Изобретение относится к способу увеличения числа нейтрофилов и индуцированию созревания миелоидных клеток у млекопитающих осуществляемому путем введения эффективного для этих целей количества интерлейкина-4 (ИЛ-4) млекопитающим, нуждающимся в такого рода обработке, а также к способам очистки интерлейкина-4, предназначенного для использования при такого рода обработке/лечении.
Интерлейкин-4 (ИЛ-4) является лимфокином(стимулятором иммунной системы), обладающим широким спектром иммунно-клеточной стимулирующей активности (Bahcheareau, Lymphokine Res 6, N1: U135 (1987); Yoko to et al.P r os.Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5894-5898 (1986) Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2061-2065 (1986); Coffh ah et al. J Immun ol. 136:949-954 (1986); Sanderson etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:437-444 (1986): Grabstein et al. J. Exp. Med, 1631405-1413 (1985): Vitett a et al, Exp.Med. 162:1726-1731 (1985). На определенных этапах ИЛ-4 принимали за фактор роста B-клеток (BCGF) (Butler et al, J. Iмм unol. 133:251-255 (1984) (человеческий BOGF); и Farr ar et al. J Iмм unol 131:1838-1842 (1983) (мышиный BCGF): и за фактор стимуляции B-клеток (BSF-1) Oha ra et al. J Iмм unol. 135:2518-2523 (1985). Название интерлейкин-4 окончательно определилось и адаптировалось в 1986 г. (Sanderson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:437-440 (1986).
В начале предположили, что ИЛ-4-играет важную роль только в процессе дополнительной стимуляции (косстимуляции активированных B-клеток (R oehm et al, J. Exp. Med 160:679-694 (1984). Однако было также обнаружено модуляция активности T-клеток и тучных клеток (Mos mann et al. Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 5654-5658 (1986). Смотри также WO 87/0290, в которой описана активность ИЛ-4 как фактора роста T-клеток и как фактора роста B-клеток, что пригодно для увеличения природной сопротивляемости против различных инфекций.
T-клетки и B-клетки действуют на последней стадии иммунного ответа. Было бы большим преимуществом иметь средство, которое бы увеличивало и активизировало нейтрофилы, которые действуют на ранних стадиях инфицирования и находятся в организме на передней линии защиты против инфекций.
В процессе нормального гематопоэза лейкоцитов клетки порождаются в костном мозге из недифференцированной неразвитой клетки, известной как стволовая клетка и дифференцируются через более зрелые стадии на различные линии дифференциации, переходя в конечном состоянии дифференциации в моноцит, гранулоцит или лимфоцит.
Особенность незрелых, недифференцированных клеток состоит в их склонности к быстрому размножению. Это единственный случай, когда предшественник клетки созревает и дифференцирует через эти многократные стадии, что, как правило, приводит к потере способности пролиферировать и выполнять функцию специализированной функциональной зрелой клетки.
Как правило, рак это нарушение клеточной дифференциации. В частности, миелоидная лейкемия представляет собой нарушение, в котором клетки линии моноцитов и линии гранулоцитов блокируются на ранней стадии созревания и, в результате этого, не теряют своей способности к пролиферации. Поскольку эти блокированные на стадии созревания клетки продолжают пролиферировать, то они приводят к росту популяции незрелых раковых клеток, что и диагностируется как лейкемия.
Имеются данные, свидетельствующие о том, что различные клетки миелоидной лейкемии можно принудить к дифференциации в нормальные макрофаги и гранулоциты, и что в процессе дифференцировки эти клетки теряют присущую им способность к пролиферации. Это приводит к мысли о том, что индуцирование терминальной дифференцировки каким-либо средством может оказаться полезным при лечении миелоидной лейкемии.
Недавно мы с удивлением обнаружили, что введение ИЛ-4 увеличивает число нейтрофилов и моноцитов. Что еще более удивительно, мы обнаружили, что действие на нейтрофилы продолжается длительное время после введения ИЛ-4. Это очень удивительно, поскольку время жизни ИЛ-4 в организме очень мало. После обсуждения, мы решили, что ИЛ-4 может вводиться млекопитающим для увеличения числа нейтрофилов и для повышения устойчивости носителя к инфекции или для подавления инфекции на осень ранней стадии. Млекопитающим может быть носитель с ослабленной иммунной системой, например, любой носитель, восприимчивый к нежелательным бактериальным инфекциям, например, пациент с тяжелыми ожогами или язвами, носитель, чей иммунитет снижен в результате облучения или химиотерапии в процессе лечения рака, и носитель с врожденным иммунодефицитом. Эти свойства ИЛ-4 также указывают на то, что он может быть полезен при местном введении в заживляемые раны, такие как открытые порезы или ожоги, за счет стимуляции нейтрофила и активации моноцита и пролиферации фиброобласта раневой области.
Обсудив, мы пришли к заключению, что ИЛ-4 индуцирует созревание миелоидных и моноцитоидных клеток. Поскольку миелоидная лейкемия связана с пролиферацией незрелых миелоидных клеток, то ИЛ-4 инициирует переход миелоидных клеток в зрелое состояние, таким образом снижая их пролиферацию, и обеспечивает способ лечения миелоидной лейкемии.
Предпочтительно, когда для лечения млекопитающих используют ИЛ-4, полученный из человеческого источника, другими словами человеческий интерлейкин ИЛ-4, полученный рекомбинантным путем из E. coli или CHO(яичник китайского хомячка) клеток. Наиболее предпочтительно, когда препарат млекопитающим вводят подкожно или внутривенно путем инъекций или путем внутривенной инфузии и в количестве от примерно 0,1 до примерно 30 мкг ИЛ-4 на килограмм массы тела в день. Предпочтительно, когда ИЛ-4 вводит в количестве примерно от 1 до 15 мкг ИЛ-4 на килограмм массы тела ежедневно, и наиболее предпочтительно, когда эта доза составляет от примерно 3 до примерно 10 мкг ИЛ-4 на кг массы тела ежедневно.
Активный ИЛ-4 высокой степени чистоты может быть получен из ферментационного бульона ИЛ-4, экспрессированного E. coli, путем трехстадийного процесса, включающего следующие стадии очистки:
1. Неочищенный ферментационный бульон очищают методом афинной хроматографии, используя для этих целей колонку, заполненную гелем металл-хелатирующей агарозы, такой как хелатирующая Сефароза, выпускаемая на рынок фирмой Pharnacia Chemi cals, Pis cataway, New Jersey под торговыми марками хелатирующая Sepharose® Fast Flow и хелатирующая Sepharose e® 6B. Хелатирующая Sepharose Fast Flow содержит на поверхности сефарозы 6 Fast Flow группы иминодиуксусной кислоты соединенные стабильными эфирными связями. Сефароза 6® Fast Flom это поперечносшитая агароза, 6% Используют буферный раствор, предпочтительно, фосфатный буферный раствор. Фосфатный буферный раствор, который используется в данных целях содержит высокую концентрацию хлорида натрия, а именно, примерно от 0,5 до 1.М, предпочтительно, 1 М, в растворе с нейтральным или слабощелочным pH, например, со значением в интервале примерно 6.8 8, предпочтительно с pH примерено 7.2. Высокая концентрация соли и близкое к нейтральному значение pH, равное примерно 7.2, помогают максимизировать связывание активного интерлейкина-4 и свести к минимум связывание других протеинов в колонке. Предпочтительным хелатообразующим металлом является цинк, хотя могут использоваться и другие хелатообразующие металлы, такие как медь, кобальт, никель. После завершения связывания в колонке, последнюю дважды промывают, сначала равновесным буфером, содержащим 20 мм фосфата натрия, pH равно 7.2, и 1.0 М хлорида натрия. Затем ее промывают фосфатным буфером, содержащим примерно 10% глицерина и небольшую концентрацию хлорида натрия, примерно 150 мМ в 20 мМ натрийфосфатного буфера. В процессе второго промывания удаляются примеси очень тесно связанные с трудноотделяемыми примесями. Наконец, ИЛ-4 элюируют при pH равном 5, используя в качестве элюента ацетатный буфер, содержащий 0.50 М хлорида натрия.
2. Раствор активного интерлейкина-4, выделенный на стадии 1, далее очищают методом катионообменной хроматографии на S Sepharose® Fast Flow при pH близком к нейтральному примерно 6,75 и 15 мS /проводимость/, когда большинство примесей не связывается в колонке. Далее очищенный ИЛ-4 элюируют из колонки буферным раствором.
3. Полученный раствор активного ИЛ-4 очищают методом гельхроматографии неэксклюзивной колонке, уравновешенной 10 мМ цитрата натрия, pH 4.5 после концентрирования до 20 мг/мл при pH 4.5. Затем собирают очищенный раствор ИЛ-4, степень чистоты которого составляет 95 99%
Также активный интерлейкин-4, высокой степени чистоты может быть получен из среды клеточной культуры ИЛ-4, экспрессированной линиями CHO-клеток в процессе, который включает:
1. Очистку среды клеточной культуры, содержащей активный ИЛ-4 методом катионообменной хроматографии на колонке из S-Сефарозы ®Fast Flow при примерно нейтральном pH, значение которого лежит в интервале от 6.7 8, предпочтительно оно равно 7.2 и при 13 15 мS (проводимость), когда большинство примесей не связывается на колонке. S Sepharose® поставляется фирмой Pharmacia Fine Chemicals, Riscataway, и представляет поперечносшитую агарозную матрицу, с подшитыми к ней ионообменными группами -CH2-SO3-Na+. Колонку промывают равновесным буфером, затем очищенный ИЛ-4 изократически элюируют буферным раствором из колонки, pH буферной системы 7.2, содержит 0.26 М NaCl и объединяют.
2. Объединенный элюат из стадии 1 очищают еще раз методом катионообменной хроматографии на относительно маленькой колонке из S Сефарозы с объемом, составляющим примерно 15% объема колонки на стадии. Колонку промывают равновесным буфером, затем молекулы активного интерлейкина-4 элюируют буферной системой при pH 7.2, содержащим хлорид натрия в градиенте концентрации 0.12
0.50 М.
3. Раствор активного ИЛ-4 после стадии 2 очищают методом афинной хроматографии, используя для этих целей колонку, заполненную гелем метал-хелатирующей агарозы, и пропуская раствор ИЛ-4 после доведения раствора до pH 7.2 и проводимости до 45 50 мS. Гель хелатирующей Sepharose выпускается фирмой Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway New Jersey под торговыми наименованиями хелатирующая Сефароза ®Fast Flow и хелатирующая Сефароза ®6B. Хелатирующая Сефароза Fast Flow содержит на поверхности Сефарозы 6 Fast Flow, соединенные стабильными эфирными связями, группы иминодиуксусной кислоты. Сефароза ®6B это поперечносшитая агароза, 6% Используют буферный раствор, предпочтительно фосфатный буфер. Фосфатный буфер, который используется в данных целях, содержит высокую концентрацию хлорида натрия, составляющую примерно 0,5 М при нейтральном или слабощелочном pH раствора, а именно, примерно при 6.7 8, предпочтительно, когда значение pH равно примерно 7.2. Высокая концентрация соли и близкое к нейтральному, значение pH, равное примерно 7.2, помогают максимизировать связывание активного интерлейкина-4 и свести к минимуму связывание других протеинов в колонке. Предпочтительным хелатообразующим металлом является кобальт, хотя в качестве хелатообразующих металлов могут быть использованы и другие цинк, медь или никель. После завершения связывания колонку промывают равновесным буфером, содержащим 20 мМ фосфата натрия, pH равно 7.2 и 0.5 М хлорида натрия. И, наконец, активный ИЛ-4 изократически элюируют при pH 6.0 фосфатным буфером, содержащим 0.50 М хлорида натрия.
4. Раствор интерлейкина-4 очищают далее методом гель-фильтрационной хроматографии на эксклюзивной колонке Sephacryl, предпочтительно Sephacryl® S 200 HR или S 100 HR, которая представляет собой поперечносшитые сополимеры аллилдекстрана и N, N'-метиленбисакриламида, который выпускается Pharmacia уравновешивают 10 мМ цитратом натрия, pH 4.5 после концентрирования до 20 мг/мл при pH 4.5. Собранный очищенный раствор активного ИЛ-4 представляет препарат 95 99% чистоты.
На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность предпочтительного (человеческого) ИЛ-4, используемого в изобретении; на фиг. 2 дано графическое изображение роста числа нейтрофильных клеток, обнаруженное у киномологов обезьян при введении им ИЛ-4; на фиг.3 графическое изображение результатов, указывающих на активацию и дифференцировку, достигаемую при обработке HL -клеток ИЛ-4; на фиг.4 графическое изображение результатов, указывающих на активацию и дифференцировку, достигаемую при обработке U-937 клеток ИЛ-4.
В изобретении может быть использован любой подходящий ИЛ-4. Недавно были клонированы комплементарные для ИЛ-4 ДНК (с-ДНК) и определены последовательности рядом лабораторий, например, Yokoto et al. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 83: 5894-5898 (1986)(человеческий); Lee et al. Proc. Natl. Akod. Sci. USA 83: 2061-2065 (1986) (мышиный): и Noma et al. Nature 319,640-646 (1986) (мышиный). Lee и др. в работе J. Biol.chem. 263:10817 (1988) описали получение рекомбинантного человеческого ИЛ-4 в CHO-клетках. ИЛ-4 также может быть коммерчески доступным продуктом, его выпускает Genzyme Corporation, Boston, Massachusets (человеческий и мышиный). Кроме того, нерекомбинантный ИЛ-4 был выделен из суперпатантов кондиционированной среды различных клеточных культур, например, см. Sanderson et al. Proc.Natl. Acad.USA 83: 437-440 (1986) (мышиный): Grabstein et al. J. exp. Med 163: 1405-1413 (1985) (мышиный) Ohara et al. J. Jmmunol. 135: 2518-2523 (1985) (мышиный BSF-1): Bretler et al. J.Jmmunol. 133: 251-255 (1984) (человеческий BCGF): и Farrar et al. I.Immunol. 131: 1838-1842 (1983) (мышиный BCGF). Описания всех вышеперечисленных статей были использованы здесь в качестве материала для определения ДНК и аминокислотных последовательностей и способов получения подходящих ИЛ-4 материалов для использования в изобретении.
Предпочтительно, когда ИЛ-4, используемый в изобретении представляет человеческий ИЛ-4, и наиболее предпочтительно, когда он представляет вариант человеческого ИЛ-4 с последовательностью, описанной в работе Yokoto et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5894-5898 (1986) и РСТ патентной заявке N 87/02990, опубликованной 21 мая 1987). Описания вышеупомянутой статьи и РСТ заявки также представляют материал, на который мы здесь ссылаемся.
