СПОСОБ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСНОГО АНТИГЕНА Российский патент 2008 года по МПК C12N7/02 C12N5/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам продуцирования вирусного антигена в культуре адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, которые обеспечивают более высокий выход вирусного антигена на единицу объема культуральной среды. Данное изобретение относится также к биомассе культуры адгезивных клеток, характеризующейся более высокой плотностью клеток и концентрацией микроносителя по сравнению с соответствующей культурой сливающихся клеток.

Предпосылки изобретения

Для эффективного производства вакцины необходимо крупномасштабное выращивание вируса с высоким выходом из системы-хозяина. Условия культивирования, в которых происходит рост вирусного штамма, имеют большое значение с точки зрения достижения приемлемо высокого выхода данного штамма. Таким образом, чтобы максимизировать выход требуемого вируса, как система, так и условия культивирования должны быть специально адаптированы для создания среды, которая является наиболее благоприятной для продуцирования требуемого вируса. Поэтому для достижения приемлемо высокого выхода разных вирусных штаммов необходима система, обеспечивающая оптимальные условия для выращивания разных вирусов в большом количестве.

Единственным экономически обоснованным способом является культивирование в реакторе, так как только такой способ можно масштабировать в соответствии с размером рынка сбыта и требуемым количеством вакцины. Способ выращивания адгезивных клеток на носителе с использованием классического микроносителя в настоящее время лучше всего подходит для крупномасштабного культивирования клеток, необходимых для размножения вируса (Van Wezel et al., 1967. Nature 216:64-65; Van Wezel et al., 1978. Process Biochem. 3:6-8). В научной литературе описано крупномасштабное производство вируса полиомиелита, вируса гепатита А, вируса простого герпеса (HSV) или вируса болезни Марека на микроносителе (патент США № 4525349; Widell et al., 1984. J. Virological Meth. 8:63-71; Fiorentine et al., 1985. Develop. Biol. Standard 60:421-430; Griffiths et al., 1982. Develop. Biol. Standard. 50:103-110). Современные способы культивирования клеток на микроносителе позволяют получать вирус в ферментерах объемом до 1200 л.

Caij et al. (1989. Arch. Virol. 105:113-118) сравнили выходы титров вируса холеры Хога в культурах на микроносителе и в обычных монослойных культурах и обнаружили, что при использовании системы с микроносителем можно получить более высокий выход вируса на единицу объема среды.

Griffiths et al. (1982. Develop. Biol. Standard. 50:103-110) исследовали влияние концентрации микроносителя на рост клеток и продуцирование HSV. Было установлено, что необходима оптимальная концентрация микроносителя для достижения высокой плотности клеток, которая также влияет на выход вируса. Однако более высокие концентрации микроносителя в перфузивной системе вызывали утрату клеток вследствие сползания слоя клеток с шариков.

Продуктивность способа получения вируса в системе с микроносителем зависит от типа вируса, клеток, микроносителя и плотности клеток в системе. Более высокая концентрация микроносителя в культуре клеток способствует получению большего числа клеток. Однако микроносители стоят дорого, и в указанных условиях может происходить утрата клеток вследствие сползания слоев клеток с шариков под действием сдвигающего усилия в системе. Из вышеизложенного следует, что для достижения более высокого выхода вируса необходим больший объем культуры клеток на микроносителе, но подобная система требует дополнительных затрат на обработку и очистку больших объемов биомассы.

Для размножения вируса большое значение имеет оптимальная плотность клеток, необходимая для максимального выхода вируса. Кроме того, важно обеспечить эффективное проникновение вируса в клетки. Поэтому в обычных методах объем питательной среды перед инфицированием уменьшают для проникновения вируса в клетки в минимальном объеме культуры и достижения лучшего соотношения вируса и клеток. Однако для оптимального размножения вируса объем культуральной среды снова увеличивают по истечении некоторого времени после проникновения для сохранения жизнеспособности и/или поддержания роста клеток. При этом происходит увеличение объема культуральной среды, содержащей клетки и/или вирус, что является существенным недостатком, так как необходимо обрабатывать большие объемы биомассы при последующей очистке вируса от клеток или культуральной среды.

