эпитоп присутствует на Ig E-продуцирующих B клетках и отсутствует на тучных клетках или базофилах, моноклональные антитела, специфичные к эпитопу ige bL связывают B клетки, но не тучные клетки или базофилы. Это дифференциальное связывание делает возможным лечение и селективную элиминацию Ig E-продуцирующих B клеток. Антитела в свободной или токсинсвязанной форме могут быть использованы для мечения и уничтожения B клеток. Моноклональные антитела, специфичные к эпитопу ige bL в или около сайта связывания с Ig E, могут иметь дополнительный терапевтический эффект. Антитела связывают Ig E, образуя иммунные комплексы, облегчая удаление Ig E из иммунной системы ретиэндотелиальной системы.

Это изобретение также относится к паротоп-специфическим, антиидиотипическим антителам среди антител, реактивных по отношению к ige bL эпитопам, к пептидам, созданным по образцу эпитопов (например, сайта связывания Fc∈R), и к использованию антиидиотипических антител и пептидов для лечения Ig Е-опосредованных аллергических болезней.

На фиг. 1 приведен процесс определения mb/ec сегмента Ig E человека (∈ mb/ec); на фиг.2 пробы ДНК, используемые для скрининга библиотеки к ДНК на клоны, содержащие e mb/es; на фиг.3 C-конец CH₄ домена E-цепи человека и расположение проб b и d.

1. Уникальные эпитопы иммуноглобулина E.

Это изобретение основано на открытии уникально расположенных эпитопов Ig E (ige bL). Эпитопы присутствуют на Ig E-продуцирующих B лимфоцитах, но не на тучных клетках и базофилах. Один класс эпитопов ige. bl расположен в или около сайта связывания Fc∈R. Присутствие этих эпитопов только на IgE-продуцирующих B клетках следствие того факта, что эпитоп маскирован, когда IgE связан с Fc∈R на базофилах и тучных клетках. Эпитопы ige.bl, возможно, могут состоять из нескольких антигенно дискретных сайтов и каждый из них может быть определен по его реактивности с моноклональным антителом, которое реагирует с IgE-продуцирующими B клетками человека, но не базофилами, такими как E8-5-3, E11-4-70, E101-1 и E10-12-55 (см. ниже).

Другой класс эпитопов ige.bL-эпитопы ∈ mb/ec.

Эти эпитопы присутствуют на мембраносвязанной форме иммуноглобулина, но не на секретированной форме. В клетки экспрессируют на своей поверхности молекулы антител, таких как IgE, которые служат рецепторами, для антигенов в течение иммунологической индукции. Мембраносвязанные иммуноглобулины отличаются от секреторных растворимых иммуноглобулинов, синтезированных теми же клетками, тем, что они имеют дополнительный пептидный кусок, который заякоривает их на поверхности B клеток. Все 10 мембраносвязанных на B клетках иммуноглобулинов из различных видов, для которых была определена аминокислотная последовательность, имели дополнительные изотип-специфические районы, которые заякоривают иммуноглобулины на мембране. Эти пептидные районы имеют длину в пределах 41-72 аминокислоты и могут быть разделены на три сегмента в отношении расположения относительно плазматической мембраны. Средние сегменты из 25 гидрофобных и незаряженных аминокислотных остатков расположены в липидном бислое мембраны; C-концевые гидрофильные сегменты из 3-28 аминокислотных остатков внутриклеточные; сегменты в направлении к N-концу содержат 13-27 аминокислотных остатков, сильно кислотны и гидрофильны и находятся на внеклеточной поверхности плазматической мембраны. Эта часть мембраносвязанного района IgE мыши и крысы содержат 19 аминокислотных остатков, из которых 10 -остатки Глу или Асп. Длина, гидрофильность и сильная заряженность внеклеточного сегмента указывает, что этот сегмент экспонирован и доступен антителам.

Поскольку IgE присутствует на поверхности лишь трех типов клеток тела, IgE-продуцирующих B клеток, базофилов, а также тучных клеток, эпитопы ige.bL являются фактически уникальными маркерами клеточной поверхности IgE-продуцирующих B клеток. Эти новые маркеры обеспечивают несколько типов основанной на моноклональных антителах терапии IgE-опосредованных аллергических болезней.

2. Моноклональные антитела, которые связывают IgE-продуцирующие B клетки, но не базофилы.

Моноклональные антитела, специфичные к эпитопам ige.bL, связывают IgE на поверхности IgE-продуцирующих B клеток, но не связывают базофилы. Это дифференциальное связывание IgE-продуцирующих клеточных типов обеспечивает основу терапевтических и диагностических применений антител.

Важно, что антитела не связывают базофилы и не индуцируют высвобождение гистамина. Один из наиболее мощных агентов, "включающих" высвобождение фармакологических медиаторов аллергии из тучных клеток и базофилов, анти IgE антитело. Общепринятые анти-IgE антитела связывают IgE на поверхности тучных клеток и базофилов и вызывают высвобождение фармакологических медиаторов аллергии. Антитела настоящего изобретения не могут связывать IgE на этих клетках, поскольку сродственный эпитоп маскирован и, т.о. они не могут индуцировать высвобождение гистамина из этих клеток.

3. Терапия IgE-опосредованной аллергии, основанная на селективном уничтожении IgE-продуцирующих клеток.

А. Антитела, специфичные к IgE-продуцирующим клеткам.

Антитела, специфичные к IgE-продуцирующим B клеткам, как мышиные, человеческие или мышь/человек химерные антитела, могут быть применены различными способами для лечения IgE-опосредованных аллергий. Для этой цели антитела могут быть использованы для селективного истощения IgE-продуцирующих B клеток. Антитела могут быть использованы как эффекторные агенты, опосредующие иммунную фракцию, или как несущие агенты для токсинов или цитотоксических лекарств, как изложено ниже, для доставки эффекторного вещества.

Среди различных иммунных функций, которые может опосредовать антитело, специфичное к поверхностному антигену на клетки-мишени, находится антитело и комплемент опосредованный цитолиз и антитело зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). Антитело может также опосредовать иммунные регуляторные функции. Антитела некоторых субклассов IgG, такие как IgG2 мыши и IgG1 и IgG3 человека, могут опосредовать ADCC, осуществляемую некоторыми FC рецептор-продуцирующими фагоцитирующими лейкоцитами. Например, ОКТЗ, моноклональное антитело мыши, специфичное к поверхностному антигену T-клеток человека (первое моноклональное антитело, санкционированное FDA для продажи в качестве терапевтического агента), применялось к пациентам для получения быстрого истощения T-клеток в крови и индукции иммуносупрессированного состояния (для трансплантации почки). Russell, P.S.Ctal. Annu. Rev. Med. 35:63-79 (1984); Normau, D.Y. Ctal. Trauspl. Proc. 17:39-41 (1985). ОКТЗ в дозах 5 мг/день/субъект может полностью истощить циркулирующие T-клетки. Антитела настоящего изобретения, в особенности в виде гамма 2а антител мыши или химерных антител, несущих гамма-1 или гамма-3 цепи человека, могут быть использованы для истощения IgE-продуцирующих B клеток по механизму ADCC. Антитела могут применяться в виде свободных антител пациентами, пораженными IgE-опосредованной аллергией в количествах, достаточных для существенного элиминирования IgE-продуцирующих клеток и, следовательно, для существенного истощения IgE. Например, количество может варьировать от 1 до 50 мг/доза/-субъект. Лечение может включать одну или несколько инъекций. Длительность присутствия антитела и количество антитела, необходимого для уничтожения B клеток, меньше того, которое необходимо для длительного подавления связывания IgE с базофилами и тучными клетками.

Для описанных терапевтических применений наиболее предпочтительны человеческие антитела. Антитела человека, однако, трудно производить в больших количествах. В качестве альтернативы предпочтительны химерные или "околочеловеческие" антитела. Химерные антитела представляют собой вариабельный или антиген связывающий (гипервариабельный) или определяющий комплементарность/район, полученный из животного (например, мышиного) антитела, и остальных районов, полученных из антитела человека. Способы получения химерного (например, мышь/человек) антитела описаны ниже. Химерные антитела могут быть получены в больших количествах и они менее иммуногенны для людей, чем нечеловеческие антитела. Следовательно, они более удобны для применения in vivo, чем антитела животных, особенно когда необходимо повторное или длительное применение. Также могут быть использованы фрагменты химерных антител.

Иммунотерапии, использующие антитела данного изобретения, могут быть использованы в комбинации с общепринятой иммунотерапией снижения чувствительности. Например, снижение чувствительности при помощи аллергена может быть проведено в сочетании с применением анти-ige.bl антител или иммунотоксинов (см. раздел B ниже) для существенного уничтожения IgE-образующих клеток. Один важный эффект понижения чувствительности состоит в том, что против аллергена/иммуногена индуцируются IgG. Индукция ответа IgG может быть более эффективна, когда IgE-образующие клетки существенно истощены. Комбинация терапии антителами и снижением чувствительности привлекательная форма терапии.

IgE-продицирующие B клетки могут быть временно истощены (на несколько недель или месяцев) анти-ige.bL антителами и в конечном счете их популяция восстановится. Понижение чувствительности может иметь более длительное действие.

B. Иммунотерапия, объединяющая ige.bL специфические антитела и фактор, усиливающий ADCC.

Много факторов, таких как GM-CSF /фактор, стимулирующий колонии гранулоцитных моноцитов /или M CSF/ фактор, стимулирующий колонии моноцитов, как известно, индуцирует пролиферацию лейкоцитов, включая те, которые опосредуют ADCC. В экспериментах in vitro было показано, что GM-CSF и M-CSF увеличивают активность ADCC на опухолевых клетках, опосредованную моноклональными атителами, специфичными к поверхностным антигенам, экспрессированным на поверхности опухолевых клеток. Возможно, терапевтический эффект ige.bL специфических моноклональных антител в лечении аллергий может быть усилен комбинацией с использованием факторов, которые увеличивают активности C. Иммунотоксины, специфичные к Ig E продуцирующим клеткам.

Эпитопы ige.bL обеспечивают высокоспецифичные мишени иммунотоксинов, направленных против Ig E-образующих B клеток. Иммунотоксины, специфичные к эпитопам, связываются с Ig E-продуцирующими B клетками, но не с тучными клетками или базофилами. Таким образом, Ig E-продуцирующие B клетки могут быть избирательно истощены или уничтожены у пациента, страдающего от IgE-опосредованной аллергии. Снижение числа IgE-продуцирующих клеток снижает уровни IgE в циркуляции, что приводит к уменьшению количества IgE, могущего связаться с тучными клетками и базофилами. Иммунотоксины не убивают тучные клетки или базофилы и не вызывают высвобождения фармакологических медиатов из этих клеток.

Иммунотоксины для избирательного связывания с IgE-продуцирующими лимфоцитами состоят из цитолитических или цитотоксических агентов, соединенных со связывающимся агентом, специфичным к ige-bL эпитопу. Предпочтительные специфически связывающиеся агенты анти ige.bL антитела или их фрагменты (например, , Fab, Fv или их аналоги или производные). Цитолитические агенты могут быть выбраны среди любых из доступных веществ, включая рипин, токсин Pseudomonas дифтерийный токсин, антивирусный пептид лаконоса, трихотецены, радиоактивные нуклиды и мембранолитические ферменты. Антитело и цитотоксин могут быть связаны химическими или генноинженерными методами.