В соответствии с изобретением млекопитающим вводят эффективное количество ИЛ-4 с целью увеличения числа моноцитов и/или гранулоцитов, которыми могут быть любые из перечисленных далее клеток: полиморфоядерные клетки, эозинофилы и/или базофилы. Таким эффективным количеством считается любое количество ИЛ-4, которое в значительной степени увеличивает число нейтрофилов, причем рост, по крайней мере, на 25% предпочтительно -на 50% рассматривается как значительный. Ежедневно предпочтительно вводить от 0,1 до 30 мкг предпочтительно человеческого ИЛ-4 на килограмм массы тела. Более предпочтительно вводить ежедневно от примерно 1,0 до примерно 15 мкг на килограмм массы тела, а наиболее предпочтительная доза составляет от примерно 3,0 до примерно 10 мкг на килограмм массы тела ИЛ-4.
Количество, частота и длительность приема может варьироваться в зависимости от таких факторов, как уровень нейтрофилов и моноцитов (т.е. в зависимости от степени тяжести моноцитопении или гранулоцитопении), возраста больного, питания и т. д. Обычно в начале лечение проводят ежедневно, а затем препарат можно вводить периодически на протяжении жизни больного. Дозировку и частоту введения препарата можно определить путем скрининга на начальной стадии числа нейтрофилов и величины эффекта воздействия ИЛ-4 на рост числа нейтрофилов. Дозировка должна быть направлена на увеличение числа нейтрофилов до приемлемого уровня примерно в 1000 всех нейтрофилов и/или до числа всех моноцитов 100 для того, чтобы был достигнут желательный эффект, который необходимо определять индивидуально для каждого больного в зависимости от клинического состояния Дополнительно можно провести ряд селективных манипуляций, связанных с увеличением одной или более субпопуляций лимфоцитов.
Для дополнения действия ИЛ-4 на рост нейтрофилов может оказаться полезным его введение совместно с другими биологически и/или фармацевтически активными соединениями. Например, ИЛ-4 можно сочетать с другими средствами, увеличивающими количество лейкоцитов (например, с колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов). Также может оказаться полезным сочетание ИЛ-4 с другими интерлейкинами, например, с ИЛ-1 и/или ИЛ-3 и/или ИЛ-7 в целях увеличения общего количества лейкоцитов и нейтрофилов. ИЛ-2 в сочетании с ИЛ-4 может продуцировать селективное увеличение специфических и полезных функций Т-клеток, и ИЛ-4 в сочетании с ИЛ-5 и/или ИЛ-6 может оказаться полезным в специфичном усилении функции и/или числа нормальных и/или новообразованных B-клеток. ИЛ-4 может оказаться также полезным при увеличении утилизации химиотерапевтических препаратов, включая, но не ограничиваясь, алкилирующие средства, митотические веретенные яды или противоопухолевые антибиотики. Увеличивая число лейкоцитов или функциональный или дифференцировочный статус специфичных субпопуляций клеток можно увеличить эффективность вышеупомянутых терапевтических средств. Сочетание интерферона, например, интерферона гамма или альфа, с ИЛ-4 может также оказаться полезным при увеличении числа и функций некоторых лейкоцитов, например, T-клеток субпопуляций. В некоторых случаях для достижения необходимого биологического эффекта вместо нативных молекул могут вводиться антитела к любым вышеупомянутым интерлейкинам или интерферонам.
Назначаемый препарат можно вводить внутривенно, назально, парэнтерально, перорально, подкожно, внутримышечно, местным или чрезкожным путем или любым другим путем. ИЛ-4 можно вводить в любой из традиционных выпускных форм. Парэнтеральные препараты включают стерильные растворы или суспензии. Ингаляции могут осуществляться путем назального или орального распыления или путем вдувания. В качестве форм для местного применения могут быть кремы, мази, лосьоны, трансдермальные системы (например, с традиционным резервуаром или матрицы типа пластырей) и т.п.
Составы и фармацевтические композиции, предлагаемые для использования в виде вышеперечисленных выпускных формах, могут быть получены с использованием традиционных фармацевтически приемлемых носителей и добавок с применением стандартных способов.
В настоящее время, ИЛ-4 предпочтительно вводят внутривенно. Растворы могут быть получены из лиофилизированных порошков и могут дополнительно содержать консерванты, буферы, диспергирующие добавки и т.п.
Предпочтительно проводить восстановление ИЛ-4 10 ммоль цитратным буфером, свободной от консервантов стерильной водой с тем, чтобы концентрация ИЛ-4 не превышала 100 мкг на мл, вводить его путем непрерывной внутривенной инфузии или путем внутривенных инъекций. Для непрерывных инъекций суточная доза может быть доведена до 5 мл нормальным физиологическим раствором, и раствор вливается с помощью механического насоса или под действием собственной тяжести.
Действие ИЛ-4 на увеличение количества нейтрофилов у млекопитающих может быть зафиксировано следующим протоколом испытания:
Действие человеческого ИЛ-4, полученного из E. coli и имеющего аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1, оценивали путем наблюдения за кинологичными обезьянами в течение месяца. ИЛ-4 один раз в сутки внутривенно, дозировка составляла 2, 10 и 25 мг/кг/сут. Гематологические клинические химические исследования образцов крови, взятых у обезьян, проводились в выбранное время до, в течение и через месяц после завершения курса лечения препаратом, содержащим ИЛ-4. Данные были получены на гематологическом анализаторе Coulter S +4 (суммарное количество лейкоцитов) и путем ручного дифференциального подсчета. Результаты, приведенные на фиг.2, свидетельствуют об увеличении количества нейтрофилов, за счет использования изобретения.
Активация нейтрофилов, достигаемая за счет введения ИЛ-4 может быть продемонстрирована в следующих испытаниях.
Способы.
A. Выделение клеток. Вся кровь, взятая у киномологичных обезьян через четыре недели после прекращения дозировки ИЛ-4 (25 мг/кг) или растворителя была подвергнута гравитационной седиментации через 6% декстран с последующим растворением гипотоническим солевым раствором или Трис-хлоридом аммония для выделения лейкоцитов.
B. Дрожжевой фагоцитозный анализ. Фагоцитозный анализ осуществили путем добавления 300 мл человеческой сыворотки, 50 мл убитых теплом клеток дрожжей (108 организмов на мл) в пробирки из полипропилена размером 12 x 75 мм, содержащих примерно 5 x 105 изолированных клеток лейкоцитов. В течение 90 минут провели инкубирование в гидровращающейся водяной бане при 37oC. После центрифугирования суспензию клеток окрасили 0,4% раствором трипана голубого и 0,2% раствором эозина Y в солевом физиологическом растворе. Не подвергшиеся фагоцитозу дрожжи, окрашенные в пурпур и подвергаются фагоцитозу клетки, оставшиеся неокрашенными, позволяют провести аккуратное определение авидности ( число дрожжевых клеток, подвергшихся фагоцитозу), также как и определение процента фагоцитоза. Средние значения, полученные по этим параметрам, были использованы для расчета фагоцитарного индекса для каждой обезьяны. Полученные данные были обработаны в соответствии с критерием Стъюдента, и проведено сравнение фагоцитарного индекса, полученного у обезьян, которым вводили ИЛ-4 и у контрольных обезьян, которым вводили только растворитель. Результаты представлены в табл. 1.
aКлетки, полученные от обезьян, которые в течение 4-х недель получали ИЛ-4 или растворитель, после 4 недель свободных от лечения.
bСреднее количество дрожжей на клетку ≠ количеству дрожжей, подвергшихся фагоцитозу, на 60 клеток от каждой обезьяны; Среднее значение ± стандартная ошибка значения (SEM), рассчитанная на число посчитанных клеток.
c Процент фагоцитарных клеток клеток переваривающих дрожжи на суммарное число клеток х 100.
d Фагоцитарный индекс среднее количество дрожжей на клетку x% агоцитарных клеток.
eСреднее значение ± SEM индивидуальных значений для обезьян.
fP<0.002, критерий Стъюдента, контроль относительно ИЛ-4.
gP<0.14, критерий Стъюдента, контроль относительно ИЛ-4.
C. Анализ по нитросинему тетразолию NBT. Проведя выделение, как описано выше, лейкоциты из киномологичных обезьян были ресуспендированы в 0.2 мл RPMI-1640, содержащих 2% инактивированной теплом эмбриональной бычьей сыворотки, и помещены в пробирки из полипропилена размером 12 х 75 мм. В каждую пробирку с клетками добавили 0.1 мл раствора 2 мг/мл нитросинего тетразолия (NBT) в 2% RPMI и 0.1 мл 0.25 μH бульона свежеприготовленного форбол12-миристат13-ацетата (PMA) в 2% RPMI. Клеточную суспензию инкубировали на водяной бане при 37oC в течение 30 мин. После инкубирования пробирки центрифугировали и после этого отделяли супернатантные слои от дебриса. Прежде чем проэкстрагировать N,N-диметилформамидом дебрис сушили в течение 1 ч при 37oC. К дебрису добавили один мл ДМФ, интенсивно перемешали и немедленно проинкубировали в течение 20 мин при 85oC. Пробирки процентрифугировали, и окрашенный ДМФ был отобран для спектрофотометрического анализа, проведенного при λ 560 нм относительно неокрашенного (бесцветного ДМФ). Все измерения осуществлялись в пределах 30 мин завершения инкубации.
Расчет восстановленного NBT (NBF мг/мл) был сделан с использованием стандартной кривой, полученной с использованием серии разбавлений 2 мг/мл NBT бульона, капли которого наносились на полоски фильтра Whatmar и сушились. Для получения стандартной кривой NBT восстанавливали путем выдержки в 1 мМ растворе аскорбата в 0.2 М NaOH в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте. Фильтровальные полоски эстрагировались ДМФ и определение проводилось при 560 нм. Расчет NBF на клетку проводили, поделив величину NBF, мг/мл на число клеток, содержавшихся в мл образца. Результаты представлены в табл. 2.
aКлетки, полученные от обезьян, которые в течение 4 недель получали ИЛ-4 или растворитель, после 4 недель, свободных от лечения.
bNBF пикограмм/клетка, расчитанный из величины NBF г/мл на общее число клеток образце. Число клеток определяли на гемацитометрическом счетчике, используя раствор Turk для анализа.
cСреднее значение ±SEM индивидуальных значений для каждой обезьяны.
dP<0.02, критерий Стъюдента, контроль относительно ИЛ-4.
Полученные выше результаты свидетельствуют о том, что фагоцитарный индекс лейкоцитов, полученных от ИЛ-4 обработанных обезьян через четыре недели после отмены ИЛ-4 значительно увеличился по сравнению с лейкоцитами, полученными от контрольных животных. Это повышение фагоцитарного индекса связано с увеличением процента клеток, переваривающих дрожжи. Наблюдалось небольшое увеличение авидности клеток/число дрожжей инвазированных на клетку/, выделенных из группы, обработанной ИЛ-4, через четыре недели после отмены ИЛ-4. Реакция восстановления красителя-нитросинего тетразолия, определенная по количеству NBF в пикограммах на клетку, возросла в клетках, полученных от ИЛ-4 обработанных обезьян, в сравнении с клетками, полученными от обезьян контрольной группы.
Эти два метода анализа- клеточное переваривание дрожжей и восстановление NBT красителя определяют фагоцитоз и метаболические измерения(респираторный всплеск), являющиеся важными стадиями в последовательности событий, приводящих к деструкции инфекционных агентов. Рост полученный по этим двум методам, свидетельствуют о том, что ИЛ-4 может увеличивать или усиливать фагоцитарную реакцию.
И 937 это линия клеток (АТСС CRL 1593), выделенная из злокачественных клеток, полученных от больного диффузионной гистиоцитарной лейкемией (Sunstrom et al, Int. J. Cancer 17: 565 577 (1976)). Эта линия клеток обладает теми же характеристиками, которые характерны для незрелых моноцитов (т.е. эта клетка-незрелый моноцит).
HL-60 это линия клеток (АТСС CCL 240), выделенная из больного с диагнозом острая промиелоцитарная лейкемия. Характеристики этих клеток свидетельствуют о том, что они представляют незрелые нейтрофилы.
ИЛ-4 способен индуцировать дифференциацию этих двух незрелых клеток, как определено по увеличению фагоцитарной функции, рост активации гексозомонофосфатного шунта (NBT восстановление), представляющего необходимый метаболический путь фагоцитоза, увеличению процента клеток, способных окрашиваться красителем, специфичным для зрелых нейтрофилов (нафтолхлороацетат эстераза) или для зрелых моноцитов (альфа-нафтилацетат эстераза) и по увеличению клеток, позитивных для поверхностных маркеров, что продемонстрировано методом FACS (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции) для зрелых моноцитов или зрелых нейтрофилов.
Действие ИЛ-4 на созревание миелоидных клеток может быть продемонстрировано следующими исследовательскими процедурами.
NBT (нитросиний тетразолий) восстановление в формазан.
Измерение гексозомонофосфатного шунта активации, связанное с респираторным всплеском/перфорацией. (Muller et at. Agentse Actlons: II 384 (1981): Baehner, et at. New End. J.Med.278:971 (1968):Salih and McCord, J, Clih, Jnvest, 54:1005 (1974). Проведена стандартизация для работы с линиями клеток И-937 и HL-60.
1. Выращивают клетки-мишени в количестве, достаточном для проведения IE6 клеток (лунка анализа). Центрифугируют на Sorwall в течение 5 мин, 1200 об. /мин. Промывают ЗФР (PBS) и ресуспендируют.
2. Переносят клетки в RPM1+2% ФБР для аликвотирования 0,2 Мл в лунку в количестве, достаточном для проведения анализа.
3. Аликвоту клеток объемом 0,2 мл помещают в лунку 24-луночного плоскодонного планшета.
4. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл 20 mМ М ФМА (форболмиристатацетат) в 2%
5. В каждую лунку добавляют 0,1 мг 2 мг/мл NBT в 2%
6. Инкубируют планшет в течение 30 мин при 37oC.
7. Сразу же отбирают 0,1 мл клеток и центрифугируют при 200 об./мин (небольшое ускорение) в течение 5 мин, используя Shahdon Cytosrin
8. Проводят контрастное окрашивание с помощью Dif-Qick системы и закрывают покровным стеклом для проведения подсчета.