В случае вспышки вирусной инфекции необходимо своевременно произвести большое количество вакцины, чтобы получить несколько миллионов доз вакцины в течение короткого периода времени. Поэтому существует насущная потребность в безопасных и эффективных способах продуцирования вирусов и антигенов. Кроме того, необходимо обеспечить размножение вируса с использованием материалов, существующих в настоящее время и требующих выполнения минимального числа трудоемких операций, например, благодаря применению способа, позволяющего обрабатывать меньшие объемы культуральной среды и облегчающего очистку и последующее производство вакцины.

Краткое изложение существа изобретения

Задачей настоящего изобретения является предоставление способа продуцирования вируса или вирусного антигена в культуре адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способа продуцирования вируса в небольшом объеме культуры клеток.

Еще одной задачей настоящего изобретение является предоставление культуры адгезивных клеток, характеризующейся более высокой плотностью по сравнению с исходной культурой клеток, выращиваемых до слияния.

Еще одной задачей изобретения является предоставление культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, характеризующейся более высокой плотностью по сравнению с исходной культурой клеток, выращиваемых до слияния, в которой клетки инфицированы вирусом.

Подробное описание изобретения

В соответствии с вышеуказанными и другими задачами настоящее изобретение относится к способам продуцирования вируса или вирусного антигена, которые включают стадии получения культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, выращивания культуры клеток до слияния, инфицирования указанных клеток вирусом, причем плотность клеток в культуре увеличивают (i) до инфицирования вирусом или (ii) после инфицирования вирусом, и инкубации культуры клеток, инфицированных вирусом, для размножения указанного вируса. Плотность клеток в указанной культуре увеличивают путем концентрирования культуры клеток, причем указанный процесс включает увеличение концентрации микроносителя в культуре клеток.

Как правило, для достижения высокой плотности клеток необходимо оптимальное соотношение между концентрацией микроносителя и адгезивными клетками, прикрепленными к микроносителю. Увеличение концентрации микроносителя в культуре клеток теоретически должно способствовать достижению более высокой плотности клеток на единицу объема культуральной среды. Однако вследствие сдвигающего усилия, уменьшения источников подпитки в среде и физиологического стресса, которому подвергаются клетки в результате увеличения концентрации микроносителя, концентрация носителя в системе культивирования клеток ограничивается определенной величиной (см., например, приведенную выше работу Griffiths et al., 1982).

Способ по данному изобретению позволяет выращивать клетки в оптимальных условиях, включая концентрацию микроносителя, подпитку и минимальный физиологический стресс, для достижения максимальной плотности клеток в используемой системе.

В соответствии с настоящим изобретением установлено, что уменьшение объема культуральной среды до или после инфицирования вирусом, в результате чего увеличивается плотность клеток и концентрация микроносителя в биомассе культуры клеток, не влияет на продуктивность клеток. В дополнении было неожиданно обнаружено, что выход вируса в расчете на клетку можно увеличить по сравнению с клетками, культивируемыми при той же плотности, что и исходная культура сливающихся клеток. Такой результат является весьма неожиданным, так как вследствие увеличения концентрации микроносителя в культуре клеток можно ожидать снижения жизнеспособности клеток, сползания клеток с микроносителя и возникновения физиологического стресса из-за более высокой плотности клеток во время продуцирования вируса.

Способ по данному изобретению позволяет уменьшить объем культуральной среды, подлежащей обработке в процессе последующей очистки вируса, при одновременном сохранении и даже увеличении выхода вируса в расчете на клетку по сравнению с исходной культурой клеток. Указанную систему можно масштабировать в ферментере объемом 6000 л, благодаря чему процесс продуцирования вируса для получения вакцины становится более эффективным и требует меньших затрат времени.

В соответствии с одним вариантом осуществления способа по данному изобретению клетки, требующие прикрепления к подложке, выбирают из группы адгезивных клеток, включающих VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF или диплоидные монослойные клетки, описанные Reuveny et al. (1985. Develop. Biol. Standard. 60:243-253), и другие клетки, хорошо известные в данной области.