Иммунотоксины применяются к пациенту, страдающему IgE-опосредованной аллергией, в количествах, достаточных для уменьшения количества или уничтожения IgE-образующих лимфоцитов у пациента и т.о. предотвращения или смягчения симптомов IgE-опосредованной аллергии. Иммунотоксины могут быть использованы сами по себе или в комбинации со свободными анти IgE антителами.

4. Удаление IgE моноклональными антителами, которые не связывают IgE на базофилах и тучных клетках.

В конкретных воплощениях анти IgE антитела данного изобретения связываются с эпитопом Ige.bL, расположенным в или около сайта связывания Fc∈R на растворимом IgE. При этом антитела блокируют для тучных клеток и базофилов сайт связывания на IgE и это вносит частичный вклад в их терапевтическую эффективность. Для достижение этого возможно выигрышного дополнительного терапевтического механизма антитела должны специфически связываться с эпитопом со средством, которое больше, чем средство связывания Fc∈R и IgE. Эта комбинация специфичности и сродства обеспечивает эффективное подавление связывания IgE с Fc∈R при фармацевтически возможной концентрации. Кроме того, иммунные комплексы IgE и моноклональных антител могут быть быстро удалены клетками ретикулоэндотелиальной системы. После внутренней инъекции моноклональных антител большинство молекул IgE в циркуляции возможно образуют иммунные комплексы и быстро удаляются. Эти механизмы снижают уровни свободного IgE в теле обработанного пациента, когда терапевтические моноклональные антитела присутствуют в достаточных количествах. Эти различные механизмы вносят вклад в краткосрочные эффекты терапевтических тел. Однако, терапевтические эффекты длительного действия, возможно, могут быть достигнуты без этих механизмов. Поскольку IgE быстро выводится и регенерирует, имея время полужизни в сыворотке три дня, основанная на ige.bL антителах терапия возможно более эффективна путем уменьшения количества или истощения IgE-продуцирующих B клеток.

Сродство может быть представлено константной сродства или ассоциации. Ka Fc∈R на тучных клетках и базофилах имеет Ka по оценкам в пределах от 1•10⁹ 1•10¹⁰ л/моль. См. Kulcsycki, A, New Treucls in Allergy IIed by Ring, I and Burd, G, pp. 25 32, Spring-verlag, New-York 1986.

Т. о. моноклональное анти-IgE антитело будет эффективно конкурировать с Fc∈R, если его константа сродства и IgE порядка 1•10⁹ л/моль или более. В общем, моноклональные антитела имеют Ka ниже 10⁹ л/моль. Следовательно, хотя антитело может быть достаточно специфично к описанному эпитопу-(ам) и удобно для уничтожения IgE-несущих B клеток прописанному выше механизму, оно не может иметь этот дополнительный терапевтический эффект, если оно не имеет Ka достаточной для эффективной конкуренции с Fc∈R за IgE при фармакологически допустимых концентрациях.

В предпочтительных воплощениях моноклональные анти Ig-E антитела данного изобретения имеют Ka к Ig E, которая сравнима или больше, чем сродство Fc∈R и IgE.

Тучные клетки и базофилы в теле связаны с IgE; у большинства индивидуумов большая часть Fc∈R насыщена IgE. Молекулы IgE имеют очень длинное время полужизни "на" (занимание рецептора) порядка 20 ч.

Kulcsvcki, A, Exp.Med. 140:1976 (1974). Когда молекулы Ig E диссоциируют с тучными клетками или базофилами, высокое сродство анти-ige.bL антител, примененных к пациенту, тесно связывает их и предотвращает их реассоциацию с Fc∈R. Поскольку молекулы Ig E имеют большое время "на" и медленно диссоциируют от базофилов и тучных клеток, терапевтический эффект, возможно, будет достигнут лишь несколькими днями позже обработки (или даже более), когда существенная часть IgE на базофилах и тучных клетках уже диссоциирует от Fc∈R и образует комплексы или будет убрана анти-Ig E антителом. Когда это достигнуто, плотность молекул Ig E, связанных с Fc∈R молекулами на базофилах и тучных клетках, существенно понижена и, следовательно, аллергены не способны перекрестно сшивать существенные количества Fc∈R для индукции гистамина.

5. Диагностические использования антител, специфически связывающих Ig E-продуцирующие клетки.

Антитела против эпитопов ige.bL могут быть использованы для идентификации и оценки числа Ig E-образующих лимфоцитов в смешанных популяциях лейкоцитов. Для этой цели антитела могут быть использованы в стандартных анализах для определения антигенов клеточной поверхности. В общем, антитело контактирует с образцом тестируемых лейкоцитов при условиях, позволяющих антителу связывать Ig E-образующие клетки в образце. Клетки затем проверяют на связывание антител. Это может быть осуществлено применением общепринятых процедур окрашивания клеток. Например, флуоресцентномеченое вторичное антитело может быть использовано для детектирования связывания анти-IgE антитела.

6. Антиидиотипические антитела и способы активной иммунизации против Ig E.

ige.bL специфические моноклональные антитела, описанные здесь далее, могут быть использованы для образования паротоп-специфических, анти-идиотипических антител, которые делают возможным иной образ лечения Ig E-опосредованной аллергии. Антитела против паротопа ige.bL специфических антител конформационно напоминают эпитоп, которому специфично анти- Ig E антитело, т.е. они напоминают ige.bL эпитоп. Эти антиидиотопические антитела могут быть использованы для активной иммунизации против ige.bL и индукции эндогенного образования антител против ige.bL этитопа. Индуцирование антитела опосредуют различные терапевтические эффекты ige.bL специфических антител.

Поскольку Ig E "своя молекула", он в общем не иммуногенен. Однако, активная иммунизация против Ig E может быть достигнута при использовании паротоп-специфичных антител данного изобретения. Паротоп-специфичное антитело демонстрирует сходство с антигеном-эпитопом ige.bL -что может вызывать иммунный ответ у людей против эпитопа.

Паротоп-специфические антиидиотипические антитела применяются к пациенту, страдающему от Ig E-опосредованной аллергии в иммуногенном количестве для индукции образования антител к ige.bL. Антиидиотипические антитела предпочтительно применяются в виде химерных антител. Они могут быть также применены как фрагменты антител (которые также могут быть химерными по природе) или аналогов.

7. Пептиды, блокирующие Fc∈R на тучных клетках и базофилах.

Это изобретение также обеспечивает пептиды, воплощающие эпитопы ige.bL на растворимом Ig E. Эти пептиды представляют собой аминокислотные последовательности, которые идентичны или эквивалентны аминокислотной последовательности эпитопа ige. bL на растворимом Ig E. Например, пептиды могут иметь последовательности, соответствующие этитопам, определяемым антителами Е8-5-3, Е11-4-70, Е101-1 и Е-10-12-55 или другими анти- ige.bL антителами, описанными ниже. Пептиды, соотносящиеся с сайтом связывания Fc∈R, могут быть использованы для блокирования связывания Ig E с тучными клетками и базофилами.

8. Пептидные аналоги ∈ mb/ec и активная иммунизация против e mb/ec эпитопа.

Несмотря на то, что человеческий пептид e mb/ec возможно не иммуногенен для людей, пептид в той же последовательности и аминокислотными заменами может быть иммуногенен и индуцировать антитела, которые перекрестно реагируют с аутентичным эпитопом e mb/ec. Эти аналоги пептида e mb/ec могут быть применены к пациентам, страдающим Ig E-опосредованными аллергиями. Антитела, индуцированные этой активной иммунизацией, могут функционировать как антитела, описанные здесь.

9. Заякоривающийся пептидный кусок иммуноглобулинов, связанных с мембраной В клеток.

В клетках экспрессируют на своей поверхности молекулы антител, служащие рецепторами антигенов при иммунологической индукции. Мембраносвязанные иммуноглобулины отличаются от секреторных иммуноглобулинов, синтезированных теми же клетками, тем, что они имеют дополнительные пептидные участки, которые заякоривают молекулы иммуноглобулинов на клеточной поверхности.

Были получены данные об аминокислотной последовательности 10 мембраносвязанных иммуноглобулинов из различных видов. См. Ishida, N. et al. EMBO J. 1:1117 (1982); Steen, M. L. et aL. J. MoL, BioL. 177:19-32(1984); Rogers, J. et. aL. CeLL, 26:19-27(1981); Yamawaki-katacka, J.et aL. Proc. Natl. Acad. Sci, MSA, 79:2008-2012(1982); Kamarohcy, M.et al. Nuc.beids Res, 11:6775-6785(1983)+ Rogers, g.et aL. Cell, 20:303-319(1980); Bernstein, K.E.J. Emmunol, 132:490-495(1984); Cheng, M.et aL, Nature, 296:410-415(1982). Эти последовательности обозначают конкретные общие черты пептидного участка, связанного с плазматической мембраной. Как показано в табл.1, пептидный якорный участок имеет 3 сегмента, различимых, основываясь на их расположении относительно плазматической мембраны. Несмотря на то, что эти пептидные участки короткие, в пределах от 41 до 72 аминокислотных остатка, и на них часто ссылаются как на мембраносвязанный домен, пептиды не находятся полностью в липидной бислое мембраны. Фактически лишь 25 аминокислотных остатков, в основном гидрофобных остатков и остатков серина и треонина, расположенных в средней части пептидов, находятся в липидном бислое. С-концевые гидрофильные сегменты из 3-28 аминокислотных остатков расположены на цитоплазматической стороне мембраны. Сегменты ближе к N-концу, которые соединены с3-м или 4-м константными доменами тяжелых цепей иммуноглобулина (CH₃ или CH₄), весьма гидрофильны и находятся на внеклеточной стороне плазматической мембраны.

Наименьшая длина внеклеточного сегмента мембраносвязанных участков иммуноглобулинов (обозначенных mb/ec сегментов) 13 аминокислотных остатков (μ цепи мыши и кролика). См. табл. 2. Сегменты mb/ec всех иммуноглобулинов содержат высокую долю заряженных аминокислотных остатков, практически целиком кислотных остатков. Процентное содержание заряженных аминокислотных остатков и полярных гидрофильных остатков, очень высок для аминокислотного состава mb/ec сегмента (табл.3). Эти параметры указывают, что все mb/ec сегменты экспонированы и достаточно длинны для того, чтобы быть доступными антителами. Изучение эволюции тяжелых цепей иммуноглобулинов показывает, что G и g цепи ближе друг к другу (имеют более позднего общего предшественника), чем к другим цепям (Zin, L.C. and Putnam, F.W. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1981). Кроме того, тяжелые цепи эволюционировали раньше, чем эволюционировали различные виды млекопитающих, мыши, крысы и люди. Т.о. среди 10 различных сегментов mb/ec, которые были определены, скорее всего именно мышиный или крысиный ∈ mb/ec наиболее близок к человеческому e mb/ec, последовательность которого пока не сообщалась. Следующее наиболее родственное γ цепи. Мышиный или крысиный ∈ mb/ec имеет 19 аминокислотных остатков, среди них 8 остатков глутамина и 2 аспарагина. Эти данные также дают уверенность, что сегмент e mb/ec человека экспонирован и доступен антителам.

