КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР ОТ ГРИБНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 2008 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, точнее к защите растений от болезней, и является композицией, состоящей из природных полимеров и микроорганизмов-антагонистов фитопатогенов.

Изобретение может найти широкое применение для предпосевной обработки семян, посадочного материала, вегетирующих растений, для внесения в почву перед посевом (посадкой) культур в качестве средства биологической защиты растений от болезней, экологически безопасного и по эффективности не уступающего фунгицидам.

Композиции на основе хитозана широко используются в растениеводстве в качестве регуляторов роста (1) и для повышения устойчивости к болезням (2).

Аналогом заявленной композиции служит препарат близкого состава - Фитохит (маннит-сукцинат хитазония), который зарегистрирован как росторегулятор (3).

Недостатком этих композиций является невысокая биологическая эффективность в отношении фитопатогенов.

В качестве прототипа взята композиция по патенту РФ № 2158510, заявл. 15.05.1997 г.) следующего состава (мас.%):

Хитозан0,05-0,3Янтарная кислота0,03-0,2Глутаминовая кислота0,02-0,1гетероауксин0,006-0,05Водадо 100 мл

Массовое соотношение хитозан:кислота 1:1.

Основным недостатком прототипа на основе хитозана в сочетании с биологически активными веществами является то, что их биологическая активность основана только на повышении болезнеустойчивости через измененный обмен веществ в самих растениях, а прямой биоцидной активностью композии практически не обладают.

Задачей предлагаемого изобретения является усиление защитного действия композиции против основных болезней овощных культур, т.е. повышение ее биологической эффективности.

Задача решена введением в состав известной композиции дополнительно хитина и культур микробов-антагонистов фитопатогенных грибов и бактерий в определенном соотношении. В качестве микробов-антагонистов она содержит Bacillus subtilis M-22 или Trichoderma lignorum T-36.

Усиление защитного эффекта заявленной композиции обусловлено сочетанием антагонистических свойств микроба-антагониста со способностью хитозана совместно с биологически активными веществами регулировать обмен веществ в растениях, усиливать образование в них антипатогенных соединений и, тем самым, повышать болезнеустойчивость растений. При этом наблюдается повышение антигрибной и антибактериальной активности композиции, основанной на синергетическом эффекте действия составляющих ее компонентов.

Хитин - природный биополимер, который является не только сырьем для получения хитозана, но и используется в сельском хозяйстве в качестве защитного средства, в частности против фузариозного увядания овощных культур (4).

Штаммы микробов-антагонистов Bacillus subtilis M-22 и Trichoderma lignorum T-36 хранятся в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР и применяются в качестве продуцентов биопрепаратов Гамаира и Триходермина (5,6). Однако биологическая эффективность применения этих биопрепаратов часто нестабильна и в высокой степени зависит от условий окружающей среды, что снижает их защитное действие против болезней овощных культур. В заявленной композиции хитин и хитозан являются субстратом для питания микробов-антагонистов, способствуют их быстрому размножению и лучшей выживаемости, обеспечивают усиление активности ферментов (хитиназ, хитозанах, глюканаз) штаммов В. subtilis Т. lignorum, что, в свою очередь, повышает их антагонистическую активность, выступают в качестве индукторов защитных реакций растений. Биологическая активность микробов-антагонистов в составе композиции проявляется в течение более длительного времени и в меньшей степени зависит от экологических условий применения препарата, что усиливает их защитное действие.

Заявленную композицию получают путем смешивания водной суспензии порошка, содержащего хитозан, хитин, янтарную, глутаминовую кислоты и гетероауксин, с культурой микроба-антагониста в соотношении 1:1.

