СПОСОБ СЛИЯНИЯ КЛЕТОК Российский патент 1995 года по МПК C12N15/06 C12N5/06 

Изобретение относится к биологии, в частности к биотехнологии, и может быть использован для получения гибридных клеток.

Существуют несколько способов слияния клеточных мембран в модельных опытах in vitro, где в качестве индукторов слияния используют ряд химических агентов, таких как хлористый лантан [1] лизолецитин [2] олеат глицерина и полиэтилен- гликоль [3]
Наиболее близким по техническому решению является способ слияния клеток взятый за прототип [4] включающий выделение эритроцитов из крови, их отмывание, инкубацию клеток в фосфатном буфере в течение 10 мин, центрифугирование суспензии с целью удаления супернатанта, добавление хлористого кальция с инкубацией при комнатной температуре в течение 10 мин. Подготовленные таким образом клетки инкубируют 1 ч при 37^оС.

Однако этот метод достаточно продолжителен, так как требует длительной подготовки клеток для слияния. Существует потребность в ускорении процесса слияния клеток.

Поставленная задача решается способом, который заключается в том, что эритроциты выделяют из крови, отмывают, добавляют фосфатный буфер, затем эта суспензия активно перемешивается с раствором буфера, содержащим 20-25 мМ хлористого кальция, до конечной концентрации неорганического фосфата 0,7-1,1 мМ и инкубируют при 37^оС.

Способ осуществляется следующим образом. Полученную кровь человека центрифугируют, убирают плазму, а эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором, 0,05 мл отмытых эритроцитов помещают в 0,1 мл среды, содержащую 146 мМ NaCl, 32-34 мМ Na₂HPO₄, 6-8 мМ KH₂PO₄ (рН 7,4), затем эту суспензию интенсивно перемешивают с 5,0 мл раствора, содержащего 146 мМ NaCl, 15 мМ HEPES (рН 7,4), 20-25 мМ CaCl₂. Полученные таким образом агрегаты помещают на водяную баню при 37^оС на 1 ч.

Концентрация неорганического фосфата обусловлена тем, что при конечной концентрации ионов РО₄^3-, в 20-25 мМ растворе CaCl₂, менее 0,7 мМ агрегации клеток не наблюдается или она очень незначительна, а при концентрации более 1,1 мМ происходит гемолиз клеток во время инкубации при 37^оС (см. таблицу).

Слияние клеток контролируют с помощью светового микроскопа. Наибольшее количество слившихся клеток наблюдалось при концентрации CaCl₂ 22-23 мМ и конечной концентрации неорганического фосфата 0,7-0,9 мМ. Работа проводилась на эритроцитах, полученных от 20 доноров.

Способ, по сравнению с взятым за прототип, позволяет сократить время, необходимое для проведения эксперимента, на 30-40 мин. Таким образом предложенный способ слияния более удобен и экономит время, необходимое для получения гибридных клеток.

Использование: биология, в частности биотехнология для получения гибридных клеток. Сущность применения: к выделенным и отмытым эритроцитам добавляется фосфатный буфер, затем эта суспензия смешивается с раствором буфера, содержащим 20 - 25 мМ CaCl₂ , до конечной концентрации неорганического фосфата 0,7 - 1,1 мМ и инкубируют при 37°С. 1 табл.

СПОСОБ СЛИЯНИЯ КЛЕТОК, включающий выделение эритроцитов из крови, их отмывание с последующей инкубацией в фосфатном буфере в присутствии хлорида кальция, отличающийся тем, что предварительно готовят буферный раствор с содержанием хлорида кальция 20-25 мм pH 7,4, который добавляют к эритроцитам в фосфатном буфере в соотношении 3 100, а инкубацию проводят в один этап при конечной концентрации неорганического фосфата 0,7 1,1 ммоль.