10. Определение аминокислотной последовательности сегмента mb/ec Ig E человека (e mb/ec сегмента).

Ряд хорошо обоснованных процедур может быть применен для определения последовательности ДНК, соответствующей e mb/ec сегменту человека. При одном подходе (фиг.1) исходная точка получение мРНК линии клеток миеломы человека, экспрессирующей Ig E на поверхности. Для этой цели могут быть использованы клетки SK007. Имея препарат мРНК, можно создать библиотеку кДНК, используя вектор клонирования на основе фага или плазмид. Предпочтительный метод конструирования библиотеки кДНК с применением набора Системы Конструирования Библиотеки кДНК Kit Zibrarian I, разработанного и продаваемого Invitrogen (San Diego, C.A.). Обеспечивается постадийное детальное руководство для выделения РНК из клеток, обратной транскрипции, синтеза второй цепи, лигирования линкера, фракционирования кДНК в агарозном геле, электроэлюции для очистки кДНК, лигирования вектора и трансформации в E. coli. Вектор, использованный в данной библиотеке, p CDM 8.

Несколько проб может быть использовано при скрининге библиотеки кДНК на клоны, содержащие e mb/ec сегмент. Как показано на фиг.2, библиотека может быть скринирована ДНКовой пробой, которая имеет длину 1,1 т.п.н. и является кДНК U 266, покрывающей большую часть длины мРНК ∈ (не мембраносвязанный сегмент). Позитивные клоны, включающие как секретированную, так и мембраносвязанную формы, могут быть различны путем использования дополнительных проб.

Проба "b" получена принятием весьма вероятной возможности, что конец домена CH₄ прерван в e цепи человека в мембраносвязанной форме. Прерывание происходит, когда перемещаются генные сегменты домена CH₄ мембраносвязанного домена. Потеря C-концов происходит с мембраносвязанными формами иммуноглобулинов, включая e и μ, содержащих CH₄ домены. Из опубликованной информации о нуклеотидной последовательности домена ∈ CH₄ человека следует, что наиболее вероятный донорный сайт сплайсинга - внутрикодоновой GT, 71 п.н. и 5'-концу от терминирующего кодона TGA'. Другой GT, не являющийся внутрикодоновым и менее вероятно являющийся донорным сайтом сплайсинга, ближе к концу (24 п.н. к 5'-концу от терминирующего кодона).

Специфическое расположение пробы "b" указано на фиг.2 и 3. Проба должна реагировать с секретированной формой гена e цепи и не реагировать с мембранной формой гена цепи.

Создание пробы "c" основано на обнаружении того, что трансмембранный сегмент мембраносвязанного домена (mb/tm сегмент) весьма консервативен среди всех секвенированных генов иммуноглобулина. Существует сегмент пептида и соответствующая ему кодирующая ДНК в пределах этого сегмента mb/tm, которые практически идентичны среди всех иммуноглобулинов. Как показано в табл.4, консенсусная последовательность ДНК с восемью комбинациями используется как проба "c". Фиг.2 демонстрирует расположение пробы.

Проба "d", представляющая собой сегмент, расположенный по ходу транскрипции относительно наиболее вероятного донорного сайта сплайсинга, GT состоит из 36 п.н. (фиг.2 и 3). Эта проба должна реагировать с геном e цепи, как секретированной так и мембраносвязанной форм.

Табл. 5 суммирует образцы реактивностей клонов, содержащих e генов секретированной или мембраносвязанной форм с 4 пробами.

Размер библиотеки, необходимой для клонирования мембраносвязанной e цепи, зависит от того, насколько обильна мРНК. Если предположить, что секретированный Ig E составляет 0,1% поли (A)⁺ PHK sK007, то размер библиотеки должен быть около 5000 независимых рекомбинантных клонов для выделения позитивного клона с 99% вероятностью. В Ig E-продуцирующих клетках иммуноцитомы крысы IR 2 и IR 162 мРНК мембраносвязанной формы e цепи, как было обнаружено, составляет более 2% таковой секретированной формы. Если предположить, что это соотношение мембраносвязанной и секретированной форм e цепей остается верным для IgE-образующих клеток человека SKOO7, то размер библиотеки кДНК, необходимой для выделения мембраносвязанной e цепи, составляет около 250000. В предпочтенной процедуре большое количество клонов подвергалось скренингу, а именно 1000000.

Альтернатива общепринятому подходу создания библиотеки кДНК и скренинга клонов, представляющих типы кРНК клетки, амплификация мРНК для получения высокой доли соответствующей им ДНК. Образовавшаяся ДНК затем может быть очищена гельэлектрофорезом и подвергнута секвенированию. Методология, на которую ссылаются как на амплификацию посредством полимеразной цепной реакции (PCR), устанавливалась в последние несколько лет, и были коммерциализированы полные системы, включая реагенты и оборудование. Одна предпочтительная система поставляется PerRiu Elmer Cetus (NorwalR, CT). Набор реагентов Gene Anp DNA Amplification Reagent Kit и оборудования DNA Thermal Cycler.

Некоторые из специфических реагентов, использованных в этом подходе, те же, что используются для клонирования библиотеки кДНК. Поскольку никакой последовательности в мембраносвязанном сегменте e цепи не было определено, стратегия заключается в амплификации как секретированной, так и мембраносвязанной форм e цепей. Используются два праймера, один из которых олиго dT (25-30-меры) и другой олигомер, соответствующий пробе d на фиг.2 и 3. Проба d расположена ближе к 5-концу от наиболее возможного донорного сайта сплайсинга, и т.о. праймирует как секретированную, так и мембраносвязанную форму e сРНК и ДНК. После существенной амплификации две популяции фрагментов ДНК разрешаются гель-электрофорезом. Секретированная форма e цепи может быть узнана по ее реактивности с пробой "b". Очищенные ДНК подвергаются затем ДНК-секвенированию.

Амплификация PCR представляется более эффективной процедурой, чем клонирование кДНК, для мРНК, бедно представленных в наборе поли (А)⁺-РНК. кДНК цепи U 266 может быть использована для выработки неких предварительных условий отжига между матричной ДНК и олигопраймерами.

Другой подход к получению клона ДНК, содержащего гены, кодирующие мембраносвязанные сегменты, скренинг геномной библиотеки ДНК человека. Геномная библиотека ДНК человека легко доступна. Предпочтительный источник - библиотека, сконструированная с использованием клеток фибробластов легкого W 138, поставляемая Stratogene (za jolla, CA). Гены заключены в вектор и ДНК вставки имеет средний размер 15 т. п.н. Идентификация клонов может быть достигнута гибридизацией с ДНК клона кДНК U 266. Расположение сегмента гена, соответствующего мембраносвязанному району, может быть определено с использованием пробы, полученной из гомологичного мышиного гена трансмембранного сегмента (пробе с на фиг.2 и в табл.4). Затем определяется последовательность мембраносвязанного сегмента.

10 А. Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей мембранный заякоривающийся пептид e цепи человека.

Нуклеотидная последовательность геномной ДНК, заключающей сегменты заякоривающегося в мембране пептида мембраносвязанной e цепи человека, была определена и показана ниже с выведенной аминокислотной последовательностью части заякоривающегося в мембране пептида. Распределение экзонов было сделано путем идентификации нуклеотидов доноров и акцепторов сплайсинга и путем сравнения с опубликованными гомологичными последовательностями мембраносвязанной цепи мыши и иммуноглобулинов других классов.

Пептид e mb/ec человека определен как первые 14 аминокислот, кодированных мембранным экзоном 1. Он предшествует блоку из около 25 гидрофобных аминокислот, являющихся трансмембранным районом.

Две возможные структуры ∈ mb/ec показаны ниже.

Возможные структуры e mb/ec пептида человека.

Как полнее описано ниже, ∈ mb/ec пептид может быть использован для индуцирования антител, специфически реагирующих с мембраносвязанным иммуноглобулином E. Для этой цели пептиды могут быть химически синтезированы с применением обычных методов белкового синтеза. Предпочтенный метод синтезирования пептидов с использованием системы Ramp (Dupont, Wilm; ngton, DE), которая использует Fmoc химию. С другой стороны, белки могут быть биосинтезированы с применением олигонуклеотидов, колирующих пептид. Нуклеотидная последовательность дана выше в виде 5'-части мембранного экзона 1.

В качестве иммуногенов белки могут быть использованы как в мономерной, так и в димерной структурных формах, показанной выше. Также могут быть использованы пептиды, представляющие собой e mb/ec сегмент человека и прилежащие 4 аминокислоты в домене CH₄. Кроме того, могут быть использованы модифицированные пептиды, имеющие существенное иммунологическое сходство. Например, аминокислотная последовательность пептида, показанная выше, может быть модифицирована делецией, инсерцией или замещением одной или более аминокислот, которая не искажает существенно иммунологические свойства пептида. Пептиды также могут быть использованы в виде полимеров, где показанная выше аминокислотная последовательность или эквивалентная последовательность является повторяющейся единицей полимера.

11. Выработка моноклональных антител настоящего изобретения.

Моноклональные анти-Ig E и антиидиотипические антитела настоящего изобретения вырабатываются постоянными (иммортализованными), стабильными, производящими антитела линиями клеток. Предпочтительные линии клеток, продуцирующие антитела линии клеток гибридомы и линии клеток миеломы. В принципе, однако, линии клеток могут быть любыми клетками, содержащими и способными экспрессировать функционально перестроенные гены, кодирующие вариабельные районы антител легких и тяжелых цепей антител. Предпочтительно линия клеток должна иметь способность сборки цепей в функциональные антитела или фрагменты антител. Т. о. наиболее часто используются лимфоидные клетки, природно продуцирующие иммуноглобулин. В дополнение к отмеченному ранее, примерами удобных лимфоидных клеток являются вирусно или онкогенно трансформированные лимфоидные клетки.

Гибридомные клетки, продуцирующие ige bl специфичные антитела настоящего изобретения, могут быть получены с использованием стандартной методики соматической гибридизации клеток Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975) или сходной процедуры, применяющей отличные агенты для слияния. Коротко, процедура состоит в следующем: моноклональные анти IgE антитела вырабатываются иммунизацией животного человеческим IgE, или пептидным сегментами человеческого IgE/секреторного или мембраносвязанного, которые идентифицированы как возможные компоненты эпитопа ige.bl. Пептиды могут быть синтезированы и конъюгированы с белком носителем, таким как гемоцианин моллюска (Reyhole) для использования в качестве иммуногена. Затем лимфоидные клетки (например, лимфоциты селезенки) получают из иммунизированных животных и сливают с иммортализованными клетками (например, миеломы или гетеромиеломы) для получения гибридных клеток. Гибридные клетки затем скринируют для выявления тех, которые продуцируют желаемое анти IgE антитело.