Адгезивные клетки, прикрепленные к микроносителю, можно выращивать в обычной культуральной среде, содержащей сыворотку. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения клетки выращивают в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде, описанной Kistner et al. (1998. Vaccine 16:960-968), Merten et al. (1994. Cytotech. 14:47-59), Cinatl. et al. (1993. Cell Biology Internat. 17:885-895), Kessler et al. (1999. Dev. Biol. Stand. 98:13-21), в заявке WO 96/15231, патенте США № 6100061, или в любой другой бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде, известной в данной области. Клетки предпочтительно выращивают от ампулы до крупномасштабного производства биомассы в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения культуру адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, выращивают до слияния и инфицируют вирусом после увеличения плотности клеток и концентрации микроносителя в биомассе культуры сливающихся клеток.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения культуру адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, выращивают до слияния и инфицируют вирусом до увеличения плотности клеток и концентрации микроносителя в биомассе сливающихся клеток. Независимо от того, была ли культура клеток, характеризующаяся более высокой плотностью и концентрацией микроносителя на единицу объема культуры, инфицирована до или после концентрирования культуры, плотность клеток и концентрация микроносителя в биомассе остаются постоянными во время размножения и продуцирования вируса, при этом объем среды больше не увеличивается. Для увеличения плотности клеток и концентрации микроносителя в биомассе культуры клеток, не инфицированных или инфицированных вирусом, можно использовать любой метод, применяемый в данной области для концентрирования культуры клеток. Такими методами могут быть, например, осаждение, центрифугирование, фильтрация, концентрирование в устройстве для перфузии, таком как сито, которые позволяют уменьшить рабочий объем или делают возможным применение систем с двумя или большим числом биореакторов.

Плотность культуры клеток и концентрация микроносителя в культуре клеток, выращиваемых до слияния, должны быть увеличены по крайней мере в 1,3 раза по сравнению с исходной биомассой, выращиваемой до слияния. Плотность клеток в исходной культуре, выращиваемой до слияния, может составлять от около 0,6×10⁶ до около 7,0×10⁶ клеток/мл. В таком случае биомасса, характеризующаяся более высокой плотностью клеток по сравнению с исходной биомассой культуры, может иметь плотность клеток, равную по крайней мере от 0,8×10⁶ до 9,0×10⁶ клеток/мл.

Концентрация микроносителя в исходной культуре клеток предпочтительно находится в пределах от около 0,5 г/л до около 7,0 г/л. Концентрация микроносителя после концентрирования биомассы сливающихся клеток предпочтительно находится в пределах от около 0,65 г/л до около 21 г/л.

Микроноситель, используемый в соответствии со способом по данному изобретению, предпочтительно выбирают из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, полистирола, полиакриламида, желатина, стекла, целлюлозы, полиэтилена и пластика и микроносителей, описанных Miller et al. (1989. Advances in Biochem Eng./Biotech. 39:73-95) и Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303).

В соответствии с одним вариантом осуществления способа по данному изобретению вирус выбирают из группы, включающей вирус гриппа, вирус Росс-Ривер, вирус гепатита А, вирус коровьей оспы и рекомбинантный вирус коровьей оспы, вирус простого герпеса, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, вирус желтой лихорадки и их химерные формы, а также риновирус и реовирус. Специалистам в данной области должно быть известно, как выбрать соответствующую клетку-хозяина и вирус, чувствительный к данному хозяину, и использовать способ по данному изобретению для увеличения выхода требуемого вируса.

Специалистам в данной области должно быть известно, как выбрать микроноситель соответствующего типа, концентрацию микроносителя в исходной культуре, адгезивные клетки, чувствительные к данному вирусу, среду и оптимальные условия выращивания, такие как концентрация кислорода, добавки, вводимые в среду, температура, рН, давление, скорость процесса и управление подпиткой, для получения биомассы культуры сливающихся клеток, которую можно использовать для получения биомассы с повышенной плотностью клеток и концентрацией микроносителя способом по данному изобретению. Культуру клеток, образующую биомассу с более высокой плотностью клеток, затем можно использовать для эффективного размножения и продуцирования вируса. После достижения слияния клеток в культуре способ по данному изобретению позволяет получить культуру с более высокой плотностью клеток и концентрацией микроносителя, которые по крайней мере в 1,3 и до 10 раз выше исходных показателей, и обеспечивает более высокий выход вируса на единицу объема культуры благодаря i) меньшему объему культуры и ii) более высокой продуктивности в расчете на клетку.