Описанный выше анализ по фагоцитозу дрожжей был также применен для обеих линий клеток с использованием той же самой процедуры.
ОКРАШИВАНИЕ PMNS НА ЭСТЕРАЗУ НАФТОЛ А-Д ХЛОРАЦЕТАТОМ
Yam et al. Am.J.Clih. Path, 55: 283 (1971).
Li et al. j.Histochem. Cvtochem 21:(1973).
Проведена стандартизация для окрашивания клеток линии HL-60.
1. Циентрифугируют 1-5Е5 клетки при 200 об./мин небольшое ускорение в течение 5 мин на микроскопический препарат, используя Shandan Cvtospin
Фиксируют препарат в течение 2 мин в фиксативе цитрат-ацетон MeOH при комнатной температуре.
3. Промывают в деонизованной воде (д.и.) и сушат на воздухе в течение 20 мин.
4. Окрашивают препараты в AS-D красителе в течение 30 мин при 37oC в темноте.
5. Промывают трижды д.и. водой.
6. Проводят контрастное окрашивание в кислотном гематоксилиновом теле в течение 5 мин.
7. Промывают трижды в д.и. воде, сушат на воздухе, закрывают покровным стеклом для проведения подсчета.
Фиксатив: цитрат-ацетон-MeOH. Разбавляют концентрат цитрата д.и. водой в соотношении 1:9. Добавляют 18 мл раствора цитрата 27 мл ацетона и 5 мл абсолютного метилового спирта (MeOH).
Хранят при комнатной температуре. Готовят ежедневно.
AS-Д краситель.
Разбавляют Trizmal д.и. водой в соотношении 1:9. Подогревают 50 мл разбавленного Trizmal до 37oC и добавляют при постоянном перемешивании содержимое одной капсулы Fast Corihth V com. После того, как соль полностью раствориться, добавляют 2 мл раствора Napht ol AS-Д хлороацетата. Раствор становится мутным. Продолжают перемешивание 25-30 мин и добавляют в coplin банку. Не фильтровать.
AS-Д раствор.
Растворяют одну капсулу нафторл AS-Д хлороацетата (20 мг) в 2 мл диметилформамида. Готовят непосредственно перед употреблением. Используют - нафтол AS-Д хлороацетат из набора Sigma 90.
Окрашивание макрофагов на эстеразу альфа-нафтил-ацетатом
Yam et al, Am. J.Clih. Path 55:283 (1971).
Li et al, J. Histiochem, Cytochem 21:1 (1973).
Проведена стандартизация для окрашивания клеток линии И-937
1. Центрифугируют 1-5Е5 клетки при 200 об./мин (небольшое ускорение) в течение 5 мин на микроскопический препарат, используя Shandon Cvtospin.
2. Фиксируют препарат в течение 30 мин при комнатной температуре в фиксативе цитрат-ацетон-MeOH.
3. Промывают в дистиллированной или деионизованной воду и сушат на воздухе в течение 20 мин.
4. Окрашивают препараты в NE красителе при 37oC в течение 30 мин в темноте.
5. Промывают трижды в дистиллированной или деионизованной воде.
6. Проводят контрастное окрашивание в гематоксилине MayerS в течение 55 мин при комнатной температуре.
7. Промывают в дистиллированной или деионизованной воде, сушат на воздухе, закрывают покровным стеклом для проведения подсчета. Фиксатив: Цитрат-ацетон-MeOH.
Разбавляют концентрат цитрата дистиллированной или деионизованной водой. Добавляют к 18 мл разбавленного раствора цитрата 27 ил ацетона и 5 мл абсолютного метилового спирта. Хранят при комнатной температуре. Готовят ежедневно.
NE краситель.
Разбавляют Trizmal 7.6 моно-трис/гидроксиметил/-аминометан малеат, pH 7.6дистиллированной или деионизованной водой Подогревают Трисмал 7,6 до 37oC и добавляют при постоянном перемешивании содержимое одной капсулы Fast Blue RR соли 4-бензоиламин-2,5-диметоксибензол-диазоний хлорид геми[цинк хлорида] соль. После того, как соль полностью раствориться, добавляют 2 мл NE раствора. Раствор желтеет и слегка мутнеет. Продолжают перемешивание в течение 15-20 мин и добавляют coplin банку. Не фильтруют.
NE раствор.
Растворяют одну капсулу (20 мг) альфа-нафтилацетата в 2 мл этиленгликоль монометилового эфира. Готовят непосредственно перед употреблением.
Используют альфа-нафтилацетат из набора Sigma 90.
Результаты приведенных выше процедур с использованием NL-60 клеток и И-937 клеток представлены ниже в табл. 3 и 4.
Табл. 3 действие ИЛ-4, выделенного из E.coli на функцию и дифференцировку HL-60 клеток.
a HL-60 клетки, инкубированные в течение 6 дней в среде, содержащей обозначенные концентрации ИЛ-4 или ДМСО. Культуры клеток обрабатывались ИЛ-4 или ДМСО на третий день.
aСреднее ±SEM четырех отдельных экспериментов; среднее количество дрожжей на клетку ≠ количеству переваренных дрожжей на 30 клеток.
c% фагоцетарных клеток клеток, переваривающих дрожжи (общее число клеток X 100), среднее значение ±SEM из 4-х отдельных экспериментов.
dфагоцитарный индекс; cреднее количество дрожжей на клетку X% фагоцитарных клеток.
e% клеток положительных в NBT/100 клеток; cреднее ±SEM из четырех экспериментов.
f% клеток положительных к хлорацетату эстеразной активности (100 клеток); cреднее из четырех экспериментов.
gP≅0.05; определение по критерию Стъюдента, среда относительно ИЛ-4 или ДМСО обработанных групп.
n P≅0.10; определение по критерию Стъюдента; cреда относительно ИЛ-4 или ДМСО обработанных групп.
а a 937 клетки, инкубированные в течение 6 дней в среде, содержащей обозначенные концентрации ИЛ-4. Культуры обрабатывались на третий день.
bсреднее количество дрожжей/клетка ≠ количество переваренных дрожжей на 30 клеток; среднее ±SEM из 4-х экспериментов.
c% фагоцитарных клеток≠ клетки, переваривающие дрожжи (общее количество клеток X 100); среднее ±SEM из 4-х экспериментов.
d фагоцитарный индекс; среднее количество дрожжей/клетка X фагоцитарных клеток; cреднее ±SEM из 4-х экспериментов.
e клетки положительные к NBT/100 клеток; среднее ±SEM из 4-х экспериментов.
f% клеток положительных к E активности/ 100 клеток; cреднее SEM из 4-х экспериментов.
gP≅0.05, определение по критерию Стъюдента, среда относительно ИЛ-4 обработанных групп.
nP≅0.10, определение по критерию Стъюдента, среда относительно ИЛ-4 обработанных групп.
Клеточный сортер с возбуждением флуоресценции (FACS)
Анализ поверхностных маркеров моноцитов и нейтрофилов
HL-60 и U-937 клетки инкубировались в колбах T-75 при 37oC и 5%-ная CO2 с возрастающими уровнями ИЛ-4 (рекомбинантный человеческий ИЛ-4, произведенный E. coli (pr ИЛ-4), 8-ИЛЕ-1002) или без ИЛ-4-контрольный вариант; клетки гидролизовали и обрабатывали на 3 день. В 1, 3 и 6 дни клетки удаляли, промывали RPM1 1640 и блокировали человеческим, аггрегированном при нагревании иммуноглобулином IgG для снижения потенциала Fc интерференции. После повторной промывки RPM1 1640 клетки ресуспендировали в 50 μл разбавленного антитела (см. табл. 5 для панели моноклональных антител) и инкубировали в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали в ФБР, ресуспендировали в 100 μл разбавленного флуоресцеинизотиоцианата, сопряженного с козлиным-анти-мышиным IgG или с IgG26 и проинкубировали в течение 30 мин на льду. После инкубирования вторичных антител клетки промывали повторно в ФБР, затем ресуспендировали в 1 мл ФБР и провели их цитофлуорометрический анализ на Backton-Dickinson Facscan. Изотипический контроль по мышиным IgG2 и IgG1 и контроль вторичных антител был проведен для превышения положительных клеток над основным уровнем экспрессии (т.е. ИЛ-4 индуцированный повышенной экспрессией).
Результаты, полученные в результате проведения FACS анализа приведены на фиг.3 и 4.
Конструирование Плазмиды pdhfrs Ральфа 263, экспрессирующей человеческий ИЛ-4
Конструирование плазмид pSRα CAT196, pcDSRd-205, pcDhIL-4 клон 125 и pcDS Rα 224 описано в работе Такеве et al. Molecular and Cellueur Biology 8: 466 477 (1988); и Yokoto et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5894 5898 (1986). Как видно из фиг.1 плазмида pcD- SRα -205 была сконструирована путем тримолекулярного фрагмента из PSRα -CAT 196, 434 bpXh oL Sstl экзонинтронного сочленения (SJ) и 5' мышиного ИЛ-4 (mIL 4) фрагмента из pcD137 и 3221 bpSstl Ncol фрагмента, а также из pcD137, содержащего 3' мышиный ИЛ-4 с ДНК, области полиаденилирования SV 40 и pBR 322, полученного из скелета плазмиды, содержащей источник репликации, и ампицилинустойчивого гена. Делеция G C сегмента из pcD-hil 4 клона 46 была произведена следующим образом. Yoko to al, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 83:5894 -5898: Плазмид pL1 Окауама Berga (Окауама and Berg, Molecular and Cellular Biology 3:280 289 (1983) рестриктировали с помощью Psт1, и четыре нуклеотида удалили за счет 3'-5'-экзонуклеазной активности T4-полимеразы. Bg III линкеры лигировали к "флеш"-ДНК концам, затем провели рестриктирование, использовав BgIII и Hind III. HindIIIBgIII фрагмент, содержащий SV 40 последовательность PL 1 изолировали и поместили в BgIII/HindIII рестриктированный pcD-МССГ/Yokoto et al. Proc Natl. Acad. Sci USA, 81: 1070 1074 (1984) для получения промежуточного плазмида 101. Очищенный 311 bp•Pst фрагмент из плазмиды pcD-hIL-4-клона 46 был рестриктирован с помощью Spu3A-1, который освобождает 163 bp фрагмент с подвесками, совместимыми с BgIII. 162 bp фрагмент сшили с BgIII, рестриктированный, p101, получив промежуточный 112. Hind III/NheI фрагмент p112, содержащий SV 40 и последовательности c-ДНК человеческого ИЛ-4, пришили в HindIII/Nhe1 рестриктированной ДНК клона 46, получив pcD-hIL-4 клона 125, содержащую начальный промотор SV40, экзон-интронное сочленение SV 40 и полную с ДНК человеческого ИЛ-4 с выпавшим G C сегментом (хвостом). Плазмид pcD SRα 224 был сконструирован путем замещения небольшого Xh o1 фрагмента pcДSRα205 / содержащего SY и мIL -4 c ДНК/ небольшим фрагментом XXo1 pcDhIL - 4 клона 125, содержащего SJ и hIL 4 с ДНК с выпавшим G C сегментом, как описано выше.
Сайт Sall был интродуцирован в pMTVdhfr/Lee et al. Nature, 294: 228 - 232 (1981) путем EcoR1/BamH1 рестрикции, вставки Klenow полимеразы в подвеску и лигирование к окатнуклеотибному линкеру Sa11, как показано на фиг.1. Плазмида pMTVdhfr 259 затем испытывает недостаток боковых сайтов для EcoRI и BamHI, и область между ними замещают SaII линкером. SaII фрагмент pcD- SRα 224, содержащий SRα промотор, SV40SJ, человеческую ИЛ-4 с ДНК и факторы полиаденилирования SV 40, вставили в единственный SaII сайт pMT Vdhfr 259. Окончательный плазмид, экспрессирующий человеческий ИЛ-4, adhfp-SR альфа 263, содержит следующие элементы, против часовой стрелки от SaII сайта:
1. Ампицилинрезистентный ген и источник репликации из pBR322.
2. MMTVLTR drivch pdhfr единица экспрессии из pMTVdhfr.
3. SR альфа промотор.
4. SV40 образованное экзон-интронное сочленение.
5. cДНК человеческого ИЛ-4.
6. SV 40 образованный фактор полиаденилирования.
Последовательность cДНК человеческого ИЛ-4, присутствующая в векторе, та же, что и в pcD-HIL-4 клона 46, приведенная Yokoto et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 5894-5898 (1986).
Амплификация DHFR гена и селекция S1 линии ИЛ-4
Мутантные клетки яичника китайского хомячка с недостаточностью дигидрофолат редуктазной активности /CHOdhfr-/ широко используются для севрхпродукции различных рекомбинантных протеинов. /Kaufran et al. Molecular and Cellular Biology, 5:1750-1759 (1985). CHO-dhfr мутантные клетки имеют оксотрофные потребности по гипоксантину, тимидину и глицину. Векторы экспрессии, включающие dhfr маркер, могут быть использованы для дополнения этой мутации. Амплификация гена (увеличения числа копий до 1000х) может сопровождаться у растущих клеток увеличением концентрации метотрексата, являющегося аналогом фолата. Амплификация интегрированного рекомбинантного dhfr локуса в геноме приводит к соответствующему увеличению числа копий единиц экспрессии для гена, представляющего интерес (Ringhold et al. J. Mol. Applied Geneics 1165-175 (1981); Kaufman et al. EMBO. 6: 187-1963 (1987).
Плазмида ДНК, имеющая кодирующую последовательность для dhfr и человеческого ИЛ-4 (pdhfr-SRL 263) была сконструирована так, как описано выше. Трансфекция pdhfr SRα 263 в линию клеток ДХВ-11СНО-dhgr была осуществлена по методу осаждения кальций фосфата (Graham and VanderEb, Virology, 52: 546 (1978). Трансформанты были выбраны в селекционной среде ДМЕМ (модифицированная по способу Дульбеко среда игла), в которой наличествует недостаток гипоксантина и тимидина. Для первого цикла амплификации был выбран клон, обозначенный 3В12. Клон 3В12 вырастили в a MEM-среде минимальная поддерживающая среда игла/, содержащей 40 нМ метотрексата (МТХ) пока отбирались резистентные клоны. Клон, обозначенный 3В12 А26 был использован для дальнейшей амплификации с mм МТХ. После второго цикла селекции лекарственного средства, клон, обозначенный 3В12-А26-19 был выбран для дальнейшего развития. Этот клон адаптировали к росту в суспензионной среде с 10% NU Serum TMV и субклон, обозначенный ИЛ-4 S1 был выбран для широкомасштабных исследований.