Гибридомы человека, секретирующие человеческое антитело, могут быть получены с использованием методики Kohler and Milstein. Хотя человеческие антитела особенно предпочтены для лечения людей, в общем получение стабильных человек-человеческих гибридом для длительной выработки человеческого моноклонального антитела может быть трудным. Получение гибридомы на грызунах, особенно мыши, очень хорошо устоявшаяся процедура. Стабильные мышиные гибридомы обеспечивают неограниченный источник антитела, обладающего заданными характеристиками. Мышиные антитела, однако, могут иметь ограниченное применение в лечении людей, поскольку они сильно иммуногенны и сами могут вызвать всплеск аллергических реакций у реципиента. В предпочтительном воплощении данного изобретения анти IgE и антиидиотипические антитела производятся в системе, относящейся к грызунам, и превращаются в химерные грызун/человек антитела с использованием методик, описанных детально ниже. Как объяснено выше, эти "околочеловеческие", химерные антитела предпочтительны для применения in vivo, особенно в том случае, когда требуются множественные дозы.

Для получения антител, специфичных к ige.bl эпитопам на растворимом IgE, человеческий IgE для иммунизации может быть очищен из человеческой сыворотки. С другой стороны, человеческий IgE может быть произведен культивированием IgE продуцирующей линии клеток (например, линии клеток U266, АТСС номер CRL 8033). Человеческий IgE может быть очищен аффинной хроматографией. Мышиные моноклональные антитела, специфичные для человеческого IgE, конъюгируют с подходящей матрицей (такой как броциан-активированная Sepharose 4B) для получения IgE-специфичного иммуноадсорбента. Препарат IgE может быть приведен в контакт с иммуноадсорбентом, избирательно адсорбирующим IgE. Адсорбированный IgE может быть элюирован в существенно чистом виде с иммуноадсорбента.

В предпочтенных воплощениях животные были иммунизированы с использованием протокола мощной иммунизации в целях получения высокой частоты лимфоцитов, образующих IgE-специфичные антитела. Клетки селезенки получали из иммунизированного животного и сливали с иммортализованными клетками, предпочтительно клетка и миеломы, которые потеряли способность секретизировать иммуноглобулин. Известно много удобных линий клеток миеломы. Примером является мышиная миелома NS-1. Слияние клеток селезенки и партнера по слиянию может быть произведено в присутствии полиэтиленгликоля в согласии с установившимися методами. Также могут быть использованы методики электрослияния. Образовавшиеся гибридные клетки клонально культивировали и затем скринировали на выработку анти IgE антитела.

Гибридомы, образующие антитела, специфичные к эпитопу, присутствующему на IgE-образующих B клетках и отсутствующему на базофилах и имеющие сродство к IgE, достаточное для блокирования связывания FceR с IgE, могут быть отобраны следующим образом. Гибридомы сначала скринируют на выработку антитела, реактивного с человеческим IgE. Это может быть сделано с использованием связанного с ферментом иммуносорбентного анализа (EL±SA), использующего очищенный человеческий IgE, сорбированный на твердой фазе.

Один путь получения в общем высокоафиинных антител заключается в следующем. Твердая фаза для ELISA покрывается очень малым количеством человеческого IgE. Например, если в качестве твердой фазы используется стандартная плата с микроячейками, на каждую ячейку используется около 50 мкл 0,1 мкг/мл раствора IgE. Отбираются гибридомы, демонстрирующие сравнительно высокую активность фермента (уровень оптической плотности) в анализе. Супернатанты культур содержат либо относительно большие количества антител, либо антитела с относительно более высоким сродством, либо и то и то.

Гибридомы затем скринируют на векрецию антител, не реагирующих с базофил-связанным IgE. Предпочтенный способ скринировать антитела на неспособность индуцировать высвобождение гистамина базофилами. Источник базофилов для такого анализа на высвобождение гистамина лейкоциты крови доноров, чьи безофилы, как известно, очень чувствительны к индукции высвобождения гистамина. Альтернативный и возможно менее чувствительный способ метод иммунофлюоресцентного окрашивания. Базофильные лейкоциты могут быть выделены из крови. Свежевыделенные базофилы имеют на своей поверхности IgE. Моноклональные антитела, которые не связывают базофилсвязанный IgE, специфичны к эпитопу, расположенному в или около сайта, занятого базофильным FceR (и т.о. не доступен для моноклональных антител).

Гибридомы, образующие паротоп-специфичные антиидиотипические антитела, могут быть получены иммунизацией животного анти IgE антителом и скринированием на антитела, которые связывают паротоп-анти IgE антитело, использованного для иммунизации. Иммунизация проводит к выработке антител против антигенных детерминант анти IgE антитела, включая идиотип. Антиидиотинические антитела сначала скринируют на их связывание с анти IgE антителом, но не с другими мышиными антителами. Те, которые являются паратоп-специфичными, скринируются на основании способности антитела конкурировать с человеческими IgE за связывание с анти IgE моноклональным антителом, использованным для иммунизации.

Фрагменты антител, такие как F (ab')₂, Fab and Fv, могут быть получены стандартными методами ферментативного расщепления. Кроме того, синтетические пептиды, представляющие аналоги Fab и Fv, могут быть получены методами генной инженерии. См. например, Better, M. et. al. (1988) Science, 240:1041; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

Химерные анти IgE антитела состоят из индивидуальных химерных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Химерная тяжелая цепь это полипептид из двух смежных цепей, имеющий вариабельный район или гипервариабельные районы грызуна (обычно мыши) и константный район тяжелой цепи человека.

Химерные антитела могут быть моновалентны, дивалентны или поливалентны. Моновалентные антитела димеры (HL), образованные из химерной тяжелой цепи, связанной (через дисульфидные мостики) с химерной легкой цепью. Дивалентные иммуноглобулины-тетрамеры (H₂L₂), образованные из двух ассоциированных димеров. Поливалентные антитела могут быть получены, например, с использованием агрегирующего константного района тяжелой цепи (например, константные районы типа mu).

Вариабельные районы химерных антител происходят из анти Ig E антитела настоящего изобретения. Константный район тяжелой цепи может быть выбран из любого из 5 изотопов альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. Могут быть использованы тяжелые цепи различных субклассов (таких как субклассы IgG). Различные классы и субклассы тяжелых цепей ответственны за различные эффекторные функции и т.о. химерные антитела с желаемой эффекторной функцией могут быть получены выбором желаемого константного района тяжелой цепи. Константный район легкой цепи может быть цепью каппа или лямбда.

В общем/ химерные антитела вырабатываются путем получения конструкции ДНК, кодирующей каждый из компонентов легкой и тяжелой цепей химерного антитела. Конструкция представляет собой слитый ген, включающий первый сегмент ДНК, который кодирует по крайней мере функциональную часть мышиного вариабельного района (например, функционально перестроенные вариабельные районы со связывающим сегментом), связанный со вторым сегментом ДНК, кодирующим по крайней мере часть человеческого константного района. Каждый слитый ген встраивается или вставляется в вектор экспрессии. Затем реципиентные клетки, способные к экспрессии продуктов гена, трансфецируются генами. Трансфецированные реципиентные клети культивируют и выделяют экспрессированные антитела.

Гены, кодирующие вариабельный район легкой и тяжелой цепей грызуна, могут быть получены из гибридомных клеток, вырабатывающих анти Ig E антитела. Например, машиные гибридомные линии клеток, образующие мышиные анти Ig E антитела, являются источником генов вариабельного района.

Гены константных районов могут быть получены из человеческих клеток, продуцирующих антитела, стандартными методами клонирования. С другой стороны, поскольку гены, представляющие 2 класса легких цепей и 5 классов тяжелых цепей, клонированы, константные районы человеческого происхождения легко доступны из этих клонов.

Предпочтительно слитые гены, кодирующие легкую и тяжелую химерные цепи, встроены в вектора экспрессии, которые могут быть использованы для ко-трансфекции реципиентной клетки. Удобные векторы для генных конструкций включают плазмиды типов pBR 322, pEMBL и pU C. Каждый вектор содержит два селектируемых гена один для селекции в бактериальной системе и один для селекции в эукариотической системе причем каждый вектор имеет отличающуюся пару генов. Эти векторы позволяют получение и амплификацию слитых генов в бактериальных системах и последующую ко-трансфекцию эукариотических клеток и селекцию ко-трансфецированных клеток. Примерами селектируемых генов для бактериальной системы являются гены, которые придают устойчивость к ампициллину, и ген, который связан с устойчивостью к хлорамфениколу. Примерами селектируемых генов для эукариот являются
gpt и nео.

Предпочтенные линии клеток реципиентов клетки миеломы. Клетки миеломы могут синтезировать, собирать и секретировать иммуноглобулины, кодированные трансфецированными генами антител. Далее, они обладают механизмом гликозилирования иммуноглобулинов. Конкретно предпочтенные реципиентные клетки не продуцирующие ig клетки миеломы SP2/O. Shulmanetal, Nature 276:269 (1978). Клетки продуцируют лишь иммуноглобулин, кодированный трансфецированными генами иммуноглобулинов. Клетки миеломы могут быть выращены в культуре или в брюшной полости мыши, где секретированный иммуноглобулин может быть получен из асцитной жидкости. Другие лимфоидные клетки, такие как B-лимфоциты или клетки гибридомы, могут служить подходящими реципиентными клетками.

Лимфоидные клетки могут быть трансформированы векторами, содержащими гены, кодирующие иммуноглобулин различными путями. Они включают электропорацию, слияние протопластов и метод кальций-фосфатного осаждения. Образовавшиеся трансфенированные клетки дают длительные, стабильные линии клеток, вырабатывающих химерные антитела.

Химерные антитела могут быть получены в большом количестве в системах культивирования тканей в большом объеме, таких как различные системы непрерывной перфузии, системы с полыми волокнами, системы поддерживания стационарной культуры и другие системы.

Околочеловеческие антитела или фрагменты антител могут также быть получены изменением генных последовательностей человеческих антител, кодирующих гипервариабельные (определяющие комплементарность) районы для получения подходящей анти Ig E специфичности. См. например, Robert, S. etal. Nature 328: 731-733 (1987); Better, M. etal. (1988) Science 240-104
12. Выработка антител к mb/ec сегменту
e mb/ec пептид может быть использован для иммунизации животных с целью получения поликлональных и моноклональных антител. Они могут быть также использованы для скринирования на специфические моноклональные антитела или для характеристики специфических поликлональных антител. Они могут быть также использованы для очистки моноклональных и поликлональных антител.

В процессе получения моноклональных антител, специфичных к e mb/ec пептиду, не необходимо использовать e mb/ec пептид как для иммунизации, так и для идентификации антитела. Например, при иммунизации для получения иммунных клеток селезенки для слияния с клетками миеломы, иммуногеном может быть мембраносвязанный Ig E, выделенный из плазматической мембраны Ig E-образующих клеток миеломы, таких как клетки SK007. Иммуногеном могут также быть Ig E-образующие клетки миеломы.