Способ получения вируса и время, затрачиваемое на его получение, зависят от используемой системы. Максимальный выход вируса, достигаемый в соответствующей системе, можно определить стандартными методами. После достижения максимального выхода вируса производят сбор вируса и/или клеток, содержащих данный вирус. Поэтому способ по данному изобретению далее включает стадию сбора размноженного и продуцированного вируса.

Другим объектом данного изобретения является способ получения очищенного вируса или вирусного антигена, который включает стадии получения культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, выращивания культуры клеток до слияния, инфицирования культуры клеток вирусом, причем плотность клеток в культуре клеток увеличивают (i) до инфицирования вирусом или (ii) после инфицирования вирусом, инкубации культуры клеток, инфицированных вирусом, с целью размножения указанного вируса, (f) сбора продуцированного вируса и (g) очистки собранного вируса.

В зависимости от природы вируса, используемого для инфицирования и размножения, продуцированный вирус или находится в супернатанте культуры клеток и/или ассоциирован с биомассой клеток. Литические вирусы, такие как вирус гриппа, вызывают лизис клеток через некоторое время после инфицирования, вследствие чего вирус высвобождается в культуральную среду. Продуцированный вирус, выделенный в культуральную среду, можно отделить от биомассы клеток или других фрагментов клеток известными методами, такими как центрифугирование, включая ультрацентрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности, микрофильтрация, ультрафильтрация, ионообменная хроматография и т.д., и очистить.

Нелитические вирусы размножаются внутри клеток и ассоциированы с клетками в биомассе. Чтобы получить такие вирусы, биомассу собирают, клетки лизируют обычными методами, такими как обработка клеток детергентом, тепловое воздействие, замораживание/оттаивание, обработка ультразвуком, прессование или другие методы лизиса клеток. Выделенные из клеток вирусы собирают, концентрируют и очищают. Вирусы можно очистить любым методом, известным в данной области, таким как ультрафильтрация, ионообменная хроматография, центрифугирование и т.д.

Вирус гриппа может размножаться в линиях клеток, включающих наиболее эффективные клетки MDCK, а также в линии клеток VERO, разрешенных к использованию при изготовлении вакцин для человека. В научной литературе описано крупномасштабное производство вируса гриппа в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде в культуре клеток млекопитающего на шариках микроносителя в биореакторе и получение вакцины из вируса гриппа (Merten et al., 1999, Dev. Biol. Stand. 98:23-37; Kistner et al., 1998. Vaccine 16:960-968; Kistner et al., 1999, Dev. Biol. Stand. 98:101-110 и заявка WO 96/15231).

Одним объектом данного изобретения является способ продуцирования вируса гриппа, который включает стадии получения культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, выращивания культуры клеток до слияния, инфицирования клеток вирусом гриппа, причем плотность клеток в культуре клеток увеличивают (i) до инфицирования вирусом или (ii) после инфицирования вирусом, инкубации культуры клеток, инфицированных указанным вирусом гриппа, для размножения вируса. Клетки, инфицированные вирусом гриппа, могут быть клетками VERO или MDCK, или любыми клетками, чувствительными к вирусу гриппа. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения используют клетки VERO, которые инфицируются вирусом гриппа. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения клетки VERO выращивают в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде от исходной ампулы до биомассы. Клетки VERO, прикрепленные к микроносителю, выращивают в приемлемой среде до слияния, при этом плотность клеток и концентрацию микроносителя увеличена по крайней мере в 1,3 раза. Клетки могут быть инфицированы вирусом гриппа до или после увеличения плотности клеток в культуре. После инкубации биомассы инфицированных клеток с высокой плотностью и продуцирования вируса собирают вирус гриппа или антиген вируса гриппа. Затем собранный вирус очищают методом, известным в данной области, таким как описанный в научной работе Kistner et al. 1998 (см. выше) или в патенте США № 6048537.