Для того, чтобы приготовить фонд клеток Master (МСВ) две исходные роллерные колбы объемом 100 мл, содержащие ИЛ-4 S1 клетки, были использованы. Клетки были проведены через два дополнительных обмена ростовых сред и выращены в роллерных колбах объемом 100 мл (ростовая среда это базальная среда плюс 10% сыворотки, например, NUSerum TMV). Клетки из каждой колбы собрали, промыли, ресуспендировали в 10 мл морозостойкой среды, объединили и в асептических условиях распределили по стерильным ампулам для хранения клеток объемом примерно 2 мл. (морозостойкая среда это базальная среда плюс 20% сыворотки, например, NUSerum TMV плюс 10% диметилсульфоксида). Ампулы были постепенно заморожены при -70oC и хранились в жидком азоте.
Клетки из трех замороженных ампул были оттаяны и распределены в виде суспензии в ростовой среде для 4 6 поколений в роллерных колбах с увеличивающимся объемом от 100 мл до 3 л. Клетки собрали путем центрифугирования, промыли и ресуспендировали в морозостойкой среде. Суспензию клеток в асептических условиях распределили по стерильным ампулам объемом примерно 2 мл для хранения. Ампулы постепенно заморозили при -70oC и хранили в жидком азоте для создания МСВ.
Фонд рабочих клеток Master (MWCB) был приготовлен из МСВ. от 1 до 3 ампул МСВ оттаяли и распределили клетки в колбы Томпсона в суспензии для 4 6 поколений в колбах, с возрастающим до 3 л объемом. Клетки собрали, промыли, ресуспендировали в морозостойкой среде и разделили на равные порции и заморозили, как это описано выше для МСВ. MWCB хранится также в жидком азоте.
Продуцирование ИЛ-4 проводилось в биореакторе объемом от 50 до 200 л. Для того, чтобы начать продуцирование одну замороженную ампулу из MWCB оттаяли и инокулировали в Т-75 колбу. После инкубационного периода в течение которого концентрация клеток достигает 100% конфлуэнтности, клетки трипсинизируют и инокулируют в две Т-75 колбы (возможно использование Т-160 колбы). Эти колбы снова инкубировали до 100% конфлуэнтности, и трисинизированные клетки были использованы для инокуляции 100 мл роллерной колбы.
100 мл роллерная колба инкубировалась до тех пор, пока не был достигнут адекватный клеточный рост и ее содержимое было использовано в качестве инокулума для 250 мл роллерной колбы. Подобная стадия была повторена в колбе объемом 1 л и колбе объемом 3 л, а затем в биореакторе объемом от 10 до 20 л. Клетки из этих биореакторов были использованы в качестве инокулумов для биореакторов объемом 50 и 100 л. Этот реактор -это сначала растущая серия ванн и до достижения адекватной концентрации клеток в них инициировалась непрерывная перфузия среды.
Среда, используемая для выращивания и непрерывной перфузии представляла модифицированную среду Исков, которая может быть дополнена до 10% (например, NU. Serum TM). В процессе продуцирования метотрексат не использовался.
Стадии ферментации проводились в стерильных условиях и в закрытых системах. Ключевые параметры ферментации такие, как температура, pH, перемешивание и аэрация записывались и контролировались на всех стадиях роста и непрерывной перфузии. Асептические пробы брались периодически для определения pH, плотности клеток и проверки стерильности (отсутствие бактерий и грибов).
При сборе адекватного объема кондиционированной среды (перфузата) бульон фильтровали для удаления любых клеток, которые могут в нем присутствовать, и концентрировали путем ультрафильтрации. Концентрат, содержащий неочищенный CHO ИЛ-4 был направлен на окончательные стадии очистки.
Очистка ИЛ-4 от неочищенного НО ИЛ-4 концентрата осуществлялась методом катионообменной хроматографии на сульфонатной колонке (например, S-Сефароза). Эта стадия, как правило, повторялась. Выбранные объединенные фракции из сульфонатной колонки далее затем направлялись для очистки на колонке методом хелатирующей хроматографии (например, кобальт-хелатирующая Сефароза). Выбранные объединенные фракции были затем подвергнуты диафильтрации и сконцентрированы посредством мембранной фильтрации. Концентрат хроматографировался на гель-фильтрационной колонке (например, HRS-200). Объединенные фракции, образующие очищенный ИЛ-4, затем профильтровали и хранили при -20oC или ниже.
Таким образом, способ очистки такого неочищенного CHO ИЛ-4 концентрата активного рекомбинантного человеческого ИЛ-4 включает: /a/ Очистка забуфференного неочищенного раствора активного ИЛ-4 от культивируемой среды CHO-клеток методом катионнообменной хроматографии при pH близкой к нейтральной или слабощелочной для того, чтобы селективно связать ИЛ-4 в колонке, заполненной катионообменной смолой и изократическое элюирование ИЛ-4;
/b/ Пропускание элюата из стадии /a/ через хроматографическую катионообменную колонку относительно меньшего размера /объем слоя смолы составляет 15% от объема слоя в стадии /a/ при pH среды близкой к нейтральной или слабощелочной, и градиентное элюирование ИЛ-4;
/c/ Очистка элюата из стадии /c/ методом аффинной хроматографии путем пропускания через колонку, заполненную гелем хелатирующей агарозы, при pH среды близкой к нейтральной или слабощелочной, затем последующее элюирование ИЛ-4 из колонки кислотным буфером;
/d/ Концентрирование элюата из стадии /c/ через ультрафильтрационную мембрану (пропускаются молекулы с массой не менее 10.000); и
/e/ Пропускание концентрированного раствора активного ИЛ-4 из стадии /d/ через гель-фильтрующую хроматографию на эксклюзивной колонке при кислых pH среды и сбор очищенного раствора ИЛ-4.
Очистку методом катионообменной хроматографии проводили в две стадии после того, как культивируемую среду CHO-клеток профильтровали для удаления дебриса экстремально больших клеток, затем концентрирования до содержания протеина 100 мг/мл на диафильтрационной мембране и доведения pH среды до 7.1
7.3, предпочтительно до pH 7.2. Мембрана это предпочтительно установленная в камере перемешивания мембрана, которая задерживает все частицы с молекулярной массой, превышающей 10.000, например, это УМ-10 мембрана фирмы AMicon, США или фильтр Pelli con PTGC Cassettes, Millipoze Comp. Bradford, Maass. В первой стадии неочищенная культивируемая среда загружалась в катионообменную хроматографическую колонку, такую как S-Сефароза® Fast Flow (до 100 мг протеина на мл смолы), предварительно уравновешенную фосфатным буфером при pH близком к нейтральной или слабощелочной, например, при pH 6,7 8, предпочтительно 7,2, содержащим 0,12М хлорида натрия. Это приводит к тому, что активный ИЛ-4 остается на колонке, а большинство ненужных протеинов и других примесей проходит через колонку. Активный ИЛ-4 затем изократически элюируют из колонки натрийфосфатным буфером, предпочтительно буфером с pH 7,1 7,3, более конкретно с pH 7,2, 20 мМ натрий фосфатным буфером с примерно 0,26М хлорида натрия. Фракции, содержащие активный ИЛ-4, определение проводилось методом электрофореза в полиакриламидном геле с помощью додецилсульфата натрия и белкового анализа, объединялись, и весь пул доводился до pH 7,2 и 14 мS.
Во второй стадии отрегулированный пул из первой стадии загружают в относительно небольшую катионообменную хроматографическую колонку с объемом слоя смолы составляющем примерно 15% от объема слоя смолы колонки из первой стадии, уравновешенную фосфатным буфером, примеси проходят через колонку. Активный ИЛ-4 элюировали раствором хлорида натрия в градиенте концентраций 1,75 м на объем слоя. Элюирующие буферные растворы состоят из солевого буфера с низким содержанием соли, например, 20 мМ натрийфосфатного буфера, pH. 72, 0.12 M хлорида натрия и солевого буфера с высокой концентрацией соли, например, 20 мМ натрийфосфатногно буфера, pH 7.2 и 0.50 М хлорида натрия. Градиентные фракции, содержащие активный ИЛ-4 (определение проводилось методом электрофореза в полиакриламидном геле с помощью додецилсульфата натрия и белкового анализа), объединялись и pH доводился до pH 7.2 и 45,5 mS.
Пул фракций активного ИЛ-4 после катионообменной хроматографии, чистота которого составляет примерно 60 70% затем подвергали аффинной хроматографии на колонке, заполненной гелем металл-хелатирующий агарозы, полученной путем обработки соединениями металла геля хелатирующей Сефарозы® например, хелатирующей Sepharose® Fast Flow или халатирующей Sepharose® → 6B. Хелатирующие колонки включают две порции в одной колонке. Верхняя часть колонки содержат гель металл-обработанный агарозы, предпочтительно, кобальт обработанного хелатирующего геля Sepharose® Fest Flow, а нижняя часть колонки это необработанный гель Sepharose® Fest Flow. Объемное отношение двух слоев равно примерно 2,3 3,0 объема кобальт обработанного геля хелатирующей Sepharose® Fost Flow на один объем необработанной хелатирующей Sepharose® F. F. Когда пул очищенного раствора ИЛ-4 после катионообменной хроматографии загружают вверху колонки, то раствор проходит через траверсы на нижнюю часть колонки и выходящей из нее поток содержит все оставшиеся примеси.
При использовании буфера с pH близким к нейтральному, предпочтительно 7,2 и предпочтительно, содержащим 0,5М хлорида натрия, молекулы активного ИЛ-4 при аффинной хроматографии связываются в колонке гелем маталл-хелатирующей агарозы, предпочтительно, хелатирующей Sepharose® Fost Flow или Sepharose 6B, при этом значительная часть загрязняющих протеинов проходит через колонку. Активный ИЛ-4 изократически элюируют буфером со слабокислым pH, предпочтительно с pH 6,0, содержащим 0,5M Nacl.
Очищенный раствор активного ИЛ-4 после аффинной хроматографической колонки концентрируют на ультрафильтрационной мембране (пропускает только частицы с молекулярной массой менее 10,000), предпочтительно на мембране, которая задерживает все материалы с молекулярной массой, превышающей 10,000, ее диапазон включает ИЛ-4. Предпочтительной мембраной является УМ-10, выпускаемая Amicon Co. U,S,A. Полученная концентрация достигает 20 мг/мк. Использованы два буфера для диафильтрации, первый это 20 мМ Na-фосфатный буфер с pH 6,0 и 0,5 М концентрацией хлорида натрия, и второй буфер с pH 6,0 и 0,5 М концентрацией хлорида натрия, и второй буфер, это предпочтительно 10 мМ цитрат натрия с pH 4,5.
Концентирированные элюаты активного ИЛ-4 загружают в колонку для эксклюзивной хроматографии, в которой происходит фракционирование протеинов в растворе в соответствии с их молекулярной массой. Типичная колонка это колонка для гель фильтрации, заполненная Sephochyl S 200 HR или S 100 HR (Phormwcia). Sephacryl S 200 HR (высокого разрешения) и S 100 HR представляют поперечносшитые сополимеры аллилдекстрана и N, N - метиленбисакриламида. Их диапазон фракционирования составляет по Dalton's 5000 250000 и 1000 100000, соответственно. К другим подходящим материалам относятся Сефадексы (Pharmacia), Представляющие собой поперечносшитые декстрановые гели. Предпочтительно, когда раствор активного ИЛ-4 загружают в колонку S 200 HR, предварительно уравновешенную 10 мМ цитратным буфером с pH 4,5.
Более предпочтительный вариант включает:
/а/ Пропускание неочищенного буферного раствора активного рекомбинантного человеческого ИЛ-4 из культивируемой среды CHO-клеток через катионообменную хроматографическую колонку, заполненную поперечносшитой агарозой (предпочтительно, S-Sepharose® Fasi Flow) в 20 мМ фосфатном буфере, pH 6,7 8, предпочтительно с pH 7,2, содержащем 0,12 М хлорида натрия при 13 15 mS, предпочтительно при 14 mS, затем изократически элюируют активный ИЛ-4 из колонки 20 мМ фосфатным буфером с pH 7 7,3, предпочтительно с pH 7,2, содержащим 0,26 М хлорида натрия и собирают фракции активного ИЛ-4;
/b/ Раствор ИЛ-4 из стадии /a/ дополнительно подвергают катионообменной хроматографии на колонке, заполненной такого же типа поперечносшитой агарозой, используемой в стадии /а/, но имеющей объем слоя, составляющий примерно 15% объема слоя колонки в стадии /а/, в буфере с pH 7,2 7,5, предпочтительно с pH 7,2, содержащим 0,12 М хлорида натрия, затем элюируют 20 мМ фосфатным буфером с pH 7,2, содержащим градиент концентраций хлорида натрия от 0,12 М до 0,50 М и объединяют фракции, содержащий активный ИЛ-4;
/c/ Объединенные фракции из стадии /b/ активного ИЛ-4 с pH 7,2 подвергают аффинной хроматографии на колонке, заполненной маталхелатирующим агарозным гелем, предпочтительно, содержащей в верхней части колонки порцию геля кобальт-хелатирующий Sepharose® Fast Flow или 6B, а на дне колонки-порцию необработанного геля хелатирующей Sepharose® Fast Flow, объемные соотношения верхнего и нижнего слоев составляют примерно 2,2 3,0 объема кобальтообработанной хелатирующей Sepharose® на один объем необработанной хелатирующей Sepharose®, промывают равновесным буфером, затем элюируют активный ИЛ-4 из колонки фосфатным буфером с pH 6,0, содержащим 0,5 М хлорида натрия и собирают фракции, содержащие активный ИЛ-4; и /d/ Объединенные фракции ИЛ-4 из стадии /c/ концентрируют и подвергают диафильтрации до 20 мг/мл с pH 4,5 на ультрафильтрационной мембране, которая задерживает все частицы с молекулярной массой более 10,000, предпочтительно, когда перемешиваемая камера оборудована такой мембраной как УМ-10, после этого этапа концентрат активного ИЛ-4 пропускают через эксклюзивную хроматографическую колонку /гель-фильтрация/, которая фракционирует протеины, содержащиеся в растворе в соответствии с их молекулярными массами на поперечносшитом сополимере аллилдекстрана и N, N - метиленбисакриламида, предпочтительно это Sephacryl S 200 HR, в 10 мМ натрий-цитратном буфере с pH 4,5 и собирают фракции, содержащие активный ИЛ-4.