Для использования синтетического e mb/ec пептида как иммуногена, более эффективно конъюгировать пептид с белковым носителем. Предпочтенный белковый носитель гемоцианин моллюска (Reyhole). Если в пептидном сегменте отсутствует остаток Лиз или если остаток Лиз есть в середине сегмента, желательно добавить остаток Лиз к C-концу. Поскольку N-конец всегда имеет α -аминогруппу, модифицированный синтетический пептид может иметь две аминогруппы для связывания.

Множество молекул пептида может быть конъюгировано с каждой молекулой белкового носителя. При использовании предпочтительное молярное соотношение пептид/KLH 10. Способ конъюгации очень хорошо устоялся. Используются сшивающие агенты, такие как глютаровый альдегид, или бис-/сульфосукцинимидил/ суберат или дисульфосукцинимидилтартрат /в каталоге 21579, 20591, Pierce chemical Co, Rockford, Il/. Предпочтенный сшивающий агент последний.

Иммуноген, такой как конъюгат KLH, может быть использован для иммунизации кроликов, коз, крыс или мышей для получения поликлональных антител, специфичных к ∈ mb/ec пептиду. Лимфоциты из селезенки или лимфотических узлов иммунных мышей и крыс также могут быть взяты для получения гибридов, селектирующих моноклональные антитела, специфичные к e mb/ec пептиду. Предпочтенный протокол получения моноклональных антител слияние иммунных клеток селезенки мыши с несекретирующими клетками миеломы мыши, такими как клетки NS-1 или SP2/0, с использованием полиэтиленгликоля.

Для оптимальной иммунизации мышей для начала в каждую мышь было инъецировано подкожно 50 мкг конъюгата пептид KLH в полной адъюванте Фрейда. Двумя и четырьмя неделями позже то же количество антитела введено подкожно в неполном адъюванте Фрейда. Примерно на 6-ой неделе сделана 4-ая инъекция антигена внутрибрюшинно в солевом растворе. Мышей забивали через 4 дня после последней инъекции и выделяли селезенки для получения суспензии одиночных клеток для слияния с клетками миеломы. Сходный протокол также может быть использован для иммунизации очищенным природным человеческим мембраносвязанным IgE/имеющим прикрепленный мембранный якорный домен/, выделенным из плазматической мембраны IgE-продуцирующих клеток миеломы человека, таких как клетки SKOO7. Когда в качестве иммуногена используются IgE-продуцирующие клетки, 1•10⁷ клеток инъецируют внутрибрюшинно с двухнедельными интервалами.

Процедура слияния с полиэтиленгликолем и другие различные процедуры, включая клонирование и культивирование гибридомы, были описаны в разделе II.

Скрининг гибридом на моноклональные антитела или идентификация поликлональных антител, реактивных с e mb/ec пептидом, могут быть проведены при помощи ферментативного иммуносорбентного анализа /ELISA/ с использованием синтетического пептида в качестве антигена на твердой фазе. Альтернативный антиген на твердой фазе конъюгат e mb/ec пептида с другим белковым носителем, таким как бычий сывороточный альбумин, отличающийся от того, который использован в иммуногене. Дальнейшая характеристика моноклональных и поликлональных антител показана в табл.6. Также указаны анализы, примененные в этих исследованиях. Анализы описаны в табл. 6.

13. Эксперименты с животными моделями.

Вещества и методы проверены на животных модельных системах. Две из наиболее уместных систем следующие.

А. Модель астма/макака резус.

Моноклоналные антитела, специфичные к e mb/ec пептиду человека и родственные им вещества настоящего изобретения предназначены для использования в лечении пациентов с различными IgE-опосредованными аллергиями (см. раздел 6 ниже). Среди этих аллергий более серьезная форма экзогенная астма. Экспериментальная модельная система для изучения астмы основана на использовании макак резус.

Небольшая часть макак резус, инфицированных нематодой Asearis suum развивают чувствительность к экстракту аскарид. Когда эти чувствительные макаки получают аэрозоль, содержащий антиген аскариды, у них развиваются проблемы с дыханием, напоминающие астму. Patterson, R. J. dinic Jnvest 57 586-593 (1976).

Различные вещества данного изобретения могут быть проверены в модельной системе астма/макака резус. Макака, чувствительные к аскаридам, получали экспериментальное лечение или контрольное лечение и выполнялись измерения для определения:
(а) исчезают ли симптомы астмы, вызванной аскаридами?
(b) уменьшается ли количество циркулирующего IgE?
(c) уменьшается ли количество циркулирующих IgE-продуцирующих B клеток?
(d) уменьшается ли плотность IgE на базофилах?
B. Мышиная модельная система
У мышей неизвестно в природе развитие аллергических симптомов. Однако, для демонстрации фармакологических механизмов предложенной терапии в отношении истощения Ig E-образующих B клеток и Ig E, мышь может служить великолепной моделью.

e mb/ec сегмент мыши был секвенирован, Jshida, N etal. EMBO. J. 1: 117 1123 (1982). Пептид из 19 аминокислот следующий
Glu Leu Asp Leu Gln Asp Leu Cys -Ile Glu Glu Val - Glu Gly Glu Glu Leu Glu Glu
Пептид синтезирован в нескольких формах, включая одну, имеющую дополнительные Лей-Лиз остатки на С-конце.

Пептид и его конъюгат с KLH использованы как антигены для иммунизации кроликов и коз. Антисыворотки собраны. Антиген специфичные антитела очищены с использование колонки Serharose 4B, конъюгированной с пептидом (с добавлением Лей-Лиз) или с пептидом, связанным с бычьим сывороточным альбумином. Нормальным мышам инъецированы внутривенно или внутрибрюшинно очищенные антитела или родственные им вещества для изучения следующих вопросов:
(a) уменьшается ли общий Ig E в циркуляции?
(b) уменьшается ли количество Ig E-продуцирующих B клеток?
(c) уменьшается ли плотность Ig E на поверхности базофилов?
(d) вызывают ли Ig M и IgG, специфичные к e mb/es пептиду, различные эффекты?
Цель данного вопроса заключается в отнесении эффектов антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) к истощению Ig E образующих B клеток. Известно, что IgG но не Ig M, опосредует AD CC.

Пример 1
Получение гибридом и моноклональных антител
а) Получение человеческого Ig E
Человеческий Ig E был получен из коммерческого источника и очищен для иммунизации мышей с целью получения иммунных спленоцитов для слияния и скрининга гибридов.

IgE был также использован для характеристики различных моноклональных анти-IgE антител. Было использовано 2 препарата человеческого Ig E. Один был поликлональным Ig E, очищенным из человеческой сыворотки, полученной от Ventrex (Portland, Maine). Этот человеческий Ig E был очищен из сыворотки аффинной хроматографией с использованием колонки с Sepharose 4B конъюгированной с IgG кролика, специфичным к человеческому Ig E. Загрязняющие человеческий альбумин и трансферрин были удалены аффинной колонкой, конъюгированной с антителами, специфичными к альбумину и трансферрину. Моноклональный человеческий Ig E был также получен из супернатантов культуры Ig E-продуцирующей линии клеток U 266.

Ig E был аффинно очищен на колонке с Sepharose 4B, конъюгирован с моноклональным антителом, специфичным к человеческому Ig E. Это моноклональное антитело IgG было очищено из асцитных жидкостей мышей, несущих специфические гибридомы, с использованием белок А-конъюгированной колонки.

Поликлональный и моноклональный человеческие Ig E были проанализированы ДДС-Na-полиакриламидным гель-электрофорезом в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. В обоих случаях отдельные молекулы Ig E (при невосстанавливающих условиях) и тяжелые и легкие цепи (при восстанавливающих условиях) наблюдались в отсутствие других, и лишь следы относительно очень светлых полос каких-то других загрязняющих белков присутствовали в геле. Поскольку линия клеток U 266 росла в свободной от сыворотки, определенной среде. Мы имели некоторые мысли поводу идентичности загрязняющих белков в препарате моноклонального человеческого Ig E.

b. Процедура иммунизации
1. Процедура
Для иммунизации с целью получения иммунных клеток селезенки для слияния с миеломными клетками для получения гибридов были использованы самцы мышей Balb/c с начальным возрастом 6 8 недель. В качестве иммуногена был использован поликлональный человеческий Ig E, очищенный из сыворотки, оставленной Ventrax. Причиной этого было, то, что моноклональный Ig E, образованный линией клеток U 266, мог нести некоторые неизвестные аномалии. Кроме того, мы не хотели получать моноклональные антитела против идиотипов Ig E U 266, и намного более вероятно индуцировать анти-идиотипические ответы против моноклональных антител. После проведения трех экспериментов по слиянию с мышами, иммунизированными Ig E, происходящим от U266, мы переключились на слияние с мышами, иммунизированными поликлональным Ig E, происходящим из сыворотки человека.

Для иммунизации каждая мышь была инъецирована 20 мкг человеческого Ig E на инъекцию. Первая иммунизация была дана в полном адъюванте Фрейда. Мыши были инъецированы подкожно в местах с высокой концентрацией лимфотических узлов, например, нижняя сторона раздела конечности и туловища. Одним месяцем и двумя месяцами позже мыши получили подхлестывающие инъекции в те же места 50 мкг IgE. Подхлесты были приготовлены в основном тем же образом, что и первая инъекция, за исключением того, что для подхлестов эмульгирование было проведено в неполном адъюванте Фрейда.

После по крайней мере еще одного месяца каждая мышь была реиммунизована подкожно последний раз (4-ая инъекция) 50 мкг IgE в PBS. Каждая мышь была инъецирована подкожно в границу раздела каждой конечности и туловища и внутрибрюшинно. Через 3 для после последней инъекции мыши были забиты и их селезенки удалены. Клетки селезенки были затем слиты с клетками миеломы при помощи следующей процедуры.

c) Слияние
Были приготовлены суспензии, содержащие клетки селезенки и миеломы в соотношении 5: 1. Выбранные клетки миеломы NS-1. Клетки NS-1 были кондиционированы так, что имели время деления около 17 ч. Они были использованы для слияния в логарифмической фазе. Клетки NS-1 были субкультивированы в бактериологических чашках (100 мм) при концентрации 6•10⁴ клеток на мл в 10 мл среды Игла, модифицированной Дальбеко (DMEM), содержащей 5% сыворотки теленка, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Среду меняли каждые 3 дня. Альтернативно, клетки субкультивировали при 1,5•10⁵ клеток на мл в 10 мл той же среды и среду меняли каждые 2 дня.

Клетки селезенки были получены помещением селезенки в бактериологическую чашку (100 мм) и инъецированием 20 мл свободной от кальция и магния PBS (CMF-PBS) в оба конца селезенки для вымывания клеток селезенки. Клетки селезенки затем переносили в 50 мл центрифужные пробирки.

Клетки селезенки центрифугировали при 200 g 5 мин и затем суспендировали в 5 мл 0,83% NH₄Cl (0,155 М) в течение 10 мин при комнатной температуре, для лизирования эритроцитов. Для остановки лизиса в пробирку добавляли 5 мл CMF-PBS. Клетки затем осаждали и ресуспендировали в 10 мл CMF-PBS.