Другим объектом данного изобретения является биомасса культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, которая характеризуется высокой плотностью клеток, причем плотность клеток в культуре по крайней мере в 1,3 раза выше, чем в культуре клеток, выращенных до слияния. Культуру адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, выбирают из группы, включающей клетки, требующие прикрепления к подложке, VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF или диплоидные монослойные клетки. Биомасса культуры клеток с высокой плотностью предпочтительно является культурой клеток VERO.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения биомассу культуры клеток выращивают в бессывороточной среде, и указанная биомасса не содержит никаких веществ или агентов, выделенных из сыворотки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения биомасса не содержит сыворотки и белка и не включает выделенных из сыворотки веществ или белков, добавляемых в среду. Клетки предпочтительно выращивают в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде от исходной ампулы до биомассы. Биомассу с высокой плотностью клеток культивируют в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде во время размножения и продуцирования вируса.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения клетки инфицируют вирусом с более высокой плотностью по сравнению с культурой клеток, выращенных до слияния. В процессе размножения вирусов сохраняют плотность клеток и объем культуральной среды, содержащей биомассу с высокой плотностью клеток, инфицированных вирусом.

Другим объектом данного изобретения является биомасса культуры клеток VERO, прикрепленных к микроносителю, в которой плотность клеток по крайней мере в 1,3 раза выше, чем в культуре клеток VERO, выращенных до слияния. Полученная культура клеток характеризуется также более высокой концентрацией микроносителя по сравнению с клетками, выращенными до слияния.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения биомасса культуры клеток с более высокой плотностью является биомассой клеток VERO. Клетки предпочтительно выращивают в бессывороточной среде, и биомасса не содержит сыворотки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения биомасса культуры клеток не содержит сыворотки и белка.

Другим объектом данного изобретения является биомасса культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю и инфицированных вирусом, которая по крайней мере в 1,3 раза больше по сравнению с культурой клеток, выращенных до слияния, перед инфицированием и имеет более высокую плотность клеток. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения биомасса культуры клеток не содержит сыворотки. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения биомасса культуры клеток не содержит сыворотки и белка. Клетки предпочтительно являются клетками VERO. Плотность клеток в биомассе с высокой плотностью клеток, инфицированных вирусом, не уменьшается в течение всего процесса размножения вируса.

Другим объектом данного изобретения является биомасса культуры клеток VERO с высокой плотностью, прикрепленных к микроносителю, которая по крайней мере в 1,3 раза больше по сравнению с культурой клеток VERO, выращенных до слияния и инфицированных вирусом. Клетки VERO инфицируют вирусом, выбираемым из группы, включающей вирус гриппа, вирус Росс-Ривер, вирус гепатита А, вирус коровьей оспы и их рекомбинантные производные, вирус простого герпеса, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, вирус желтой лихорадки и их химерные формы, а также риновирус и реовирус.

Другим объектом изобретения является биомасса культуры клеток VERO с высокой плотностью, прикрепленных к микроносителю и инфицированных вирусом гриппа, которая по крайней мере в 1,3 раза больше по сравнению с культурой клеток VERO, выращенных до слияния.

Другим объектом данного изобретения является биомасса культуры клеток VERO с высокой плотностью, прикрепленных к микроносителю и инфицированных вирусом Росс-Ривер, которая по крайней мере в 1,3 раза больше по сравнению с культурой клеток VERO, выращенных до слияния.

Другим объектом данного изобретения является биомасса культуры клеток VERO с высокой плотностью, прикрепленных к микроносителю и инфицированных вирусом гепатита А, которая по крайней мере в 1,3 раза больше по сравнению с культурой клеток VERO, выращенных до слияния.

Общее описание настоящего изобретения станет более понятным со ссылкой на нижеследующие примеры, которые приведены только с целью иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем, за исключением особо оговоренных случаев.