В стадии /а/ и в стадии /b/ pH фракций доводят до pH 7,2 и проводимость до 13 15 mS /с помощью 4 MNaCl. Отношение объемов слоев двух катионообменных колонок равно примерно 6,3 объема S-Sepharose в колонке в стадии /а/ и один объем S-Sepharose в колонке в стадии /b/. Катионообменный гель в хроматографической колонке уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером с pH 7,2, содержащим 0,12 М хлорида натрия. Предпочтительно использование в качестве катионообменной смолы-поперечносшитой агарозы, замещенной -CH2-SO
Предпочтительно, когда в стадии /с/ используют металл-хелатирующую агарозу, полученную путем обработки хелатирующей Sepharose® Fast Flow, хотя можно использовать и хелатирующую Sepharose 6B. Sepharoses это продукты, поставляемые Pramacia Fine Chemicals Piscatanay; Предпочтительный способ New Jersey получения полонки, заполненной предпочтительно кобальт-хелатирующей Sepharose для использования в настоящем изобретении состоит в следующем: гель Sepharose суспендируют в растворе 0.02 М ацетата кобальта и промывают деионизованной водой, затем равновесным буфером, т.е. 20 мМ натрийфосфатным буфером pH 7.2 и содержанием 0.5 MNaCl, который пропускают через колонку. Вместо ацетата кобальта могут быть использованы другие соли кобальта, например, хлорид кобальта или сульфат кобальта.
Хроматографическая колонка состоит из одной колонки, содержащей два слоя, первый или верхний слой представляет гель металл-хелатирующей Sepharose®, а второй или нижний слой содержит гель хелатирующей Sepharose, необработанной солью металла. Верхний слой в такой двойной колонке содержит примерно 2.3-3 объема металлообработанной хелатирующей смолы Sepharose, а нижний слой один объем необработанной хелатирующей Sepharose. Предпочтительным металлом является кобальт.
Предпочтительны буфером, используемым для уравновешивания колонок, является 0.02 М фосфатный буфер с pH 7.2 7.5, содержащий 0.5 М хлорида натрия.
В стадии /с/ гель кобальтхелатирующей Sepharose и гель необработанной хелатирующей Sepharose уравновешивают фосфатным буфером, содержащим 0.5 М хлорида натрия, pH буфера 7.2, а адсорбированный активный ИЛ-4 изократически элюируют из кобальтхелатирующей Sepharolse через необработанную хелатирующую Sepharose 0.02 М фосфатным буфером с pH 6.0, содержащим 0.5 М хлорида натрия или альтернативно- буфером с нейтральным pH, содержащим 0.5 М NaCl и /i/ хелатообразующее средство, например, 50 мМ ЭДТА /этилендиаминтетрауксусная кислота/ или /iii/ аналог гистидина, например, 50 мМ имидазола, или /iii/ аминокислоту, например 50 мМ гистидина. Предпочтителен фосфатный буфер с pH 6.0, содержащий 0.5 M NaCl. Элюат, содержащий активный ИЛ-4 собрали. Фракции, содержащие высокие концентрации активного интерлейкина -4/ определение проводилось методом электрофореза с додециосульфатом натрия и белкового анализа/, объединили.
В стадии /d/ элюированные фракции из стадии /с/ сконцентрировали и подвергли диафильтрации, и затем гельфильтрационной хроматографии. Элюированные фракции концентрируют в перемешиваемой камере, оборудованной мембраной, которая задерживает все частицы с молекулярной массой более 10.000, а затем диафильтруют сначала против 0.02 М натрийфосфатного буфера с pH 6.0, содержащего 0.05 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и 0.05 м NaCl, затем натрийцитратного буфера с pH 4.5. Поскольку на этой стадии процесса раствор активного 0/и0/л-4 представляет раствор примерно 90-95% чистоты, то следовательно, концентрированный раствор оставляется на верхней стороне мембраны. Предпочтительная мембрана это УМ-10 производства Am icon So.U.S.A. Полученный концентрат содержит примерно до 20 мг/мл активного ИЛ-4. Концентрированные элюаты активного ИЛ-4 пропускают через эксклюзивную хроматографическую колонку /гель-фильтрация/, в которой происходит фракционирование протеинов в растворе по их молекулярным массам. Типичной колонкой, подходящей для этих целей, является колонка, заполненная Sephacrul S-200 HR или S-100 HR /Pharmacia/. Sephacrues- 200 HR / высокое разрешение/ и S-100 HR- это поперечносшитые сополимеры аллилдекстрана и N, N- метиленбисакриламида, Диапазон фракционирования этих смол лежит в интервале от 5.000 250.000 и от 1.00-100.000, соответственно. Другими подходящими материалами могут быть Cephadehes Pharmacia, представляющие поперечносшитые гели декстрана. Предпочтительно, когда раствор активного ИЛ-4 загружают в колонку, заполненную S-200 HR, предварительно уравновешенную 10 мМ натрийцитратным буфером с pH 4.5. В условиях стадии /d/ концентрат стабильного ИЛ-4 может достигнуть концентрации 20 мг/мл. Это увеличивает емкость и работоспособность гельфильтрационной хроматографии. Фракции элюата, содержащие наиболее высокие концентрации активного ИЛ-4 /определение проводилось по методу электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и белкового анализа/, собирались и объединялись, в результате получили 95 99% чистый раствор активного ИЛ-4.
Выше цитированные ссылки использованы здесь в качестве источников релевантных методов, используемых в процессе конструирования CHO экспрессионных систем для ИЛ-4.
Конструирование и характеристики человеческого ИЛ -46, произведенного E. COli
А. Конструирование плазмиды pR G T857-11, экспрессирующей человеческий ИЛ-4
Конструирование плазмид pAH3, pKGT269-2 и pUC19, экспрессирующих человеческий ИЛ-4, было описано ранее. Wndel et all J. Jnol. Microbiology, 1989 и Janisch- Perron etal, Gene33:103-119,/1985/. Для того, чтобы сконструировать pPGT857-11, pAN3 была переварена рестрикционной эндонуклеазой, Aval. 5' подвесок, созданный этим ферментом, был вставлен с фрагментом Klenow E. soli, RoI I и ДНК была переварена Pvul. 5.8 Kilobase /КВ/фрагмент, несущий ИЛ-4, и last участок был пришит к 1.4 KB Pvu IIPvuT фрагменту pU C19, несущей pUS источник репликации. Следующей трансформацией E.coli 294, одной из ампицилин устойчивых плазмид, экспрессирующих ИЛ-4, несущих pUC источник репликации, была pR GT838-2, как это представлено на рисунке 2.
pR Gt839-2 и pKGT269-2 оба были переварены AatII и PVuI>. 6.7 KB pa meht pRGT 839-2, несущий ИЛ-4 и laci участки были пришиты к небольшому I KB фрагменту из pKCT269-2, кодирующему хлорамфеникольную устойчивость. Реакция лигирования была использована для трансформации E.coli 294. Одним из полученных трансформантов был pR Gt857-11. Как показано на рисунке 2, эта плазмида, экспрессирущая ИЛ-4, обладает хлорамфеникольной устойчивостью, также как и PUC источник репликации. Далее эта плазмида была использована для трансформации E. coli RL 7321.
B.Бактерия-хозяин
Организм хозяина, несущий плазмиду pRGT857-11, которая была использована для продуцирования человеческого ИЛ-4, это E.coliK-12 Штамм это E.coli RL7321, производное E.coli MM294, которая была ранее описана в работе Bolivaretoe, Methodsih Enzymology, 68, 245-267/ Raywu, ed. Acodemic, Press 1979/. Этот штамм, соответствует основным параметрам, установленным для EKI хозяина. E.coli RL7321 был выделен из E.coli MM294 следующим образом:
Стрептомицин устойчивая форма E.coli MM294, обозначенная Ecoli 29294S, была впервые изолирована путем трансдукции первого штамма бактериофагом P1 cm1, c1r100/Miller, J.H.1972 Experimentsin Molecular Genetics. Coldsprings Harbor laboratory. Colds prings Harbor N.J/, выращенном на E.coli PAM163. [Hohnson B.F. 1977. Fine structure mapping and properties of mutations suppressing the ion mutation in Eschericnia coli K-12 and B-strains. Jenetics Res-30: 273-86] Мутация E.coli 294 была вызвана ультрафиолетовым облучением для выделения штамма, имеющего дефекты во внешней структуре мембраны. Клетки облучались в течение 40 секунд УФ лампой. Эта обработка привела к гибели 99,9% клеток, что было определено путем высева на обогащенную среду. Суспензия мутантных клеток была разбавлена и инкубирована при 37oC в течение трех часов в темноте при встряхивании.
В это время бактериофаг T7 дикого типа добавили к 108 тромбоцитообразующим единицам на мл. Бактериофаг T7 используется для селекции с целью обогащения бактериями, имеющими мутации в их внешних мембранах. Поскольку T7 рецептор локализован на липополисахариде, протеине внешней мембраны, некоторые мутации внешней мембраны будут приводить к устойчивости к T7 инфекции. Клетки, имеющие внешние мембраны дикого типа должны быть чувствительны к инфекциям, и вследствие этого должны быть убиты. "Протекающий" фенотип, обсуждаемый ниже, обусловлен увеличенной проницаемостью внешней мембраны. Использование устойчивости бактериофага T7 как индикатора разрушения внешней мембраны показано ранее в работе Brahes et al.J. of Bacteriology 154: 1462-1466,/1983/.
Вслед за T7 инфицированием колбу встряхивали при 37oC до тех пор пока наблюдался лизис клеток /примерно 30 минут/. T7 резистентные клетки были собраны путем центрифугирования и ресуспендированы в 1 мл свежего бульона. Эти клетки были нанесены на TYE/ Триптондрожжевой экстракт-натрий хлорид oC20: 10: 5/ пластин агара и инкубированы при 37oC в течение ночи. Через 24 часа каждая пластина содержала от 30 до 50 колоний. Эти колонии были с поврежденной внешней мембраной. Один метод состоял в том, чтобы наблюдать любое увеличение в утечке RNasee в среду. Отдельные колонии T7 бактериофаг устойчивых клонов были посеяны штрихом поперек свежих TYE пластин агара, которые затем были покрыты 4 мл TYE агара, содержащего 1% дрожжевой РНК /Sigm Corp./ с pH7. После инкубирования с течение ночи при 37oC пластины были орошены 1 MHCl. Величина Гало была использована для определения утечки RNaSe активности штаммов в среду. /Weigand. R.A. Rothfield, Bacteriology), 125: 340-345: 1976/. Вторым индикатором разрушения внешней мембраны E.Coli является потеря роста на агаре Mac Cohkey /Hahcock, R.E.W. Ann.Rev. Microbiology 338: 237-264, 1984/. Одна из тридцати T7 резистентных колоний, проявившая себя особо чувствительной к Maclonkey агару и способная выделять значительные количества периплазменной RNaSe1, была обозначена как RL7.
E. coli была трансформирована pчИЛ-4 экспрессирующим вектором pAH3/рис. 1/. Этот вектор направляет лимфокин через внутреннюю мембрану клетки в периплазму. Отработанная среда из трансформантов была проверена на утечку вестерн-блоттинговым анализом с использованием чИЛ-4 поликлональных антител, описанных ниже. RL7/pAH3 был подвергнут мутации, как и ранее, воздействием ультрафиолета. После выращивания в темноте по крайней мере, в течение двух часов, облученные клетки были высеяны на TYE агаровые пластины, обработанные ампициллином (100μ г/мл) и инкубировались в течение ночи при 30oC. Колонии были рассортированы по методу "двойного диска" для увеличения выделения чИЛ-4, который определяли по более интенсивному развитию окраски в мутантных колониях. Метод двойного диска осуществляли следующим образом:
Клетки, подвергшиеся мутации, разбавили и высеяли / 0,1 мл на TYE агаровые пластины /142 мм в диаметре/, содержащие 100 mг / ампицилина. После инкубирования в течение ночи при 30oC пластины содержали от 500-2000 колоний примерно на 1 мм диаметра. Затем пластины покрыли диском из нитроцеллюлозы диаметром 137 мм /Schleicher Schuell. с размером пор 0,45 μ. Диск осторожно отогнули с одного конца для того, чтобы была возможность постепенного и равномерного увлажнения. Диск сразу же одним движением отслоили, так чтобы колонии были перенесены с агаровой пластины на нитроцеллюлозный диск. Диск представлял собой нитроцеллюлозный диск /или диски/ предварительно помещенный на стерильную агаровую пластину. Пластины затем инкубировались в течение ночи при 30oC. После инкубирования нижний диск /или диски/ отделили от диска, несущего колонии. Фильтры инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре в 10 мМ Трис буфере pH 8,150 мМ NaCl и 0,05% /об./об./ Твина 20/ Bio. Rad, Enzyme 1mm uno Assay/ /TBST/, содержащем 1% BSA/ бычий сыворочный альбумин/. Далее фильтры инкубировались либо с поликлональной кроличьей антисывороткой/ 1: 1500 разбавление в TBST/BSA; использовали для определения общего содержания чИЛ-4/ или с моноклональной антисывороткой /IIB4//1:10 разбавление супернанта гибридомной культуры в TBST/BSA; использовались для определения протеина в нативной конформации/ при комнатной температуре в течение 30 мин. Фильтры были трижды промыты в TBST, затем инкубированы с соответствующими вторичными антителами, связанными со щелочной фосфатазой, в течение 30 мин. Фильтры промывались трижды и окрашивались в субстрате щелочной фосфатазы /Proto Blotsystem by Progmeda Biotec/. Затем блоты сравнили с пластинами из бульона, и колонии, показавшие увеличенное чИЛ-4 специфическо окрашивание, отобрали.
Предлагаемые колонии были отделены от плазмиды путем непрерывного переноса в неселективную среду с последующим штриховым высевом на неселективные TYE пластины. Колонии, которые не росли на пластинах с ампицилином, были проверены на отсутствие плазмиды и затем ретрансформированы плазмидой, экспрессирующей человеческий ИЛ-4, pRGT857-11. Эти клоны были подвергнуты скринингу на увеличенное выделение человеческого Ил-4 при иммуноблоттинге всего питательного бульона, выделенного из 10 мл ферментационных пробирок. Отделение проводилось моноклональными телами к чИЛ-4 /IIB4/, затем следовало связывание щелочной фосфатазой кольего антикрысиного IgC. Один из штаммов, отмеченный как высокопродуцирующий штамм, обозначили RL731.
