СПОСОБ СУСПЕНЗИОННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФИЛОВИРУСОВ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии, а именно к технологии культивирования in vitro филовирусов Эбола и Марбург для получения препаративных количеств вирусов с целью изучения их биологических свойств, а также создания рекомбинантных вакцин.

Вирус Эбола был выделен в 1976 г. и вместе с вирусом Марбург отнесен к семейству Filoviridae. Филовирусы, являясь возбудителями геморрагических лихорадок, принадлежит к группе вирусов, вызывающих особо опасные заболевания.

Средства специфической профилактики и терапии заболеваний, вызванных филовирусами, не разработаны (Геморрагическая лихорадка Эбола в Заире в 1976 г. Отчет международной комиссии. Бюллетень ВОЗ 1988, т. 56, N 2, c. 213 - 237). Особо следует отметить, что данные, полученные при проверке экспериментальных образцов инактивированных вакцин, ставят под сомнение возможность индукции иммунитета к филовирусам с помощью инактивированных вирусных белков (Lange J. V. Mc Cormick J.B. Walker D.H. et. al. Vaccination Rhesus monkeys with inactivated Ebola virus and results of live-virus. Abst. Ann. Mee. Ancer. Soc. Microbiol. Las Vegas, Nevada, 3 7 March. CDC, Atlanta, 1985, p. 295). Проведение же генно-инженерных работ с целью создания рекомбинантных вакцин требует весьма большого количества вируса.

В этих условиях вопрос о разработке эффективного и достаточно безопасного способа культивирования вирусов Эбола и Марбург с высоким выходом этих вирусов приобретает особую остроту. Наиболее перспективным,как показывает опыт, является выращивание в ферментерах вирусов в клеточных культурах на микроносителях.

Известен способ культивирования вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки. Способ включает приготовление среды Игла МЕМ, заражение монослоя клеток Vero-E6 в роллерных бутылях бляшечно-очищенным вирусом Марбург или Эбола со множественностью инфекции 10^-1 10^-2 БОЕ/кл. После 30 мин адсорбции клетки инкубируют при 37^oC в минимальной среде Игла. Урожай вируса снимают через 5 7 дней после заражения [1]
Недостатком аналога является то, что указанным способом нельзя получать вирусы Эбола и Марбург в больших объемах на монослое в роллерных бутылях. Кроме того, данная технология не удовлетворяет условиям культивирования особо опасных инфекций, к которым относятся указанные вирусы.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ суспензионного культивирования вирусов в клеточных культурах на микроносителях, включающий заполнение биореактора ростовой питательной средой, введение в питательную среду микроносителей и культуру клеток, сорбцию клеток на микроносители при периодическом перемешивании питательной среды, выращивание культуры клеток на микроносителях до экспоненциальной фазы роста при постоянном перемешивании культуральной жидкости, обеспечивающем взвешенное состояние микроносителей с клетками, декантирование отработанной на этапе выращивания клеток ростовой среды и введение поддерживающей питательной среды, заражение вирусом культуры клеток на микроносителях, выращивание вируса в клетках при постоянном перемешивании питательной среды, обеспечивающем взвешенное состояние микроносителей с клетками, и удаление вируса из биореактора в стационарной фазе накопления с последующей периодической сменой культуральной питательной среды на новую, периодическим повторным культивированием вируса и периодическим повторным его удалением из биореактора [2]
Недостатком прототипа является значительная длительность процесса суспензионного культивирования вирусов вследствие того, что технология предусматривает вначале выращивание на микроносителях клеток в течение нескольких суток, а затем инфицирование клеток вирусом и культивирование этого вируса с последующим периодическим его удалением из ферментера.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа суспензионного культивирования вирусов на микроносителях, который обеспечивал бы значительное сокращение сроков культивирования этих вирусов.

Предлагаемая задача решается тем, что в способе, включающем введение в емкость с питательной средой микроносителей и посевной дозы культуры клеток, сорбцию клеток на микроносители и выращивание их на поверхности микроносителей при перемешивании суспензии, а также инфицирование вирусом культуры клеток, культивирование этого вируса в клетках и удаление внеклеточного вируса из ферментера в стационарной фазе накопления с последующей периодической сменой питательной среды на свежую и дальнейшим культивированием вируса до стационарной фазы накопления и периодическим удалением его из ферментера, согласно изобретения, инфицирование клеток вирусом производят до посева их в питательную среду или после посева в эту среду в период сорбции клеток на микроносители, а культивирование клеток на микроносителях и вируса в клетках осуществляют одновременно. В качестве культур клеток для наработки в них филовирусов используют перевиваемые линии клеток vero клон E6 или диплоидные клетки фибробластов человека линия Л-68.

В процессе экспериментальных исследований подобраны такие клетки млекопитающих, которые способны образовывать устойчивые монослои этих клеток на микроносителях в питательной среде и длительное время продуцировать вирусы Эбола и Марбург, не теряя своих основных физиологических функций, т.е. не разрушаясь. Кpоме того, выявлена возможность инфицирования вирусом клеток vero клон Е6 и Л-68 до посева последних в питательную среду или в процессе сорбции клеток на микроносители в питательной среде до начала выращивания этих клеток с последующим их культивированием. Время культивирования при этом сокращается в 1,5 2 раза по сравнению с прототипом.