Пример 1

Продуцирование вирусного антигена в концентрированной биомассе клеток VERO

а) Выращивание культуры клеток

Клетки VERO (африканская зеленая мартышка, Cercopthecus aethiops, почка) использовали в качестве продуцирующей линии клеток. Указанные клетки были получены из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт. Мэриленд, с количеством пассажей 124 и имели обозначение ATCC CCL 81. Клетки адаптировали для выращивания в бессывороточной или бессывороточной и безбелковой среде, описанной в работе Kistner et al., 1998 (см. выше), заявке WO 96/15231 или патенте США № 6100061. Для выращивания в бессывороточной среде использовали основную среду DMEM HAM F12, содержащую неорганические соли, аминокислоты, бикарбонат натрия (2 г/л) и дрожжевой или соевый экстракт (0,1-10 г/л). Банк рабочих клеток был получен без использования каких-либо выделенных у животных компонентов среды.

Клетки из банка рабочих клеток выращивали в Т-образных колбах и роллерных флаконах с индексом разведения 1:6 или 1:8. Затем клетки размножали в биореакторе объемом 100 л с механическим перемешиванием, используя микроноситель Cytodex® в качестве субстрата для прикрепления клеток. Клетки выращивали при 37°С в течение 6-8 дней. Условия культивирования соответствовали насыщению кислородом 20%±10% и рН 7. Постоянно поддерживали 25±0,35. В конце образования биомассы, когда клетки достигали стадии слияния, одну часть объема биомассы в реакторе концентрировали в два раза путем осаждения и определяли плотность клеток в неконцентрированной и концентрированной культуре клеток.

b) Определение плотности клеток в биомассе

Число клеток в биомассе культуры клеток в конце образования биомассы определяли, обрабатывая клетки трипсином и производя подсчет в цитометре CASY® (метод А) по методу Scharfe et al. (1988. Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096-1103) или обрабатывая клетки лимонной кислотой и кристаллическим фиолетовым и производя подсчет в гемоцитометре (метод В) по методу Sanford et al. (1951. J. Natl. Cancer Inst. 11:773-795). Плотность клеток и концентрацию носителя для клеток VERO в конце образования биомассы и после концентрирования биомассы сливающихся клеток (до инфицирования) высчитывали методом А или В. Полученные данные приведены в табл.1.

Таблица 1
Определение числа клеток в культуре сливающихся клеток в конце образования биомассы и после концентрирования культуры сливающихся клеток Полученная биомассаКонцентрированная биомассаКонцентрация носителя, г/л5,010,0Плотность клеток, число клеток/мл (метод А)4,6×10⁶9,2×10⁶Плотность клеток, число клеток/мл (метод В)5,6×10⁶11,2×10⁶

Пример 2

Сравнение продуцирования вирусного антигена в биомассе сливающихся клеток и концентрированной биомассе сливающихся клеток

Клетки VERO с определенным количеством пассажей оттаивали из жидкого азота и пассировали во взбалтываемых и роллерных флаконах, чтобы получить достаточное число клеток для инокуляции биореактора объемом 1,5 литра. После слияния клеток с достижением конечной плотности 1,5×10⁶ клеток/мл клетки обрабатывали трипсином и переносили в биореактор объемом 10 литров. Указанный биореактор, в свою очередь, использовали в качестве инокулятора для биореактора объемом 100 литров с концентрацией микроносителя 1,5 г/л. При использовании в начале процесса ампулы банка рабочих клеток, содержащей 107 клеток, потребуется примерно 30 поколений клеток для получения конечной биомассы сливающихся клеток VERO. Культуру выращивали до слияния с достижением конечной плотности клеток 1,9×10⁶/мл. До инфицирования вирусом в систему из двух биореакторов объемом 10 литров загружали биомассу культуры клеток с разным общим числом клеток. В ферментер А загружали 1,9×10¹⁰ клеток и в ферментер В загружали в общей сложности 3,8×10¹⁰ клеток. Для достижения большей концентрации биомассы и носителя в ферментере В культуру клеток, выращенную до слияния, концентрировали в два раза путем осаждения биомассы. Ферментер А содержал 100% биомассы клеток, и ферментер В содержал 200% биомассы клеток по сравнению с исходной культурой клеток, выращенной до слияния.