Как и ранее E.coli RL731/pRGT857-11 был подвергнут мутации при облучении УФ-светом. После необходимого роста в темноте, клетки были высеяны на TYE агар, обработанный антибиотиком и 1 мМ IPTG /изопропил b Д тиогалактозид/. RL731/pRGT857-11 не растет в присутствии индицирующего вещества IPT G. клетки были высеяны с плотностью 104 колониеобразующих единиц на мл. Примерно 5-10 колоний на пластину появилось за период ночной инкубации. Свыше 75 колоний было очищено путем штрихового высевания и проверены на продуцирование чИЛ-4. Уровень продуцирования определяли методом вестерн-блоттинга. Клоны, показавшие наиболее крупные "бэнды" были отделены от плазмид, как и ранее, ретрансформированы pR Gt 857-11 и отобраны для сохранения высокого продуцирования чИЛ-4. Штамм, отобранный по большинству наиболее удовлетворяющих параметров, включая продуцирование и выделение биологически активного чИЛ-4, и продолжающего клеточный рост после индуцирования чИЛ-4 экспрессии, был RL7321.
В процессе ферментации человеческого интерлейкина-4 /чИЛ-4/, продукт выделялся прямо в ферментационный бульон. Зарождающиеся снизу гнезда выделяются для того, чтобы отделить бульон от клеток и затем сконцентрировать чИЛ-4 в бульоне. Существуют два различных способа, позволяющих осуществить эту задачу: мембранный способ и способ с натрийтрихлоруксусной кислотой /ТСА/. В способе с использованием натрий ТСА клетки инактивируют добавлением соли ТСА. После уплотнения клеток pH бульона снижают для осаждения ИЛ-4, и бульон центрифугируют для выделения pr-ИЛ-4 в виде гранул или "сладжа". В мембранном способе используется процесс микрофильтрации и ультрафильтрации для выделения pr ИЛ-4 в виде жидкого концентрата. В этом способе можно использовать различные промывки буфером для увеличения выделения нижних слоев.
Очистки pч-ИЛ-4 от неочищенного концентрата ферментационного бульона проводится путем иммобилизованной металлаффинной хроматографии на металлхелатирующей колонке /например на Zn-Сефараозе/. Выделенные фракции объединяют и очищают методом катионообменной хроматографии на колонке, заполненной сульфированной смолой /например, S-Сефароза/.
Выделенные фракции объединяют, концентрируют и подвергают диафильтрации с использованием ультрафильтрационной аппаратуры, содержащей мембрану, которая пропускает частицы с соответствующим номинальным молекулярным весом, так, что продукт остается в концентрате /например, ультрафильтрационные мембраны Mcllipore PTGC/. Концентрат после фильтрации подвергается дальнейшей очистке методом гельфильтрационной хроматографии /например, на колонке с S-200 HR/. Объединенные фракции, представляющие очищенную массу ИЛ-4 затем фильтруют и хранят при -20oC или ниже.
Способ очистки неочищенного раствора активного рекомбинантного человеческого ИЛ-4 из E.coli таким образом включает:
/а/ Пропускание забуференного неочищенного раствора названного ИЛ-4 с нейтральным или слабощелочным pH и содержащем примерно 0,5-1,5 М хлорида натрия, через аффинную хроматографию на металхелатирующем геле для селективного связывания ИЛ-4;
/в/ Промывание колонки сначала 20 мМ натрийфосфптным буфером с pH 7,2, содержащим 1,0 М хлорида натрия, а затем буфером, содержащим 10% глицерина по объему и примерно 150 мМ хлорида натрия;
/с/ Элюирование связанного ИЛ-4 элюирующим буфером с кислым pH или буфером с нейтральным pH, содержащим хелатообразующее средство-аналог гистидина или аминокислота;
/d/ Обработка элюата активного ИЛ-4 из стадии /с/ методом катионообменной хроматографии на колонке, заполненной S Серфарозой® /поставляемой Pharmacia Fine Chemicals/ при нейтральных: или слабокислых значениях pH среды и проводимости 15mS; S-Сефароза-это поперечносшитая агарозная матрица, с привитыми к ней ионообменными группами -CH2-SO
/e/ Концентрирование элюата из стадии / / на ультрафильтрационной мембране/ мембрана, которая задерживает все частицы с молекулярной массой выше 10.000/;
/f/ Обработка удержанного концентрата из стадии /e/ методом гельфильтрационной хроматографии на эксклюзивной колонке; и /g/ сбор активного очищенного ИЛ-4.
Наиболее предпочтительный вариант включает следующие стадии:
/а/ Пропускание неочищенного раствора активного рекомбинантного человеческого ИЛ-4 через аффинную хроматографическую колонку, заполненную металлхелатирующим агарозным гелем, предпочтительна хелатирующая Sepharose® Fost Flow, в нейтральном и слабощелочном фосфатном буфере, содержащем 1,0 М хлорида натрия;
/в/ Промывание колонки дважды, сначала фосфатным буфером с pH 7,2-7,5, содержащим 1,0 М хлорида натрия, затем фосфатным буфером, содержащим 10 объемных глицерина и 150 мМ хлорида натрия;
/c/ изократическое элюирование активного ИЛ-4 из колонки элюирующим ацетатным буфером с pH 5,0, содержащим 0,5 М и хлорида натрия;
/d/ Очистка активного ИЛ-4 в фосфатном буфере с pH 6,75, проводимостью 15mS, из стадии /с/ методом катионообменной хроматографии на колонке, заполненной S-Сефарозой, уравновешенной 20 мМ натрийфосфатным буфером с pH 6,75 и содержащим 0,12 М хлорида натрия; и затем градиентное элюирование фосфатным буфером с pH 6,75, содержащим 0,12-0,6 М хлорида натрия;
/e/ Концентрирование элюата из стадии /d/ на ультрафильтрационной мембране;
/f/ Обработка концентрированного элюата из стадии /e/ методом гельфильтрационной хроматографии на эксклюзивной колонке, уравновешенной 10 мМ натрийцитратным буфером с pH 4,5;
/g/ Сбор очищенного раствора активного ИЛ-4.
Предпочтительные штаммы E. coli, используемые для получения активного ИЛ-4, очищенного в соответствии с настоящим изобретением, это штаммы RL 2117/pR GT 857-11 и RL 7321/pR GT857-11.
Предпочтительная металхелатирующая агароза, используемая в стадии /а/ - это хелатирующая Sepharose® Fast Flow, хотя хелатирующая Sepharose® 6В также может быть использована.
Sepharoses это продукты, выпускаемые Pharmacia Finee Chemicals, Piscataway New Jersey. Предпочтительный способ получения предпочтительной цинк-хелатирующей Sepharose для колонки, использованной в настоящем изобретении, состоит в следующем хроматографическую колонку загружают гелем промывают деионизированной водой, затем прокачивают через нее соль, предпочтительно раствор ацетата цинка и деионизированную воду, затем прокачивают равновесный буфер, а именно, 20, 20 мМ натрийфосфатный буфер с pH 7,2, содержащий 1,0 М хлорида натрия. Вместо ацетата цинка можно использовать другие соли цинка, например, хлорид цинка или сульфат цинка.
Хроматографическая колонка представляет собой две колонки, соединенные в ряд. Первая или верхняя колонка заполнена гелем цинкхелатирующей Sepharose, а вторая заполнена гелем хелатирующей Sepharose, который не был обработан солью цинка или другими солями металлов. Отношение объемов в сдвоенной колонке составляет примерно три объема цинк-обработанной хелатирующей Sepharose на один объем необработанной хелатирующей Sepharose.
Предпочтительный буфер, используемый для уравновешивания колонки, это фосфатный буфер с pH 7,2-7,5, содержащий 1,0 М хлорида натрия.
В стадии /в/ осуществляют специальную двухфазовую промывку, первый раз через колонку пропускают такой же фосфатный буфер, какой был использован для уравновешивания колонки, с pH 7,2, содержащий 1,0 М хлорида натрия, а затем через колонку пропускали натрий фосфатный буфер с pH 7,2-7,5, содержащий 10 объемных глицерина и небольшую концентрацию хлорида натрия /150 мМ NaCl/. Путем такой промывки удаляют примеси, включая те, которые очень близки и трудно отделимы. Активный ИЛ-4 остается на колонке.
Предпочтительный буфер, который используется для поддержания pH раствора активного ИЛ-4, это фосфатный буфер с pH 7,2, содержащий 1,0 М хлорида натрия. При прохождении забуференного неочищенного раствора активного ИЛ-4 через колонки, ИЛ-4 избирательно адсорбируется на этих гелях.
В стадии /c/ гели цинк-хелатирующей Sepharose и необработанной хелатирующей Sepharose уравновешиваются фосфатным буфером с pH 6,75, содержащим 1,0 М хлорида натрия, затем адсорбированный активный ИЛ-4 изократически элюируют из цинк-хелатирующей Сефарозы через необработанную хелатирующую Сефарозу ацетатным буфером с pH 5,0 М хлорида натрия, или в альтернативном вари анте буфером с нейтральным pH, содержащим хелатообразующее средство, например, 50 мМ ЭДТА /этилендиаминтетрауксусная кислота/ или аналог гистидина, например, 50 мМ имидазола, аминокислоту, например, 50 мМ гистидина. Предпочтителен ацетатный буфер. Элюаты, содержащие активный ИЛ-4 собирают. Фракции, с самыми высокими концентрациями активного ИЛ-4 объединяют /определение концентрации проводилось методом электрофореза в полиакриламидном геле с натрий додецилсульфатом и белкового анализа/.
В стадии /d/ pH объединенных фракций из стадии /с/ доводилось до pH 6,75, затем они разбавлялись 20 мМ буфером с pH 6,75, так, чтобы проводимость стала равной 15ms. Частицы катионообменного геля в хроматографической колонке уравновешивают 20 мМ буфером с pH 6.75, содержащем 0.12 M хлорида натрия. Предпочтительная катионообменная смола это поперечносшитая агароза, замещенная -CH2-SO
В стадии /e/ объединенные фракции, элюированные в стадии /d/ концентрируют в перемешиваемой камере, оборудованной мембранной, которая задерживает все частицы с молекулярной массой, превышающей 10.000. К ним относятся частицы активного ИЛ-4. Поскольку на этой стадии процесса раствор активного ИЛ-4 примерно 90-95% чистоты, очень небольшое количество ИЛ-4 активного исключается из концентрированного раствора, остающегося сверху мембраны. Предпочтительная мембрана это мембрана марки УМ-10, выпускаемая фирмой Amicon, CO USA. Концентрация в полученном растворе достигает до примерно 20 мг/мм активного ИЛ-4.
В стадии /f/ объединенные, концентрированные элюаты активного ИЛ-4 из стадии /e/ пропускают через эксклюзивную гель-фильтрационную колонку, в которой происходит фракционирование протеинов, содержащихся в растворе в соответствии с их молекулярными массами. Типичный подходящей колонкой является гель-фильтрационная колонка, заполненная Sephacrue S-200 HR или S-100HR /PHarmacia/. Sephacrul S-200 HR или S-100 HR (высокое разрешение) это поперечносшитые полимеры аллилдекстрана и N, N' метиленбисакриламида. Их диапазон фракционирования по Dalton находится в интервале 5.000-250.000 и 1.000-1000-100.000, соответственно. Другими подходящими материалами для этих целей могут служить Sephadexes /Pharmasia/, представляющие поперечносшитые декстрановые гели. Предпочтительно, когда раствор активного ИЛ-4 пропускают через S-200 HR колонку, предварительно уравновешенную 10 мМ цитратным буфером с pH 4.5. В условиях, определенных для стадии /g/ концентрат стабильного ИЛ-4 может содержать до 20 мг/мл. Это увеличивает емкость и работоспособность гель-фильтрационной хролматографии.
Фракции, содержащие самые высокие концентрации активного ИЛ-4 (определение по методу электрофореза в полиакриламидном геле с натрий додецилсульфатом/ и белкового анализа/, собирают и объединяют, в результате получают раствор 95-99% чистоты активного ИЛ-4.
Буферы, использованные в этом процессе выбирались, поскольку от них зависят точные условия связывания, промывания и элюирования активного ИЛ-4, т. е. будет ли он адсорбироваться храмотографическими гелями или селективно элюироваться через них. Предпочтительные буферы это натрийфосфатные буферы с концентрацией 20 мМ или натрий-цитратный или натрий-ацетатный буферы со значениями pH и концентраций, которые приведены в примерах, а также эти буферные растворы содержат специфические количества хлорида натрия. pH раствора регулируют с помощью гидроксида натрия или кислоты. В двух промывках на стадии /b/ первая промывка осуществляется 20 мМ натрий фосфатным уравновешивающим буфером с pH 7.2, содержащим 1.0 М хлорида натрия, а вторая промывка проводится с помощью фосфатного буфера, содержащего примерно 150 мМ хлорида натрия и 10 объемных глицерина, который необходим для второго промывочного буфера.
Концентрация хлорида натрия в буферных растворах, используемых с цинк-хелатирующими-Sepharose колонками, является определяющим параметром для настоящего изобретения, поскольку высокое содержание соли, предпочтительно 1М содержание хлорида натрия, облегчает выделение солюбилизированного активного ИЛ-4 из гранул трихлоуксусной кислоты /ТСА/, а также увеличивает связываемость активного ИЛ-4 с металл-хелатирующей Sepharose. Высокое содержание соли позволяет ИЛ-4 более селективно адсорбироваться на цинк-хелатирующей Sepharose, по сравнению с примесями, содержащимися в ферментационном бульоне.
Для инъекций массу ИЛ-4 в начале оттаивают и разбавляют стерильной водой и/или 10 мМ цитратным буфером.
Пример 1.
Приготовление колонки S-Sepharose® Fast Flow.
Готовят две колонки для катионообменной хроматографии, которые заполняют S-Sepharose® Fast Flow катионообменной смолой в 20 мМ натрийфосфатном буфере, pH 7.2 с 0.12 М хлорида натрия. Первая колонка имеет объем 1,5 л, диаметр 100 мм и 45 см высота колонки, а вторая колонка объем 0.25 литра, диаметр 50 мм, высота 300 мм. Объем слоя маленькой колонки составляет 15% от объема слоя большей по размеру колонки, причем каждая колонка полностью загружается гелем катионообменной смолы. Колонки заполняют следующим образом: Гель катионообменной смолы Sepharose® Fast Flow набухает в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия, pH 7.2 и 0.12 М NaCl. Помещают этот гель в соответствующую хроматографическую колонку, позволяют жидкости стечь или прокачивают ее через дно колонки.