Хитозан взят с молекулярной массой 10000-150000 дальтон и степенью дезацетилирования 65-97% при следующем соотношении компонентов, г:

Хитозан, М 100-150 кДа0,03-3,0Хитозан, M 10-15 кДа0,007-0,7Хитин0,025-2,5Янтарная кислота0,007-0,7Глутаминовая кислота0,03-3,0Гетероауксин0,001-0,1Водадо 100 гКультуры Bacillus subtilis M-22 или Trichoderma lignorum T-36 

Культуру бактерии Bacillus subtiliss штамм М-22 или гриба Trichoderma lignorum штамм T-36 смешивают с композицией в соотношении 1:1.

Культуры микробов-антагонистов получают следующим образом:

1. Применительно к Bacillus subtiliss штамм M-22 глубинным культивированием штамма микроорганизма на питательной среде, содержащей 3% кукурузного экстракта и 1,5% мелассы, в течение 3-х суток при 24-26°С (5);

2. Применительно к Trichoderma lignorum Т-36: глубинным культивированием штамма микроорганизма на питательной среде, содержащей 0,1% К₂HPO₄, 0,3% KCI, 0,05% MgSO₄, 2% крахмала или глюкозы, в течение 3-х суток при 24-26°С (6).

Титр клеток штаммов микробов-антагонистов в приготовленных композициях колеблется в следующих пределах:

В. subtilis M-22: 10⁶-10-¹⁰ КОЕ/мл

Т. lignorum T-36: 10⁵-10⁸ КОЕ/мл

Примеры конкретной реализации изобретения.

Эффективность действия композиции заявленного состава в защите всходов огурца от поражения фузариозной инфекцией (возбудитель Fusarium oxysporum) представлена в табл.1.

Семена огурца сорта Феникс, предварительно обеззараженные 0,1% раствором AgNO₃, замачивали в 100 мл суспензии заявленной композиции в течение 4-х часов. Затем семена подсушивали на воздухе 3-4 часа и заражали суспензией гриба Fusarium oxysporum с таким расчетом, чтобы инфекционная нагрузка составила 0,8×10⁴ инфекционных единиц на 1 семя. После заражения семена раскладывали в стерильные влажные камеры (чашки Петри) со слоем ваты и фильтровальной бумаги, увлажненные стандартно стерильной водой. В каждую чашку Петри помещали по 20 семян; повторность опыта - 10-кратная. Чашки с семенами выдерживали при температуре 25-27°С в течение 12 дней. Учет пораженности растений болезнью проводили по стандартной методике (7) в сравнении с контролем (п.1) и прототипом (п.5), табл.1.

Предварительное замачивание семян огурца проводили в композиции заявленного состава, но с различным содержанием компонентов в г (табл.1, пр.2, 3, 4).

Пример 1 (пп.2, табл.1) показывает, что этот состав заявленной композиции снижает пораженность фузариозной ифекцией проростков огурца на 37,5% по сравнению с контролем и на 15,6% эффективнее прототипа (п.5).

Пример 2 (пп.3, табл.1) демонстрирует высокую эффективность заявленной композиции против фузариозной инфекции растений огурца. Состав композиции снижает пораженность растений огурца на 55,4% по сравнению с контролем и на 32,5% эффективнее прототипа (пп.5).

Пример 3 показывает, что заявленная композиция так же, как в примерах 1 и 2, но при соотношении компонентов в табл.1 (пп.4), эффективнее прототипа на 10,0%.

Выявленные границы концентраций заявленной композиции являются оптимальными по эффективности защитного действия заявленной композиции от фузариозной инфекции.

Снижение концентраций компонентов ведет к понижению эффективности композиции. Повышение же содержания компонентов нецелесообразно, так как с увеличением концентрации компонентов не повышается биологическая эффективность композиции.

Наибольшую биологическую активность показал состав (пп.3), пример 2. При замачивании семян огурца в заявленной композиции этого состава снижается пораженность проростков и семян огурца фузариозной инфекцией, и по эффективности действия данный состав превосходит прототип на 32,5% и 24,5% соответственно.