Способ суспензионного культивирования вирусов Эбола и Марбург в клеточных культурах на микроносителях осуществляют следующим образом. Для культивирования использовали модифицированные ферментеры фирм NBS (США) и LKB (Швеция) объемом от 2 до 17,5 л, оснащенные перемешивающими устройствами с верхним способом крепления привода. Ферментер заполняют на 25% питательной средой DMEM c 5%-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (КРС). В питательную среду вводят микроносители Цитодекс-3 в количестве 3 5 г на 1 л и перевиваемую культуру клеток vero клон Е6 или диплоидные клетки фибробластов человека (линия Л-68) в количестве 0,3 0,5 млн. кл/мл. Указанные клетки предварительно инфицируют вирусом Эбола (штамм Мау, Заир) или вирусом Марбург с множественностью заражения 0,01 0,1 БОЕ/кл. Клетки также могут быть инфицированы путем их введения в питательную среду вместе с вирусной суспензией. Время сорбции вируса на клетки составляет 30 40 мин.

Далее инфицированные клетки сорбируют на микроносители при периодическом перемешивании суспензии в течение 3 4 ч. Время одного цикла перемешивания составляет 1 2 мин, а интервалы между перемешиваниями составляют 20 30 мин. После прикрепления клеток на поверхность микроносителей объем суспензии удваивают (до 50% объема ферментера) добавлением среды ДМЕМ с 5%-ной эмбриональной сывороткой КРС и запускают ферментер для культивирования клеток и наработки в них вируса при постоянном перемешивании парусной мешалкой со скоростью 40 60 об/мин. Способ аэрирования клеток поверхностностный со скоростью 1 4 л/ч на каждый литр суспензии. рН поддерживают в интервал /7,2 ± 0,2, а температуру 37^oC в автоматическом режиме. Через 2 3 сут концентрация клеток на микроносителях достигает 1 2•10⁶ кл/мл, а вируса 1•10^6,5 БОЕ/мл. При этом вируссодержащую суспензию с внеклеточным вирусом удаляют из ферментера, а свежую питательную среду ДМЕМ с 5%-ной эмбриональной сывороткой КРС добавляют и цикл культивирования вируса, равный двум суткам, повторяют с достижением титра вируса около 1•10^6,5 БОЕ/мл (стационарная фаза накопления).

Количество циклов культивирования со съемом урожая вируса составляет 5 - 6 раз, что дает около 100 мг вируса Эбола или Марбург в 10-литровом ферментере.

Электронно-микроскопическое исследование отобранных проб показало наличие характерных морфологических форм вирусов Эбола и Марбург, описанных в литературе (Ellis D.S. Stamford S. m L. Loyd C. Bowen E.T.W. Platt G.S. Way H. Simpson D.I.H. "Ebola and Marburg Viruses some ultrastructural differences between strains when grown in Vero cells". I; Med Virol. 1980, v. 5, n 4, p. 201 211). Сравнительным титрованием было показано, что соотношение числа БОЕ к числу патогенных для обезьян частиц был 1:100, т.е. легко достигаемый уровень 10⁶ БОЕ/мл соответствовал 10⁸ ЛД₅₀/мл. Число физических частиц, определенных сканированием электронно-микроскопических срезов отобранных проб, достигало в пересчете на исходный объем вируссодержащей жидкости 10⁹ частиц/мл. Процент колбочковидных, т.е. наиболее зрелых с точки зрения морфологии вирионов достигал 60% Соотношение внеклеточного и внутриклеточного пулов вирусных частиц (измеренных в БОЕ) определяют как 9:1.

Описанный способ культивирования вируса Эбола и Марбург легко масштабируется. Так аналогичные результаты получены при выращивании вируса Эбола и Марбург в 1,0, 2,0, 8,0, 17,5 литровых ферментерах.

По сравнению с прототипом цикл культивирования вируса в предлагаемом способе сокращается в 1,5 2 раза.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине и вирусологии с целью получения препаративных количеств вирусов Марбург и Эбола для создания рекомбинантных вакцин и диагностических препаратов.

Использование: медицина. Сущность способа заключается в инфицировании клеточных культур vero клон Е6 или диплоидных клеток линии Л-68 вирусом Эбола или Марбург и введением их и микроносителей в ферментер с питательной средой. Культивирование инфицированных клеточных культур и вируса Эбола или Марбург осуществляют одновременно. Внеклеточный вирус удаляют их ферментера в стационарной фазе накопления с последующей периодической сменой питательной среды на свежую и дальнейшим культивированием вируса до стационарной фазы накопления и периодическим удалением его из ферментера. Способ позволяет сократить цикл культивирования в 1,5 - 2 раза. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ суспензионного культивирования филовирусов в клеточных культурах на микроносителях, включающий введение в емкость с питательной средой микроносителей и посевной дозы культуры клеток, сорбцию клеток на микроносители и выращивание их на поверхности микроносителей при перемешивании суспензий, а также инфицирование вирусом культуры клеток, культивирование вируса в клетках и удаление внеклеточного вируса из ферментера в стационарной фазе накопления с последующей периодической сменой питательной среды на свежую и дальнейшим культивированием вируса до стационарной фазы накопления и периодическим удалением его из ферментера, отличающийся тем, что инфицирование клеток вирусом производят до посева их в питательную среду или после посева в эту среду в период сорбции клеток на микроносителе, а культивирование клеток на микроносителях и вируса в клетках осуществляют одновременно. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из культур клеток используют перевиваемую линию клеток Vero клон Е6. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из культур клеток используют диплоидные клетки фибробластов человека линии Л-68.