Вверху колонки устанавливают расходомер и уравновешивают гель примерно 5 объемами буфера, содержащего 20 мМ натрий фосфата, pH 7.2 и 0.12 М NaCl, прокачивая буфер через колонку с линейной скоростью примерно равной 1 см/мин. Регулируют расходомер на верху колонки так, чтобы подача осуществлялась строго на верхний слой смолы. Затем прокачивают, по крайней мере, 5 объемов буфера, содержащего 20 мМ фосфата натрия, pH 7.2 и 0.12 М хлорида натрия, с линейной скоростью примерно 1 см/мин, и если в этом есть необходимость, продолжают прокачивание буфера через колонку с той же скоростью потока до тех пор пока pH элюента не достигнет значений в пределах от 7.1 до 7.3. Регулируют объемы слоя смолы таким образом, чтобы объем меньшей колонки составлял 15% объема большей колонки.
Пример 2.
Приготовление кобальт хелатирующей Sepharose® Fast Flow
Суспендируют гель хелатирующей Sepharose® Fast Flow в объемах 0.02 М раствора ацетата кобальта и оставляют стоять на ночь при случайном перемешивании. Промывают гель на воронке Бюхнера деионизированной водой, затем промывают гель 0.02 М раствором фосфата натрия, pH 7.2, содержащим 0.5 М хлорида натрия. Затем набухают гель в 0.5 объемах геля 0.02 М раствора фосфата натрия в pH 7.2, содержащего 0.5 М хлорида натрия. В колонку диаметром 50 мм и высотой 300 мм загружают 190 мл геля, заряженного ионами кобальта и прокачивают через колонку жидкость. Вверху колонки устанавливают расходомер и уравновешивают гель, прокачивая 0.02 М натрийфосфатный буфер с pH 7.2, содержащий 0.5 М хлорида натрия, через колонку со скоростью примерно 1 см/мин. Устанавливают расходомер наверху колонки.
Пример 3. Приготовление хелатирующей Sepharose® Fast Flow /не обработана солью металла/
Набухают гель хелатирующей Sepharose® Fast Flow в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия с pH 7.2 и 0.5 М хлорида натрия. Помещают в хроматографическую колонку из примера 2.75 мл геля таким образом, чтобы гель, необработанный солью металла, лег равномерным слоем поверх гель, заряженного ионами кобальта. На колонке устанавливают расходомер и уравновешивают гель 0.02 М натрий фосфатным буфером с pH 7.2, содержащим 0.5 М хлорида натрия.
Пример 4. Уравновешивание колонки, заполненной кобальт- хелатирующей Sepharose®
После приготовления колонки в соответствии с описанием примера 2 и примера 3 переворачивают колонку таким образом, чтобы кобальтобработанная смола была сверху, а необработанная солью кобальта смола лежала под ней. Продолжают прокачку буфера, т.е. раствора, содержащего 0.02 М фосфата натрия с pH 7.2 и 0.5 М хлорида натрия, через колонку до тех пор пока, pH эффлюента не будет иметь значений, лежащих в интервале 7.1-7.3.
Пример 5. Приготовление колонки с Sepharose® S-200 HR Смолой
Колонку объемом 1.8 литра, диаметром 50 мм и высотой 100 см заполняют гелем S-200 HR и прокачивают через нее, по крайней мере, один объем буфера, содержащего 10 мМ цитрата натрия, с pH 4.5 с линейной скоростью примерно 0.2 см/мин для того, чтобы уравновесить колонку.
Пример 6. Приготовление буферных растворов
/a/ 0.02 М раствор фосфата натрия, pH 7.2, содержащий 0.2 М хлорида натрия.
Смешивают вместе в деионизованной воде 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия, 7.03 г/л хлорида натрия и достаточное количество 6.3 М раствора гидроксида натрия, для того, чтобы довести pH до 7.2 (±0.1).
/b/ 0.02 раствор фосфата натрия, pH 7.2, 0.26 М хлорида натрия.
>Смешивают вместе в деионизованной воде 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия и 15.19 г/л хлорида натрия. Доводят pH раствора до 7.2/±0.1/, добавляя 6.3 М раствор гидроксида натрия.
/c/ 0.02 М раствор фосфата натрия, pH 7.2, 0.50 М хлорида натрия
Смешивают вместе в деионизованной воде 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия, 29.22 г/л хлорида натрия и доводят pH до значения 7.2, добавляя достаточное количество 50% раствора NaOH. pH 7.2/±0.1/.
/d/ 0.02 М фосфат натрия, pH 6.0, 0.05 M ЭДТА, 0.5 M хлорида натрия
Смешивают вместе в деионизованной воде 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия и 19 г/л тетранатриевой соли ЭДТА и 29.22 г/л хлорида натрия. Доводят pH до 6.0/±0.1/, добавляя 6.3 М раствор гидроксида натрия или 4 М раствор HCl.
/e/ 10 мМ цитрат натрия, pH 4.5
Смешивают 210 грамм /2.1 г/л/ моногидрата лимонной кислоты со 100 мл деионизованной воды и перемешивают до тех пор, пока не растворится моногидрат лимонной кислоты. Доводят pH раствора до 4.5 добавляя 4 М хлористоводородную кислоту и, если необходимо, 6.3 М раствор гидроксида натрия. Этот буфер используется для диафильтрации и ультрафильтрации, также как и в гельфильтрационной хроматографии.
/f/ 20 мМ фосфат натрия, pH 7.2
Смешивают 278 грамм моногидрата однозамещенного фосфата натрия со 100 литрами деионизованной воды и перемешивают до растворения. Доводят pH буфера до 7.2 проводимость до 2-4 ms добавляя 50% раствор NaOH.
Пример 7. Обработка неочищенного раствора ИЛ-4 методом катионообменной хроматографии
Доводят раствор неочищенного ИЛ-4, содержащий культивируемую среду клеток /суммарное содержание примерно 14,000 грамм/ до pH 7.2/±0.1/, а проводимость доводят до значения 14 ms/±1/. Прокачивают раствор через колонку, заполненную катионнообменной смолой Sepharose с линейной скоростью примерно 1 см/мин или меньшей. Промывают колонку буфером, приготовленным в примере 6/a/. Изократически элюируют колонку буфером, приготовленным в примере 6/b/ с линейной скоростью примерно 0,2 см/мин. Собирают фракции которые содержат ИЛ-4, который определяют, используя метод электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом и белковый анализ, и объединяют их. Чистота этого пула активного ИЛ-4 равна примерно 50%
Пример 8. Градиентное элюирование частично очищенного раствора активного ил-4 на катионообменной колонке
Доводят pH объединенного раствора активного ИЛ-4, полученного в соответствии с примером 7 до 7.2/±0.1/, добавляя либо 4 М HCl либо 6.3 М раствор NaOH, если в этом есть необходимость. Доводят проводимость раствора буфером, приготовленным в примере 6/ / до значения 14mS/±1/.
Прокачивают раствор через колонку, заполненную S-Sepharose в соответствии с описанием примера 1, с линейной скоростью примерно 1 см/мин или менее. Собирают вытекающий поток раствора в одну фракцию.
Элюируют колонку, используя градиент примерно 1.75 mS на объем слоя и линейной скоростью потока примерно 0.2 см/мин. Буфер с низким содержанием соли, используемый в градиенте, это буфер, приготовленный в примере 6/c/.
Собирают 5 больших фракций, каждая из которых по объему примерно составляет 0.5 объема слоя. Собирают оставшиеся фракции (примерно 40-50) объемом примерно 0.1 объема слоя.
Проводят анализ фракций на содержание активного ИЛ-4, используя метод электрофореза в полиакриламидном геле и белковый анализ. Чистота объединенного раствора активного ИЛ-4 составляет примерно 60-70%
Пример 9. Очистка активного рекомбинантного человеческого интерлейкина-4 методом хроматографии на кобальт-хелатирующей сефарозе.
Доводят pH раствора ИЛ-4 из примера 8 до pH 7.2 /±0.1/, добавляя 4 М раствор HCl и/или 6.3 М раствор хлорида натрия. Доводят проводимость раствора до 45-50 mS.
Осветляют раствор, если в этом есть необходимость, путем центрифугирования или микрофильтрации. Прокачивают раствор /примерно 3.3 мг протеина на мл геля/ через колонку, заполненную кобальтхелатирующей сефарозой Sepharose Fast Flow и колонку, заполненную необработанной хелатирующей сефарозой /Sepharose Fast Flow, которые приготовлены согласно описанию примера 4, с линейной скоростью примерно 0.5 см/мин. Собирают прошедший раствор в одну фракцию.
Промывают колонку буфером, приготовленным в примере 6/c/ с линейной скоростью примерно 0.5 см/мин и пропускают объем, равный примерно 10 объемам слоя, собирают промывание воды не более, чем в 5 фракций, затем элюируют колонку буфером, приготовленным в примере 6/d/, используя буфер в количестве примерно равном 10 объемам слоя, пропуская его со скоростью примерно 0,5 см/мин. Собирают фракции с объемом равным примерно 0.2 объема слоя. Анализируют каждый образец на содержание активного ИЛ-4, используя метод электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом и белковый анализ, и объединяют фракции, содержащие активный ИЛ-4.
Чистота раствора активного ИЛ-4, обработанного согласно процедуре, описанной в примере 9, равна примерно 90-95%
Пример 10. Ультрафильтрация и концентрирование
Объединение фракции из примера 9 концентрируют, используя перемешиваемую камеру Abmicon, оборудованную УМ-10 мембраной; объединенные фракции из примера 9, содержащие активный человеческий ИЛ-4 помещают в контейнер и добавляют примерно 0.25 объема буфера, полученного в примере 6 /d/. Концентрируют объем до примерно 0.2 первоначального объема путем ультрафильтрации на УМ-10 мембране. Разбавляют концентрированную массу, задержанную на мембране УМ-10 4 объемами буфера, приготовленного в примере 6/e/ и концентрируют вновь до объема равного 0.2 объема путем ультрафильтрации на мембране УМ-10.
Стадия концентрирования может быть повторена до достижения примерно 0.1 объема начальных объединенных фракций. Концентрат переносят в подходящую емкость и хранят в условиях холодной комнаты в случае немедленного использования или замороженным при -20oC.
Пример 11. Гель-фильтрационная хроматография /эксклюзивная/
Колонку, заполненную Sephacryl S 200 HR уравновешивают буфером, приготовленным в примере 6 /e/, прокачав буфер, по крайней мере, в количестве равном примерно одному объему слоя, с линейной скоростью примерно 0,2 см/мин.
Осветляют раствор, полученный в примере 10 центрифугированием на лабораторной центрифуге, 4500 об/мин в течение 30 минут в температурном интервале 2 6oC. Измеряют A280 и разбавляют раствор буфером, приготовленным в примере 6 /e/, так, чтобы имелось 5 единиц оптической плотности при 280 нм на мл.
Прокачивают полученный раствор через колонку, заполненную Sephacryl S 200 HR с линейной скоростью примерно 0,1 см/мин. Продолжают прокачивать буфер, приготовленный по примере 6 /e/ через колонку со скоростью потока примерно 0,1 смн/мин. Собирают одну большую фракцию объемом равным 0,4 0,55 объема слоя, затем собирают 50 фракций, объем каждой равен примерно 0,01 объема слоя.
Отбирают фракции, содержащие активный ИЛ-4, определенный методом электрофореза в полиакриламидном слое с натрийдодецилсульфатом и белкового анализа. Объединяют фракции, содержащие активный ИЛ-4 и фильтруют через стерильный фильтр с размером пор 0,2 микрона. Выделяют фильтраты 95 99% чистоты, что подтверждают анализируя активный ил-4 методом электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом. Общий выход в пересчете на активный ИЛ-4 в культивируемой среде клеток равен 70%
Все анализы, используемые для определения активного инерлейкина-4 во фракциях, стандартные. Величина УФ поглощения очищенного ИЛ-4, измеренного при 280 нм, равная 1,0 оптической плотности A280, соответствует 1,6 мг, полученному методом аминокислотного анализа и 2,0 мг, полученным по методу Lowry's.
Пример 12. Приготовление цинк-хелатирующей Sepharose® Fast Flow
Набухают гель хелатирующей Sepharose® Fast Flow в деионизованной воде. Для приготовления 3 литровой колонки заполняют набухшим гелем хроматографическую колонку высотой 500 мм и диаметром 180 мм. Позволяют жидкости стечь или откачивают ее через нижнюю часть колонки.
Помещают сверху колонки расходомер и пакуют и промывают гель деонизованной водой. Прокачивают воду через колонку со скоростью линейной примерно 1 см/мин. Устанавливают расходомер на верху колонки так, чтобы осуществлять давление строго сверху слоя смолы. Прокачивают, по крайней мере, деионизованную воду в количестве равном 5 объемам слоя, с линейной скоростью примерно 1 см/мин.
Через колонку прокачивают раствор 0,023 М ацетата цинка, объем раствора соли составляет примерно 5 объемов слоя. Скорость линейная прокачка равна примерно 1 см/мин.
Затем прокачивают раствор фосфатного буфера с линейной скоростью примерно 1,0 см/мин до тех пор пока pH эффлюента не достигает значения 7,1 7,3.
Пример 13. Приготовление хелатирующей Sepharose® Fast Flow /не обработанной солью металла/
Sepharose® Fast Flow в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия с PH 7,2 и 1,0 М хлорида натрия. Для приготовления колонки объемом 1 лист помещают гель в хроматографическую колонку диаметром 140 мм и высотой 500 мм и элюируют через нижнюю часть колонки. Уравновешивают гель колонки буфером, содержащим 20 мМ фосфата натрия с pH 7,2 и 1,0 М хлорида натрия, прокачивая его в объеме равном примерно 5 объемам слоя. Прокачивают буфер с линейной скоростью равной примерно 1 см/мин. Продолжают прокачку буфера через колонку до тех пор, пока pH эффлюента не достигнет 7,1 7,3. Прокачка продолжается с той же скоростью.
Пример 14. Подготовка колонок в ряд
После того, как цинк-хелатирующая Sepharose колонка и колонка, с необработанной хелатирующей Sepharose были подготовлены в соответствии с примерами 12 и 13, соединяют колонки в ряд, так что поток подается сначала в первую колонку, заполненную цинк-хелатирующий сефаразой, а затем попадает во вторую колонку, заполненную, необработанной солями цинка, халатирующей сефаразой. Между колонками не должно быть пузыря.