Концентрацию лимфоцитов определяли добавлением 40 мкл клеточной суспензии к 10 мл солевого раствора вместе с 3 каплями Zap-oglobin^ТМ. Число лимфоцитов определяли при помощи гемоцитометра и определяли концентрацию клеток.

Клетки NS-1 переносили из бактериологических чашек (100 мм) в 50 мл центрифужные пробирки. Определяли концентрацию клеток. Клетки NS-1 затем суспендировали в 10 мл CMF-PBS и смешивали с клетками селезенки как 1:5 в 50 мл центрифужной пробирке. Обычно мы получали 2-5•10⁸ клеток из одной иммунной селезенки и мы использовали две селезенки в каждом эксперименте по слиянию.

Клетки откручивали и один раз промывали 10 мл CMF-PBS. Супернатант отсасывали как можно полнее стеклянной пастеровской пипеткой. Из пробирки аккуратно отсасывали жидкость для освобождения клеточного осадка.

До приготовления клеток смесь для слияния приготовляли следующим образом. 5 г полиэтиленгликоля 1450 (Kodak) смешивали с 5 мл CMF-PBS и 0,5 мл ДМСО. Эту смесь нагревали до 56^oC, титровали до конечного pH 7,0 и фильтровали через 0,22 мкм фильтр Millipore для стерилизации. 1,0 мл аликвоты добавляли в Origotubes и хранили их при -70^oC.

Чтобы получить смесь для слияния, готовую к использованию, одну из аликвот в Cryotubes плавили, нагревая ее при 37^oC. Отдельно пробирку, содержащую 1,0 мл DМЕМ (без сыворотки), нагревали до 37^oC.

1,0 мл аликвоту полиэтиленгликольной смеси для слияния добавляли к клеточной суспензии и суспензию хорошо перемешивали. Через 45 с после добавления полиэтиленгликольной смеси для слияния 2,0 мл предварительно нагретой DMEM (без сыворотки) добавляли по каплям с перемешиванием. Затем добавляли оставшиеся 8 мл предварительно нагретой DMEM (без сыворотки). Клетки оставляли при комнатной температуре на 10 мин.

2,0 мл телячьей сыворотки (FBS) добавляли к суспензии и суспензию хорошо перемешивали. Сочетание FBS и CMF-PBS может помочь предотвратить прилипание клеток к стекам пробирки. Суспензию затем центрифугировали при 400 g 4 мин.

После откручивания клетки ресуспендировали в примерно 120 мл модифицированной среды, сдобренной 5% FBS, 100 единиц /мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и гипоксантином, аминоптерином и тимидином (НАТ).

Концентрацию клеточной суспензии доводили до 3,3•10⁵ клеток селезенки на 200 мкл суспензии. 200 мкл аликвоты суспензии затем распределяли по всем ячейкам 96-ячеечной микротитровальной платы. После того, как 20-30 таких плат обычно было приготовлено для каждого слияния, платы переносили в инкубатор и содержали при 37^oC в 5% CO₂.

Клетки растили семь дней в платах, затем убирали среду роста и добавляли новую среду. Четырьмя днями позже проводили ферментативный иммуносорбентный анализ (ELISA, ниже) на антителах в ячейках, чтобы определить, которое будет связывать человеческий IgE.

Результаты
Было проведено четыре эксперимента по слиянию с мышами с использованием приведенного выше протокола. Для этих слияний было приготовлено 7, 15, 36 и 15 плат по 96 ячеек слитых клеток, соответственно. Более чем в 98% ячеек был рост клеток и ячейка содержала в среднем 3-5 клонов гибридов. Т.о. мы получили около 7000 ячеек и, возможно, 21000-35000 клонов в четырех слияниях.

d) Процедура
1. Процедура
Процедура первичного скрининга очень большого числа гибридов, происходящих из ячеек слияния, была ELISA с человеческим IgE в качестве антигена на твердой фазе. В качестве антигена быт использован поликлональный IgE, очищенный из человеческой сыворотки (Ventrax).

Одной важной и решающей стратегией в нашей процедуре скрининга было скринирование на в общем высокоаффинные антитела среди 1000-4000 ячеек от каждого эксперимента по слиянию. Это было сделано путем покрытия каждой ячейки очень малым количеством человеческого IgE, 50 мкм 0,1 мкг/мл. Если предположить, что весь IgE свяжется с твердой фазой, в каждой ячейке будет только 5 нг. Из-за этого малого количества возможность скринирования гибридов, специфичных к загрязняющим белкам, также была сильно снижена. Другой очень важной стратегической точкой было то, что лишь те ячейки, которые показали высокие значения оптической плотности, были выбраны для дальнейшей характеристики и клонирования.

В процедуре 50 мкл человеческого IgE, 0,1 мкг/мл, добавляли в ячейки 9-ячеечных плат Immulon I. Платы покрывали и инкубировали 18 ч при 4^oC, чтобы дать белку связаться с платой.

Жидкое содержимое плат затем убирали и в каждую ячейку добавляли 200 мкл 0,1 М NH₄Cl с целью насыщения всех оставшихся мест связывания на платах. Раствор NH₄Cl оставляли в ячейках на 30 мин при комнатной температуре.

Раствор NH₄Cl затем удаляли и ячейки промывали 3 раза PBS и 0,05% Twen 20. Немного раствора PBS (0,05% Tween 20) оставляли в ячейках до добавления суспензии антитела, описанной ниже.

50 мкл супернатанта клеточного слияния из каждой ячейки 96-ячеечных плат добавляли к каждой ячейке плат Immunol I и инкубировали 1 ч. После инкубации платы 3 раза споласкивали PBS/0,05% Tween 20 с целью удаления всех несвязывающихся антител.

Супернатант клеточного слияния должен содержать антитело, выработанное различными гибридомами в 96-ячеечных плашках. Антитело, специфичное к человеческому IgE, будет связываться. Количества антител, связанных с твердой фазой, затем определяли при помощи рутинной процедуры с использованием козлиного антимышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой красных кровяных телец лошади, с использованием 3, 3, 5, 5-тетраметилбензидина в качестве субстрата.

2. Результаты
Из приблизительно 7000 скринированных ячеек около 4000 ячеек (около 60%) были позитивны в ELISA. Большинство этих позитивных ячеек предположительно содержали гибриды, вырабатывающие моноклональные антитела к человеческому IgE. Из этих приблизительно 4000 ячеек в ELISA мы выбрали 53 ячейки с наивысшими значениями оптической плотности для клонирования и дальнейшей характеристики.

53 моноклональных антител были проверены в ELISA с использованием ячеек плат, покрытых человеческой сывороткой в различных разведениях. Все они были негативны в ELISA что предполагало отсутствие их реактивности с человеческим альбумином, IgE, IgM трансферрином или другими основными белками сыворотки, которые могли загрязнять препараты IgE, использованные как иммуноген для мышей и как антиген в первичном скрининге ELISA.

d) Клонирование одиночных клеток
Клеточные суспензии из каждой из 53 ячеек с наивысшими значениями оптической плотности в ELISA были распределены в ячейки 24-ячеечных плат, клеточные суспензии были разведены до 30, 50 и 100 клеток/мл. 0,1 мл разведенных клеточных суспензий, (содержащий в среднем 3, 5 или 10 клеток соответственно), поместили в ячейки 96-ячеечной платы. Ячейки были покрыты гистоном.

Когда клетки выросли до колоний, клетки были проанализированы под микроскопом. Клетки каждой колонии не двигались вокруг и не образовывали колоний. Клоны единственных клеток, демонстрирующие наиболее сильную реактивность в ELISA, были выбраны и выведены в культуру.

e) Продукция и очистка моноклональных антител
Для выработки больших количеств желаемых моноклональных антител была проведена следующая процедура.

Некоторые из клонов, демонстрирующих высокие значения оптической плотности в ELISA, которые были выращены в ячейках в 24-ячеечных платах, были затем высеяны в 100-мл платы для культивирования культур. Высеянные культуры выбранных клонов единичных клеток были затем отдельно инъецированы в брюшную полость использованных впервые мышей, используя 5 млн клеток на мышь. После 7 дней асцитную жидкость каждой мыши собирали и замораживали.

Моноклональные антитела в асцитной жидкости были очищены следующим образом. Замороженную асцитную жидкость размораживали и фильтровали через нейлоновую ткань для удаления мягкого материала. Фенилметилсульфонилфторид добавляли к асцитной жидкости до конечной концентрации 0,1 мМ. На каждый мл асцитной жидкости добавляли 0,05 мл 1,2 М ацетатного буфера (pH 4,0). Конечная концентрация ацетатного буфера была 60 мМ. pH доводили до 4,5.

На каждый мл обработанной асцитной жидкости добавляли по каплям 25 мкл каприловой кислоты (М.в. 144,21, плотность 0,91 г/мл) с тщательным перемешиванием. Суспензию держали при комнатной температуре и непрерывно перемешивали 30 мин. Суспензию затем центрифугировали 10 мин при 15000 для преципитата. Супернатант, содержащий IgG, нейтрализовали добавлением объема 1 М буфера HEPES (pH 8,0), равного 0,1 объема супернатанта, IgG затем осаждали 50% (NH₄)₂SO₄.

Преципитат затем растворяли в солевом буфере HEPES. Этот раствор диализовали ночь против солевого буфера HEPES для удаления от (NH₄)₂SO₄. Солевой буфер HEPES дважды меняли во время диализа. После диализа солевой буфер Hepes содержал очищенный растворенный IgG. Очищенный IgG был использован в некоторых анализах для характеристики.

Некоторые моноклональные антитела были очищены из асцитных или культурных жидкостей методом двойной колоночной хроматографии. Сначала антитела были хроматографированы на анионообменнике DE-52 (Whatman, Maidstone England) с использованием 0,05 М Tris pH 8,0 со ступенчатым увеличением NaCl от 0,01 до 0,15 М. Фракции, содержащие антитела, были идентифицированы ферментативным иммуноанализом, концентрированы фильтрованием на Amicon, Danjer, M. A. Umio mambrane) и далее очищены на колонке с гидроксиапатитом (Bio-Gel, HT; Riorad, Richmond, CA) с использованием ступенчатого буфера (pH 7,4) от 0,01 до 0,3 М. Чистота была оценена изоэлектрофокусированием (13) и ДДС-Na акриламидным гельэлектрофорезом с использованием системы Pharmacia PHAST System (Pharmacia, Piscatway, N.y.). и концентрация определена по D 280 нм (1,5-1 мг/мл).

Пример 2
Характеристика моноклонального антитела изобретения
а) Связывание с базофилами с использованием иммунофлюоресцентного анализа и анализа связывания радиоактивности
IgE реактивные моноклональные антитела были изучены, чтобы определить, связываются ли они с базофилами, выделенными из периферической крови. На этом втором уровне скрининга мы отобрали антитела, имеющие терапевтическую ценность. Антитела не должны связываться с базофилами и тучными клетками и вызывать высвобождение фармакологических медиаторов.