Выявлено положительное влияние всех вариантов композиции на всхожесть семян, длину корешка на фоне заражения семян инфекцией. Наилучшей регулирующей активностью обладает также состав (пп.3). Установлено, что замачивание семян огурца в заявленной композиции, состав (пп.3), повышает всхожесть на 13,% по сравнению с контролем и на 9,7% по сравнению с прототипом (пп.5).

=Пример 4 подтверждает высокую биологическую эффективность заявленной композиции при обработке семян огурца против поражения растений возбудителем фузариозной гнили (Fusarium oxysporum), табл.2. Обработку семян огурца (сорт Феникс) проводили путем замачивания в течение 4-х часов в суспензии композиции состава (г):

Хитозан, М 100-150 кДа0,3Хитозан, М 10-15 кДа0,07Хитин0,25Янтарная кислота0,07Глутаминовая кислота0,3Гетероауксин0,01Водадо 100Bacillus subtilis M-2210⁸ КОЕ/мл

Культуру Bacillus subtilis M-22 смешивают с композицией в соотношении 1:1.

В качестве эталона использовали фунгицид ТМТД (тетраметилтиурамдисульфид) 4 кг на 1 тонну семян (пп.3, табл.2). Контрольные семена замачивали в воде и высевали в сосуды с инфицированной землей (10⁷ конидий гриба F. oxysporum на 1 кг почвы). Предпосевная обработка семян композицией (пп.2) снижает распространенность фузариозной гнили на 30-е сутки опыта эффективнее (55,7%), чем фунгицид ТМТД (15,7%) и прототип (14,3%).

На фоне увеличения количества пораженных растений огурца во всех вариантах опыта заявленная композиция более эффективно сдерживает распространение болезни, снижая количество больных растений в течение 30 суток более чем в 2 раза по сравнению с контролем и прототипом

Биологическая эффективность композиции, содержащей в качестве антагониста штамм бактерии Trichoderma lignorum T-36, в защите томата от фузариозного увядания в зависимости от соотношения компонентов заявленного состава колебалась от 46,1 до 57,9% (табл.3, пп.2, 3, 4). Установлен диапазон оптимальных концентраций компонентов композиции, выше и ниже которых ее биологическая эффективность снижается.

При получении композиции культуру Trichoderma lignorum T-36 смешивали с компонентами композиции в соотношении 1:1 и полученную водную суспензию вносили в сосуды с землей путем пролива из расчета 100 г водной суспензии на 1 кг почвы. Через 3-е суток вносили инфекцию (10-14 суточную культуру гриба Fusarium oxysporum f. lycopersici) из расчета 10⁶ конидий на 1 кг почвы. Через 72 часа высаживали рассаду томата (сорт Талалихин) в фазе 3-х настоящих листьев.

Пример 5. Внесение заявленной композиции (пп.2) в почву существенно снизило пораженность томата фузариозным увяданием, особенно в начальные стадии роста растений (табл.3). На 10-е сутки в этом варианте опыта число пораженных растений снизилось в 5 раз по сравнению с контролем и в 2 раза по сравнению с прототипом. Биологическая эффективность состава (пп.2) на 30-е сутки опыта превысила прототип (пп.5) на 17,0%.

Пример 6. Композиция состава пп.4 по эффективности защитного действия сопоставима с композицией состава пп.2. Биологическая эффективность ее составляет 45,4%, что на 16,3% выше прототипа (пп.5).

Пример 7. Наиболее оптимальным оказался состав заявленной композиции в пп.3 таблицы 3. В этом варианте опыта заявленная композиция в 10 раз снизила распространение болезни по сравнению с контролем и в 5 раз по сравнению с прототипом. Высокая эффективность заявленной композиции сохраняется в течение всего опыта и на 30 сутки превышает прототип на 28,8%. Заявленная композиция (пп.3, табл.3) обладает не только высоким защитным эффектом, но и ростстимулирующей активностью, что подтверждается биометрическими данными в вариантах опыта без инфекции (табл.4).