Пример 15. Приготовление колонки S-Sepharose
Набухают гель S-Sepharose катионообменной смолы в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия, pH 6,75, 0,12 M NaCl и 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты /ЭДТА/. Помещают гель в хроматографическую колонку диаметром 100 мм и высотой 45 см и дают возможность жидкости стечь или откачивают через дно колонки.
Размещают вверху колонки расходомер и уравновешивают гель буфером, содержащим 20 мМ фосфата натрия, pH 6,75, 0,12 M Nacl, 0,001 M ЭДТА, прокачав буфер в количестве равном 5 объемам слоя с линейной скоростью примерно 1 см/мин. Устанавливают расходомер строго над верхним слоем смолы. Затем прокачивают буфер, содержащий 20 мМ фосфата натрия, pH 6,75, 0,12 M NaCl, 0,001 M ЭДТА, в количестве равном 5 объемам слоя, по крайней мере, с линейной скоростью примерно 1 см/мин, и если это необходимо, продолжают прокачивать буфер с той же скоростью до тех пор пока pH эффлюента не достигнет значения 6,6 6,9.
Пример 16. Приготовление колонки с Sephacryl S 200 HR
Прокачивают буфер, содержащий 10 мМ цитрата натрия pH 4,5 в количестве равном, по крайней мере, 1 объему слоя, через S 200 HR гель в хроматографической колонке 50 мм диаметром и 100 см высотой, с линейной скоростью примерно 0,2 см/мин для уравновешивания колонки.
Пример 17. Приготовления буферных растворов
/а/ 0,02 М фосфата натрия, pH 7,2, 1,0 M хлорида натрия. Смешивают вместе в деионизованной воде 2,78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия, 58,44 г/л хлорида натрия и добавляют 6,3 М раствор гидроксида натрия в количестве достаточном для доведения pH до 7,2 /±0,1/. Ванна для смешивания должна быть достаточно большой, чтобы иметь возможность обеспечить, по крайней мере, 30 литров на литр геля в колонках с металл-хелатирующим Sepharose®
/b/ 0,02 M фосфата натрия, pH 7,2, 0,15 M хлорида натрия. 10% глицерина.
Смешивают вместе в деионизованной воде 2,78 г/л монофосфата однозамещенного фосфата натрия и 8,76 г/л хлорида натрия. Доводят pH до 7,2 /±0,1/, добавляя раствор 6,3 М гидроксида натрия. Добавляют достаточное количество глицерина для того, чтобы обеспечить содержание глицерина в растворе 0,1 л/л. Готовят достаточное количество буфера, чтобы обеспечить, по крайней мере, 6 литров на литр геля с которым он будет использоваться.
/c/ 0,02 M ацетата натрия, pH 5,0, 0,5 M хлорида натрия.
Смешивают вместе в деионизованной воде 1,15 мл/л 99,7% уксусной кислоты и 29,2 г/л хлорида натрия. Доводят pH до 5,0 /±0,1/, добавляя 6,3 раствор М гидроксида натрия. Готовят буфер в количестве достаточном, чтобы обеспечить, по крайней мере, 10 литров буфера на литр геля с которым он будет использоваться.
/d/ 0.03 M фосфата натрия, pH 7.0, 0.003 М ЭДТА Смешивают вместе с деионизированной воде 4.17 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия и 1.14 г/л тетранатриевой соли ЭДТА. Доводят Ph до 7.0 /±0,1/, добавляя раствор 6.3 М гидроксида натрия. Готовят буфер в количестве достаточном, чтобы обеспечить, по крайней мере, 2 литра буфера на литр геля.
/e/ 10 мМ цитрата натрия, pH 4.5
Смешивают 210 грамм /2.1 г/л/ моногидрата лимонной кислоты со 100 литрами деонизованной воды и перемешивают пока моногидрат лимонной кислоты полностью не раствориться. Доводят pH буфера до 4.5, добавляя 4 М хлористоводородную кислоту и 6.3 м раствор гидроксида натрия, если в этом есть необходимость. Этот буфер используется для диафильтрации и ультрафильтрации, также как и для гель-фильтрационной хроматографии.
Пример 18. Очистка активногорекомбинантного человеческого интерлейкина-4
/Хроматография цинкхелатирующей Сефарозе/
Концентрируют 700 л ферментационного бульона, в котором содержится активный человеческий рекомбинантный ИЛ-4 до 20 литров, затем этот раствор подвергают 25-кратной диафильтрации относительно буфера, приготовленного в примере 17/а/. Доводят pH раствора до 7.2 /±0,1/, добавляя 40/м раствор HCl и/или 6.3 М раствор хлорида натрия. Доводят проводимость раствора до 70-90. Осветляют и концентрируют раствор путем фильтрации. Промывают фильтр буфером, приготовленным в примере 17/а/, возвращая объем раствора к 20 литрам.
Прокачивают раствор через колонки с цинк хелатирующей Sepharose® Fast Flow и необработанной хелатирующей Sepharose с линейной скоростью примерно 0.5 см/мин. Собирают прошедший поток в одну фракцию.
Колонки должны быть промыты дважды, сначала их промывают буфером, приготовленным в примере 17/b/ с линейной скоростью примерно 0.5 см/мин и объемом равным примерно 5 объемам слоя, промывные воды собирают в не более чем 5 фракций. Затем колонки промывают буфером, приготовленном в примере 17/b/ с линейной скоростью примерно 0.5 см/мин и объемом равным 5 объемам слоя, собирают промывные воды в одну фракцию.
Элюируют активный ИЛ-4 из колонки буфером, приготовленным в примере 17/c/, использовав его в количестве равном примерно 8 объемам слоя, и прокачивая с линейной скоростью примерно 0.25 см/мин. Собирают фракции объемом примерно равным 0.2 объема слоя в отдельные емкости, содержащие разбавитель-буфер, приготовленный в примере 17/d/, в количестве 0.5 мл на мл собираемой фракции.
Проверяют каждый образец на содержание интерлейкина -4, используя для этого метод электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодециосульфатом и белковый анализ.
Чистота раствора активного ИЛ-4 после такой обработки по применению 18 составляет 20-40% Выход активного ИЛ-4 в пересчете на количество неочищенного ферментационного бульона оставляет 90%
Пример 19. Приготовление буферных растворов для хроматоргафии Has - Sepharose
/а/ 20 мМ фосфата натрия, pH 6.75, 0.12 М хлорида натрия
Загружают 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия, 7.03 г/л хлорида натрия, 0.38 г/л тетранатриевой соли ЭДТА и 1 л/л деионизованной воды в соответствующую емкость и перемешивают до растворения.
Доводят pH буферного раствора до 6.75 /±0,1/, добавляя раствор 6.3 М гитдроксида натрия.
/б/ 20 мМ фосфата натрия, pH 6.75, 0.55 М хлорида натрия.
Загружают 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия 32.14 г/л хлорида натрия, 0.38 г/л тетранатриевой соли ЭДТА и деонизованную воду в подходящую емкость и перемешивают до растворения. Доводят pH до 6.75 /±0,1/, добавляя раствор 6.3 М гидроксида натрия.
/с/ 20 мМ фосфата натрия, pH 6.75, 0.001 МЭДТА
Загружают в достаточно большую емкость 2.78 г/л моногидрата однозамещенного фосфата натрия, 0.38 г/л тетранатриевой соли ЭДТА и деонизованную воду. Перемешивают и растворяют, затем доводят pH epa o 6.75 /±0,1/, добавляя 6.3 М раствор гидроксида натрия, когда в этом есть необходимость.
Пример 20. Градиентное элюирование очищенного раствора активного интерлейкина-41 из катионообменной колонки
Доводят pH раствора активного ИЛ-4, приготовленного в соответствии с примером 7, до pH 6.75 /±0,1/, добавляя либо раствор 4М хлористоводородной кислоты, либо раствор 6.3 М. гидроксида натрия, если в этом есть необходимость.
Фильтруют через фильтр с размером пор 0.45 микрон.
Промывают фильтр примерно 1 литром буфера, полученным в примере 19 /с/.
Доводят проводимость полученного раствора до 15 μs /±0,5/ буферным раствором, приготовленным в примере 19/с/. Прокачивают раствор через S-Sepharose колонку, приготовленную в примере 4, с линейной скоростью примерно 1 см/мин или менее. Собирают топок вытекающего из колонки раствора /эффлюента/ в одну фракцию. Промывают колонку буферным раствором, приготовленным в примере 19/а/, прокачивая буфер в количестве примерно равном 5 объемам слоя и линейной скоростью примерно 1.0 см/мин. Собирают промывные воды в одну фракцию. Элюируют колонку, используя градиент примерно 4.5 μs на объем слоя и линейной скоростью примерно 0.2 см/мин.
Буфер с низким содержанием соли, используемый в градиенте, это буфер, приготовленный в примере 19/а/, его используют в объеме, равном 5 объемам слоя, и буфер с высоким содержанием соли, используемый в градиенте это буфер, приготовленный в пример 19 /b/ в количестве равном примерно 5 объемам слоя.
Собирают 5 больших фракций, объем каждой равен примерно 0.8 объема слоя.
Собирают оставшиеся фракции /примерно 40-50/ объемом равном 0.1 объема слоя.
Определяют во фракция активный ИЛ-4 методом электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом и методами белкового анализа. Объединяют фракции, содержащие активный ИЛ-4. Выход активного ИЛ-4 в расчете на количество активного ИЛ-4 в объединенных элюатах после цинк-хелатирующей сефарозы, составляет 90%
Чистота активного ИЛ-4 раствора равна примерно 90-95%
Пример 21. Ультрафильтрация и концентрирование
Концентрируют объединенные фракции из примера 20 в камере с перемешиванием Am/con, оборудованной мембраной УМ-10. Объединенные фракции из примера 20, содержащие активный человеческий интерлейкин-4 в контейнере, помещают в камеру и концентрируют объем этих объединенных фракций примерно до 0.1 первоначального объема ультрафильтрацией на УМ-10. Разбавляют концентрированное содержимое, задержанное на мембране, 4 объемами буфера, полученного в пример 17 /e/ и концентрируют снова до примерно 0.2 объема путем ультрафильтрации на УМ-10 мембране.
Стадия концентрирования может быть повторена до достижения примерно 0.1 объема первоначальных объединенных фракций. Концентрат переносят в соответствующий контейнер, который хранят при низкой комнатной температуре или замораживают и хранят при -20oC.
Пример 22. Гель-фильтрация /Эксклюзивная Хроматография/.
Раствор, полученный в примере 21 осветляют путем центрифугирования на лабораторной центрифуге 4500 об/мин, в течение 30 минут при 2-6oC. Измеряют поглощение A280 и разбавляют раствор буфером, приготовленным в примере 17 /e/, так чтобы получить 15 A280.
Прокачивают полученный раствор через колонку Sephacryes 200 HR с линейной скоростью примерно 0.1 см/мин. Продолжают прокачивание, прокачивая буфер из примера 17 /e/ через колонку со скоростью потока примерно 0.1 см/мин. Собирают пять фракций с общим объемом равным 0.4 0.55 объема слоя, затем собирают 50 фракций объемом равным примерно 0.01 объема слоя.
Отбирают фракции, содержащие активный ИЛ-4, определяемый методом электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом и белковым анализом. Объединяют фракции с активным ИЛ-4 и фильтруют через фильтр с размером пор 0.2 микрона. Фильтр стерильный. Выделяют фильтраты, представляющие растворы активного ИЛ-4 95-99% чистоты. Общий выход в пересчете на ИЛ-4 активный, содержащийся в ферментационном бульоне, составляет 70 80%
Чистота выделенного активного ИЛ-4 равна 95-99% что подтверждается методом электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодециосульфатом.
Все анализы, использованные для определения активных фракций интерлейкина-4, стандартны. При отборе фракций, содержащих активный ИЛ-4, от элюата используют метод УФ поглощения при 280 нм. Для очищенного ИЛ-4 единица оптической плотности 1 A280 эквивалента содержание 1.6 мг, полученному методом аминокислотного анализа и 2.0 мг по методу Lowzy.
Метод электрофореза в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом также используется для отбора активных фракций. Этот метод описан в работе Laemi, U. K. Nature, 227: 680 /1970/. Метод Lowry описан в работе Lowry et al. J. Biol. Chem.
Хотя в настоящем описании представлены некоторые специфические варианты осуществления настоящего изобретения, любому, кто специализируется в данной области должно быть очевидно, что возможны различные вариации и модификации, которые могут быть включены в рамки настоящего изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА | 2011 |
|
RU2440417C1 |
| УСКОРЕННАЯ АЦЕТИЛГИДРОЛАЗА ФАКТОРА АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ | 1997 |
|
RU2207875C2 |
| ХОНДРОИТИНАЗА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ВКЛЮЧАЮЩИЕ ЕЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ | 1993 |
|
RU2144833C1 |
| СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ОЧИЩЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ | 2014 |
|
RU2671481C2 |
| СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ОЧИЩЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ | 2014 |
|
RU2793783C1 |
| ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ЛИГАНД | 2005 |
|
RU2396246C2 |
| СПОСОБ ОЧИСТКИ АНТИТЕЛ | 2005 |
|
RU2389552C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТА РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 ЧЕЛОВЕКА "АРИЛ" | 2004 |
|
RU2326947C2 |
| ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ЛИГАНД | 2005 |
|
RU2541429C2 |
| СПОСОБ ОЧИСТКИ И/ИЛИ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА | 2002 |
|
RU2358980C2 |
Использование: иммунология. Способ использования: методы увеличения числа нейтрофилов и индуцирования миелоидных клеток у млекопитающих путем введения ИЛ-4-раскрываются в изобретении. Также раскрываются способы очистки активного рекомбинантного человеческого интерлейкина-4, выделяемого из некоторых ферментационных бульонов E.coli из некоторых сред культуры CHO-клеток. 4 с. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл.
| Sanderson et al | |||
| Proc | |||
| Natl | |||
| Acad | |||
| USA | |||
| Пуговица | 0 |
|
SU83A1 |
| Butler et al | |||
| J | |||
| Jmmunol | |||
| Топочная решетка для многозольного топлива | 1923 |
|
SU133A1 |
| Farrar et al | |||
| J | |||
| Jmmunol., 131, 1838-1842, 1983. | |||