Сначала мы выбрали анализ с иммунофлюоресцентным окрашиванием, поскольку базофилы составляют очень небольшой процент (0,5-2%) среди лейкоцитов. Мы считали, что даже в обогащенных препаратах базофилов клеток на уровне единичных клеток с использованием иммунофлюоресцентного окрашивания или биотинавидин ферментативного иммуноокрашивания возможно даст более точное определение, чем радиосвязывание или ELISA исследующие целиком клеточные популяции.

1. Выделение базофилов
Базофилы были сильно обогащены из периферийной крови нормальных здоровых индивидов с использованием плотностного центрифугирования в PercoLL с использованием процедуры, описанной P. Rafhuprasad, J. Immunol. 129: 2128-2133 (1982). Коротко. Основной раствор Percoll был приготовлен смешиванием 90 мл 90%-ного раствора Percoll с 8,96 мл 10х сбалансированного по Хенксу солевого раствора, 0,45 мл 1H HCl и 1 мл 10х буфера HEPES (pH 7,6). Требуемые плотности Percoll были получены с использованием следующей формулы (8):
плотность Percoll (г/мл)= (% основного раствора Percoll x 0,001186) + 1,0041,
где 0,001186 константа и 1,041 плотность физиологической среды. Поскольку плотность Percoll изменяется под действием температуры его приготовления, заранее до дня эксперимента выдерживали при комнатной температуре в течение ночи.

Гепаринизированную кровь, свежеполученную от нормальных доноров, разводили 1:1 основной культурной средой RPM1-1640 и центрифугировали через слой Ficoll/Hupaque (плотность равна 1,070 г/мл). Многоядерные клетки в интерфазе удаляли для других целей и собирали беловатый слой на верхушке осадка красных клеток. Эти гранулоциты промывали и ресуспендировали в основной среде и затем центрифугировали через 2 тщательно наслоенных градиента Percoll с плотностью 1,072 и 1,078 г/мл при 600^oC в течение 15 мин. Клетки собирали на интерфазе слоев Percoll и ниже интерфазы между основной средой и верхним слоем Percoll.

Клетки содержали 2-10% базофилов, в зависимости от конкретного донора.

2. Процедура анализа.

50 мкл обогащенной суспензии базофилов с концентрацией 5х10⁶ клеток/мл добавляли к каждой из 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, содержащих специфичные антитела. Затем к каждой пробирке добавляли 50 мкл супернатантов гибридомных клонов, показывающих наибольшие значения оптической плотности в ELISA с использованием человеческого IgE в качестве антитела. С некоторыми клонами были проведены повторные анализы. Когда были доступны очищенные антитела, они были использованы в концентрации 20,5 и 1 мкг/мл; когда были доступны асцитные жидкости, они были использованы в разведениях 1:50.

Пробирки с клетками и антителами затем инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации пробирки откручивали, супернатанты удаляли и клетки промывали 2 раза смесью RPMI-1640, содержащей 2% телячьей сыворотки и 0,1% азида натрия. Пробирки затем потряхивали для высвобождения клеточного осадка.

10 мкл меченого антитела, козлиного антимышиного, коньюгированного с флуоресцеинизатиоцианатом (FITC), добавляли к каждой пробирке в разведении 1:200. Это меченое антитело связывается с любыми моноклональными антителами, присоединенными к IgE на базофилах, и обеспечивает возможность идентификации этих моноклональных антител.

Пробирки снова инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Пробирки центрифугировали и клетки промывали той же средой, что и раньше. Клетки затем ресуспендировали в 50 мкл PBS, помещали на отдельные стекла и покрывали покровными стеклами. Клетки изучали в флуоресцентном микроскопе.

Когда антитела красили клетки, можно было наблюдать, что некоторые из клеток в каждом поле зрения были ярко окрашены. В зависимости от экспериментов процент позитивно окрашенных клеток варьировал от 2 до 10%
3. Анализы радиосвязывания.

Многие из использованных операций сходны с таковыми для иммунофлуоресцентного окрашивания. Фракцию лейкоцитов, содержащую обогащенные базофилы, инкубировали с мышиным моноклональным антителом и около 10 cpm¹²⁵I-козлиного антимышечного IgG в присутствии 1% нормальной сыворотки козла в качестве подавителя неспецифического связывания. После 30 мин инкубированная смесь была наслоена на слой телячьей сыворотки (100%) в конической пластиковой центрифужной пробирке. После центрифугирования для осаждения клеток верхний слой и сыворотку удаляли. Пробирки переворачивали для удаления остатков жидкости. Кончики конусов, содержащие осадок клеток, затем отрезали лезвием бритвы. Эти кончики затем помещали в пробирки и считали в сцинтилляционном счетчике на ¹²⁵I. Позитивное и негативное связывание определяли сравнением количеств связанного ¹²⁵I между негативным контрольным моноклональным антителом и человеческим IgE специфичными моноклональными антителами.

4. Результаты
Сначала было проведено несколько экспериментов с использованием иммунофлуоресцентных анализов. Позднее анализы были с использованием сходной процедуры, использующей вторичное антитело, меченое биотином (козлиный антимышечный IgG) и конъюгированный с пероксидазой авидин. Результаты двух анализов показали, что фоновое связывание варьирует от одного антитела к другому. Результаты также показали, что чувствительности анализов не выше, чем у анализов с высвобождением гистамина (ниже). Основная причина относительно низких чувствительностей в этих анализах та, что процент базофилов среди лейкоцитов крови у нескольких выбранных доноров был всегда очень низок. Для этих экспериментов с иммуносвязыванием предпочтительны индивиды с относительно высоким процентом базофилов. Исходя из лейкоцитов с высоким содержанием базофилов, можно получить обогащенную базофилами фракцию, удобную для их экспериментов.

b) Индукция высвобождения гистамина из лейкоцитов крови
Когда моноклональное антитело, специфичное к человеческому IgE, связывается с IgE, связанное с на базофилах, оно перекрестно смешивает IgE и агрегирует подлежащие молекулы Fc∈R и вызывает высвобождение гистамина и других фармакологических медиаторов. Различные моноклональные антитела, специфичные к IgE человека, были проведены на способность индуцировать высвобождение гистамина из отмытых лейкоцитов периферической крови человека.

1. Процедура
Примененный метод тот же, что описан в деталях Siraganian и Hook. Анализ in vitro количественно оценивает процент общего гистамина в популяции лейкоцитов, который высвобождается в культурную среду после инкубации с индукторами. Определение гистамина в среде или клеточных лизатах производилось при помощи автоматического инструмента, который экстрагирует гистамин n-бутанолом и приводит его в реакцию с присоединяющимся веществом, o-фталальдегидом, при высоком pH для образования флуоресцентного продукта, и измеряют его при помощи флуорометра.

Мы проводили эксперименты по индукции высвобождения гистамина и собирали среду от лейкоцитов после инкубации с тестируемыми и контрольными антителами и получали клеточные лизаты для определения общих количеств гистамина.

Если коротко описывать, процедуру высвобождения гистамина из отмытых лейкоцитов, мы существенно адаптировали процедуру, описанную Siraganian, R.P. and Hook, W.A.n: Manual of Clinical Chemistry, ed.Rose, N.R. and Friedman, H.2dEd, pps 208-311.

Кровь была получена от нормальных добровольцев венопункцией. В 50 мл конической пробирке каждые 10 мл крови смешивали с 1 мл 0,1 M ЭДГА и 2,5 мл раствора декстрандекстррозы. (Все растворы и реагенты, упомянутые здесь, описаны в деталях Siraganian, выше). Смесь оставляли для осаждения при комнатной температуре на 60-90 мин до тех пор, пока не образовалась резкая граница между слоями эритроцитов и плазмы. Слой плазмы лейкоцитов кровяных пластинок был слит и откручен при 1000 об./мин в течение 8 мин при 4^oC. Супернатанты, содержащие кровяные пластинки, удаляли, добавляли 2-3 мл холодного раствора PIPESA- ЭДТА и ресуспендировали клетки. Добавляли еще 40 мл холодного PIPESA ЭДТА и откручивали клетки. После удаления супернатантов клетки ресуспендировали в 20 мл PIPESA. Клетки затем откручивали снова и ресуспендировали в PIPESACM при плотности клеток 4•10⁶/мл.

Пробирки, содержащие 0,3 мл отмытых лейкоцитов, и пробирки, содержащие 0,3 мл культуральной жидкости, гибридом нагревали до 37^oC в течение 6 мин. Пробирки затем смешивали и инкубировали при 37^oC с перемешиванием каждые 10 мин. После 60 мин клетки откручивали и собирали супернатанты. Для общего содержания гистамина 0,3 мл отмытых лейкоцитов смешивали с 6% хлорной кислоты.

2. Результаты
Распознав отсутствие связи природы высвобождения гистамина среди доноров крови, доступных нам, мы заключили контракт на гистаминовый анализ с другой лабораторией, рутинно производящей анализ на высвобождение гистамина. Лаборатория доктора Donald MacGlashan в отделении клинической химии Университета Джона Гопкинса определила возможности большинства наших моноклональных антител, специфических к человеческому IgE, индуцировать высвобождение гистамина из базофилов. Ключевые результаты, относящиеся к тем моноклональным антителам, которые не вызывают высвобождение гистамина, были затем подтверждены в лаборатории доктора Reuben Siraganian в Национальном Институте Здоровья. Обе эти лаборатории установили стабильную популяцию лиц, у которых высвобождается много гистамина, путем скринирования большого числа доноров крови. Результаты обширных исследований с использованием лейкоцитов от 7 доноров, включая по крайней мере 4 с высоким высвобождением гистамина, проведенных доктором MacGlashan, суммированы в табл.7. Антитела были разведены в 100, 10000 или 1000000 раз из асцитных жидкостей или очищенных антител (1-5 мг/мл). Данные высвобождения гистамина были от 1 репрезентативного "супервысвободителя". Результаты показали, что среди 41 моноклонального антитела 12 не индуцировали освобождение гистамина.

c) Связывание моноклональных антител с IgE-секретирующими клетками миеломы
Некоторые клетки миеломы (которые являются опухолевыми клетками, происходящими из иммуноглубулин секретирующих клеток плазмы), как известно, экспрессируют небольшие количества иммуноглобулинов на своей поверхности, сравнимое с таковыми на поверхности покоящихся B клеток. Молекулы IgE связываются с поверхностью базофилов (или тучных клеток) и B клеток при помощи двух различных механизмов. IgE связываются с базофилами и тучными клетками через взаимодействие молекул Fc∈R этих клеток и определенного сайта на FcIgE. IgE синтезируются B клетками или клетками плазмы и переносятся к поверхности клеток и удерживаются на поверхности дополнительным контактным сегментом тяжелой цепи. Этот заякоривающий сегмент найден лишь в мембрано-связанных иммуноглобулинах, но не в секретированных формах иммуноглобулинов. Дифференциальное связывание моноклонального антитела с IgE на базофилах и на B клетках фундаментальная основа применения антител в лечении аллергии.