а) Продуцирование вируса гриппа

Культуру клеток в ферментерах А и В инфицировали штаммом вируса гриппа H3N2 A/Sydney/5/97 с множественностью заражения, равной 0,01. Клетки культивировали в одинаковых условиях, параметры которых соответствовали 32°С, 20% рО₂ и рН 7,1. Чтобы активировать размножение вируса гриппа, добавляли протеазу, такую как трипсин, проназа или их трипсиноподобная часть.

Определяли продуцирование вирусного антигена в двух разных культурах клеток в ферментерах А и В, содержащих биомассу в разных концентрациях, и сравнивали полученные результаты на основании титра вируса гриппа (гемагглютинирующие единицы/мл) и содержания антигена (антиген, очищенный с градиентом плотности). Максимальная площадь соответствует общей концентрации антигена в конце литического цикла на 3-й день после инфицирования. Полученные данные приведены в табл.2.

Таблица 2
Определение титра вируса гриппа и антигена в культуре сливающихся клеток VERO и концентрированной биомассе сливающихся клеток VEROФерментерАВКонцентрация носителя1,5 г/л3,0 г/лПлотность клеток, число клеток/мл (метод В)1,90×10⁶3,80×10⁶Гемагглютинирующие единицы/мл6402560Площадь пика (относительные единицы)83,3 (100%)412,3 (495%)

b) Продуцирование вируса Росс-Ривер

Клетки VERO размножали вышеописанным способом до слияния с конечной плотностью 1,6×10⁶ клеток/мл. До инфицирования вирусом в систему из двух биореакторов объемом 50 л загружали биомассу культуры клеток с разным общим числом клеток. В ферментер А загружали 1,6×10⁶ клеток/мл и в ферментер В загружали 2,3×10⁶ клеток/мл, что в 1,5 раза превышало концентрацию биомассы культуры сливающихся клеток. Ферментеры А и В инфицировали вирусом Росс-Ривер и определяли продуцирование вирусного антигена в ферментерах А и В вышеописанным способом. В табл.3 приведены результаты выхода вируса, полученного при разных концентрациях биомассы для размножения вируса.

Таблица 3
Определение титра вируса Росс-Ривер и продуцирования антигенаФерментерАВКонцентрация носителя, г/л1,52,25Плотность клеток (×10⁶ клеток/мл)1,62,3Титр вируса (log TCID₅₀)8,718,95Титр вируса, бляшкообразующие единицы/10⁶ клеток (×10⁶)321388Выход (%)100121

Пример 3

Продуцирование вирусного антигена в концентрированной биомассе RK-клеток

а) Выращивание культуры клеток

В качестве продуцирующих линий клеток использовали клетки почки кролика RK-13 или комплементарные производные указанных клеток RK-D4R-44 по методу, описанному Холзером и др. (Holzer et al., 1997, J. Virol. 71:4997-5002). Клетки выращивали в обычной среде, содержащей 2% сыворотки.

Клетки из банка рабочих клеток выращивали в Т-образных колбах и роллерных флаконах с индексом разведения, равным 1:6. Дальнейшее размножение клеток производили в биореакторах объемом 10 л с механическим перемешиванием, используя микроносители Cytodex® (Pharmacia) в качестве субстрата для прикрепления клеток.

b) Продуцирование дефектного вируса коровьей оспы

После слияния клеток RK-13 или RK-D4R-44 и достижения конечной плотности клеток в биореакторах с механическим перемешиванием биомассу инфицировали вирусом коровьей оспы WR или дефектным вирусом коровьей оспы vD4-ZG#2 по методу, описанному Холзером и др. (Holzer et al., 1997, см. выше), с множественностью заражения, равной 0,01. После инфицирования клеток в систему с двумя биореакторами объемом 10 л загружали биомассу культуры инфицированных клеток с разным общим числом клеток. В ферментер А загружали 1,2×10¹⁰ клеток и в ферментер В загружали 2,4×10¹⁰ клеток. Для достижения большей биомассы и концентрации носителя в ферментере В культуру инфицированных клеток, выращенную до слияния, концентрировали путем осаждения биомассы для достижения более высокой концентрации. Ферментер А содержал 100% биомассы клеток, и ферментер В содержал 200% биомассы клеток, выращенных до слияния из исходной культуры клеток. Определяли продуцирование вирусного антигена в двух ферментерах А и В с разными культурами клеток, содержащих биомассу с разной концентрацией на единицу объема среды инфицированных клеток. Полученные результаты суммированы в табл.4.

Таблица 4
Определение титра вируса коровьей оспы в RK-клеткахФерментерАВКонцентрация носителя, г/л1,52,5Плотность клеток (×10⁶ клеток/мл)1,22,4Титр вируса, бляшкообразующие единицы/10⁶ клеток (×10⁶)0,81,3Выход (%)100162

Приведенные выше примеры служат только для иллюстрации данного изобретения, не ограничивая его объем. Другие варианты осуществления настоящего изобретения, которые должны быть очевидны специалистам в данной области, также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и заявки на патенты, приведенные в данном описании изобретения, включены в него в качестве ссылки для всевозможных целей.

Изобретение относится к области вирусологии. Способ включает получение культуры адгезивных клеток и их выращивание. Далее проводят инфицирование клеток вирусом и инкубацию клеток. При этом плотность клеток биомассы культуры клеток, выращенных до слияния, увеличивают по крайней мере в 1,3 раза до или после инфицирования клеток вирусом. Способ позволяет обеспечивать повышение продуцирования вируса в малом объеме клеточной культуры. Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии. 12 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ продуцирования вируса или вирусного антигена, включающий стадии (a) получения культуры адгезивных клеток, прикрепленных к микроносителю, (b) выращивания культуры клеток до слияния, (c) инфицирования клеток вирусом и (d) инкубации указанной культуры клеток, инфицированных вирусом, для размножения указанного вируса, в котором плотность клеток биомассы культуры клеток, выращенных до слияния, увеличивают по крайней мере примерно в 1,3 (i) до выполнения стадии (с) или (ii) после выполнения стадии (с) и плотность клеток сохраняют увеличенной во время выполнения стадии (d), и дополнительно включающий следующие необязательные стадии: е) сбор размноженного вируса, f) очистка собранного вируса для получения очищенного вируса или вирусного антигена.2. Способ по п.1, в котором плотность клеток в культуре клеток, выращиваемых до слияния, составляет от около 0,6·10⁶ до около 7,0·10⁶ клеток/мл.3. Способ по п.1, в котором микроноситель выбирают из группы микроносителей, изготовленных из декстрана, коллагена, полистирола, полиакриламида, желатина, стекла, целлюлозы, полиэтилена и пластика.4. Способ по п.1, в котором концентрация микроносителя в культуре клеток на стадии (а) составляет от около 0,5 г/л до около 14 г/л.5. Способ по п.1, в котором указанные клетки выбирают из группы адгезивных клеток, включающих VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF или диплоидные монослойные клетки.6. Способ по п.1, в котором указанные клетки, прикрепленные к микроносителю, выращивают в бессывороточной среде.7. Способ по п.1, в котором указанные клетки, прикрепленные к микроносителю, выращивают в бессывороточной и безбелковой среде.8. Способ по п.1, в котором вирус выбирают из группы, включающей вирус гриппа, вирус Росс-Ривер, вирус гепатита А, вирус коровьей оспы и их рекомбинантные производные, вирус простого герпеса, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, вирус желтой лихорадки и их химерные формы, риновирус и реовирус.9. Способ по п.1, в котором продуцированный вирус собирают из супернатанта культуры клеток.10. Способ по п.1, в котором продуцированный вирус собирают из биомассы клеток.11. Способ по п.10, в котором вирус или вирусный антиген представляют собой вирус гриппа или антиген вируса гриппа.12. Способ по п.10, в котором указанные клетки являются клетками VERO.13. Способ по п.10, в котором указанные клетки являются клетками MDCK.