Поскольку IgE-образующие B клетки и клетки плазмы весьма редки во фракции моноядерных лейкоцитов и поскольку пространственные и структурные характеристики мембраносвязанных молекул IgE скорее всего одинаковы на плазматических клетках, B клетках или IgE-секретирующих клетках миеломы, мы избрали изучение связывания моноклональных антител с клетками IgE миеломы SK007 (из Американского Коллектива Типов Культур). Также может быть исследовано взаимодействие моноклональных антител с нормальными IgE-образующими клетками и клетками плазмы.

1. Процедура
Человеческие клетки SKO-007, CCL-156 и CCL-59, экспрессирующие связанные на поверхности человеческие IgE-лямбда, Ig M-лямбда и IgGI -каппа соответственно поддерживали в среде RPMI-1640, сдобренной 5% телячьей сывороткой и 2 мМ глутамином от GIBCO и 1%-ным раствором антибиотика-антимикотика. Одноядерные клетки периферической крови, полученной венопункцией здоровых доноров, были выделены центрифугированием в градиенте плотности Firoll pague (Pharmacia, Piscatway, N. J.). Связывание моноклональных антител с поверхностями клеток изучали, используя 2 типа анализов: связанные антител с живыми клетками с последующим непрямым флуоресцентным анализом жидкостной проточной цитометрии и ферментативным анализом с антителами с клетками, присоединенными к микротитровальным платам.

Связывание антител с живыми клетками проводили, осаждая клетки центрифугированием 5 мин при 300 g, отмывкой среды поддержания от клеток при помощи PBS-BSA и ресуспендированием клеток при 20•10⁶ в PBS-B. 50 мкл клеточной суспензии смешивали с 50 мкл антитела при дважды установленных концентрациях (1-10 мкг/мл) и PBS-B и держали на льду. После 30 мин инкубации в каждую пробирку добавляли 2 мл ледяного PBS-B и клетки собирали центрифугированием 5 мин при 300 • g при 5^oC. Супернатант сливали, осадки клеток ресуспендировали встряхиванием и клетки однократно промывали еще 2 мл PBS-B. После собирания клеток центрифугированием в каждую пробирку 20 мкл аффинно очищенного козлиного F(ab')₂ против мышиного IgG (H + L) (Boehringer Mannhneim, Lot 52934, code 529), разведенного 1:20. Пробирки инкубировали 20 мин на льду и промывали PBS-B, как указано выше. Наконец, осадки клеток ресуспендировали в 0,5 мл 1% пара-формальдегида (Polyscienees, Ine. Warrington, PA) в PBS. Клетки анализировали с использованием EPICS Profile (Coulter, H:aleah, FL), оснащенного 5 Вт аргоновым лазером, работающим при 488 нм, 0,6 Вт в Cytology Technology, Inc.

(Houston, TX). Интенсивность флуоресценции учитывалась встроенным логарифмическим умножителем после ввода комбинации рассеяния прямого света и рассеяния перпендикулярного света для отличения жизнеспособных клеток. Ферментативный анализ с антителами, связанными на клетках, проводился после связывания MAbS с клетками, фиксированными глутаровым альдегидом, в соответствии с методом kennelt, R. H. b Monoclonal Autibodies, eds, kennett, R. H. etal. pp 376, Plenum Press, New York (1980).

В микротитровальные платы с плоским дном добавляли поли-L-лизин (100 мкл) лунка, 10 мкг/мл в PBS (Falcon 3072, Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA). Этот раствор вытряхивали из ячеек после 30 мин при 22^oC и в каждую ячейку добавляли 50 мкл клеток при 2,5•10⁶ клеток/мл свободной от кальция и магния модифицированной PBS (GIBCO). Клетки помещали на дно лунок центрифугированием при 300 • g в течение 5 мин и фиксировали клетки 10 мин при 22^oC добавлением 50 мкл глутарового альдегида, разведенного до 0,25% в ледяном PBS. Места неспецифического связывания были блокированы последовательной инкубацией 0,1 М глицина 0,1% BCA в PBS (200 мкл/ячейку) с последующей инкубацией Blotto (5% нежирное сухое молоко (Carnation, LA, CA) в PBS с 1 г/л триметозала). Блокирующие растворы удаляли аккуратным вытряхиванием из платы. Клетки экспонировали с 50 мкл/ячейку контрольного или тесторного моноклонального антитела в Blotto при 37^oC в течение 1 ч. Несвязавшееся антитело удаляли вытряхиванием из плашки и промывали 6 раз 200 мкл/ячейку PBS с использованием оборудования (Costar, Cambridge, MA). Затем клетки инкубировали с 50 мкл меченого биотином аффинноочищенного козлиного антимышиного IgG (KPL, Gaithersburg, MD) при 0,5 мкг/мл в Blotto при 37^oC в течение 1 ч. Все ячейки промывали, как указано выше, и добавляли пероксидазу из красных кровяных телец лошади стрептавидин при 0,5 мкг/мл в Blotto в течение 1 ч при 37^oC. Несвязавшийся конъюгат удаляли промыванием, как указано выше, и добавляли 100 мкл субстрата TMB. Платы выдерживали в течение 30 мин при 22^oC и останавливали реакцию добавлением 50 мкл/ячейку 4H H₂SO₄. Измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием Biotek microtiter plate reader.

2. Результаты
Среди 41 проверенного моноклонального антитела в анализе проточной цитометрии 35 окрашивали клетки SK007. Все 29 моноклональных антител, которые индуцировали высвобождение гистамина из базофилов, окрашивали. Среди 12 моноклональных антител, которые не индуцировали высвобождение гистамина, 6 окрашивали и 6 не окрашивали клетки SK007 (табл.1). Результаты с ферментативными иммуноокрашиванием были те же, что и в анализах проточной цитометрии. Т. о. в анализированной группе моноклональных антител 6 соответствуют критериям, что они не связываются с базофилами и не индуцируют высвобождение гистамина и что они связываются с Ig E-образующими B клетками. Как обсуждалось ранее, Siraganian с коллегами (Fed, Proc, 46: 1346 (1987) получили 2 мышиных моноклональных антитела (E14С51В1 и Е11АС311С) против человеческого Ig E, которые могли подавлять связывание IgE с базофилами. Мы получили эти 2 антитела от доктора Siraganian и показали, что они связываются с клетками SK007 и не индуцируют высвобождение гистамина из базофилов.

d) Определение сродства связывания с человеческим Ig E
1. Принцип и процедура
Хорошо известно, что чувствительность иммуноанализов зависит от аффинности антител к измеряемым веществам. В случаях сэндвичных анализов на твердой фазе с использованием двух моноклональных антител, одного в качестве адсорбента на твердой фазе и одного в качестве отслеживающего, важны аффинности обоих из двух моноклональных антител. Влияние аффинности антитела на прохождение различных анализов с антителом и с использованием иммуноанализов для вычисления аффинности антитела систематически изучены.

Nimmo et al. J. Immunol. Met. 72:177-187 (1984); Muller J. Immunol. Met. 34:345-352 (1980).

Для определения аффинности моноклонального антитела к антигенам твердую фазу в иммуноанализе, например, микротитровальные ячейки в 96-ячеечной плате ELISA. Аффинность моноклонального антитела относительно таковой эталонного моноклонального антитела к тому же антигену на твердой фазе может быть определена сравнением двух моноклональных антител в иммуноанализе. Аффинность или константа связывания эталонного моноклонального антитела определена каким-либо другим способом или сходным способом. Значение оптической плотности моноклонального антитела с определяемой аффинностью в сравнении с таковым эталонного моноклонального антитела указывает, выше или ниже активность этого моноклонального антитела по сравнению с таковой эталонного моноклонального антитела.

Когда эталонное моноклональное антитело не доступно, анализ может быть проведен против эталонного моноклонального антитела, специфичного к другому антигену. Относительная аффинность двух моноклональных антител может быть определена из значений оптической плотности путем покрытия твердой фазы одинаковым молярным количеством антитела и применением идентичных условий и параметров анализа.

В нашем определении аффинностей нескольких моноклональных антител, специфичных к IgE человека, которые связываются с клетками SK007, но не индуцируют высвобождение гистамина из базофилов, мы сравнивали связывание различных моноклональных антител с человеческим IgE с таковым моноклонального антитела с человеческим β-HCG, чья аффинность, как было определено, 1•10¹¹ л/моль. В наших анализах мы покрывали ячейки в плате ELISA 50 мкл 0,1 мкг/мл β-HCG или человеческого IgE и титровали анти-HCG моноклональное антитело и различные моноклональные антитела против соответствующих антигенов на твердой фазе. Процедура была, в сущности, та же, что описана в процедуре ELISA в примере 1. Кривые титрования определяли с использованием конъюгированного с пероксидазой красных кровяных телец лошади козлиного антимышиного IgG и ферментного субстрата.

Сродство моноклональных антител, интересующих исследователя, может быть также определено при помощи ¹²⁵I-меченого человеческого IgE. Растворы антител и ¹²⁵I- IgE известных концентраций смешивают и оставляют на время (24 ч), достаточное для связывания их до равновесия. Иммунные комплексы затем легко удаляются аффинной адсорбцией с использованием избытка Serharose 4В, конъюгированной с козлиным антимышиным IgG. Свободный ¹²⁵ IgE легко отмывается. Константа связывания, Ka, моноклонального антитела может быть вычислена из соотношения свободного ¹²⁵I-IgE и связанного ¹²⁵I-IgE. Этот способ особенно удобен для антител с высокой аффинностью.

2. Результаты
6 моноклональных антител, которые не вызывают высвобождение гистамина из базофилов и которые связываются с клетками SK007, как было определено, имеют константу связывания, Ka, в диапазоне от 3•10⁸ до 5•10⁸ л/моль.

Эквиваленты
Искушенные исследователи распознают или способны установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, множество эквивалентов конкретным воплощениям изобретением, описанных здесь. Такие эквиваленты предназначаются быть включенными следующим.

Использование: медицина, медицинская промышленность. Сущность изобретения: описываются антигенные эпитопы Ig E (обозначенные ige. bl, которые присутствуют на IgH-продуцирующих β-лимфоцитах). Один класс ige.bl эпитопов связывается с или вблизи FC∈R-сайта связывания на IgE. Другой класс ige.bl эпитопов ассоциирует с внеклеточным сегментом домена ∈ цепей, который закрепляет Ig E на мембране B клеток (E. mb/ec). Описывается способ получения антител, который связывается с ige.bl эпитопами и используется для лечения аллергических состояний, вызванных IgE. При этом для иммунизации животного используют пептид, имеющий аминокислотную последовательность: CIu-Leu-Asp-Val-Cys-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Glu-Ala-Pro коньюгированный с гемоциамином молюска. 3 ил, 7 табл.

1. Способ получения антител, специфически связывающихся с IgE, включающий иммунизацию животного антигеном с последующим отделением антител, отличающийся тем, что в качестве антигена используют нептид, имеющий аминокислотную последовательность: Glu Leu Asp Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Pro, конъюгированный с гемоцианином моллюска. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают антитела, связующиеся с IgE, связанным с мембраной.