Пример 8 подтверждает биологическую эффективность заявленной композиции в защите растений огурца от фузариозной инфекции. Исследуемая композиция (г):

Хитозан, М 100-150 кДа0,3Хитозан, М 10-15 кДа0,07Хитин0,25Янтарная кислота0,07Глутаминовая кислота0,3Гетероауксин0,01Водадо 100Trichoderma lignorum T-3610⁶ КОЕ/мл

Культуру Trichoderma lignorum T-36 смешивали с компонентами композиции в соотношении 1:1 и полученную водную суспензию вносили в сосуды с землей путем пролива из расчета 50 г водной суспензии на сосуд (500 г почвы). Через трое суток вносили 10-14 суточную культуру гриба Fusarium oxysporum из расчета 10⁶ конидий на 1 кг почвы и высаживали рассаду растений огурца (с.Феникс) в фазе 1-го настоящего листа по 5 растений на сосуд (повторность 10-кратная). В качестве прототипа использовали ту же композицию, что и в предыдущих экспериментах.

Анализ полученных данных показал, что на начальных стадиях роста растений огурца (до 20 суток) внесение композиции в 2,2 раза снижает развитие и распространенность фузариозной инфекции по сравнению с контролем. По эффективности сдерживания развития болезни композиция превышает прототип (пп.3) в 1,9 раза (табл.5). Исследуемая композиция не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие растений огурца (табл.5).

Пример 9 демонстрирует бактерицидную активность заявленной композиции при изучении ее влияния на рост, развитие и пораженность растений томата возбудителем некроза сердцевины стебля (Pseudomonas corrugata), (вегетационный опыт, табл.6).

Предпосевную обработку семян томата проводили путем замачивания в течение 1 часа в водной суспензии заявленной композиции состава (г):

Хитозан, М 100-150 кДа0,3Хитозан, М 10-15 кДа0,07Хитин0,25Янтарная кислота0,07Глутаминовая кислота0,3Гетероауксин0,01Водадо 100Bacillus subtilis M-2210⁸ КОЕ/мл)

Культуру Bacillus subtilis M-22 смешивают с композицией в соотношении 1:1. Контрольные растения замачивали в воде.

Искусственное заражение 20-дневных растений томата проводили методом инъекции водной суспензии бактерии (Р. corrugata) с титром 10⁶ кл/мл. Опыт проводили в 6-кратной повторности; в каждой повторности было по 5 растений.

Предпосевная обработка семян заявленной композицией на 28,3% увеличила вес надземной части растений томата и в 1,7 раз повысила сырую массу корней по сравнению с контролем. Следует отметить, что увеличение массы корней у растений в этого варианта опыта связано с образованием боковых корней. Заявленная композиция положительно влияет на рост, развитие растений, стимулирует корнеобразование, повышает болезнеустойчивость, снижая в три раза распространение некроза сердцевины стебля томата по сравнению с контролем (пп.1). Экспериментально показано, что заявленная композиция на 15% эффективнее сдерживает распространение болезни, чем прототип (пп.3).

Пример 10. Сравнительную оценку биологической эффективности заявленной композиции проводили в условиях мелкоделяночного опыта в производственной теплице САОЗТ «Лето» (Санкт-Петербург) на посадках томата общей площадью 1000 м² (табл.7). Два варианта заявленной композиции вносили дважды в течение вегетации методом пролива почвы под растение томата: после высадки рассады на постоянное место произрастания и через месяц. Контролем служили растения, возделываемые по принятой в хозяйстве технологии. Композиции следующего состава (г):

Хитозан, М 100-150 кДа0,3Хитозан, М 10-15 кДа0,07Хитин0,25Янтарная кислота0,07Глутаминовая кислота0,3Гетероауксин0,01Водадо 100Bacillus subtilis M-2210⁸ КОЕ/млили Trichoderma lignorum Т-3610⁶ КОЕ/мл

Культуру бактерии Bacillus subtiliss штамм М-22 или гриба Trichoderma lignorum штамм Т-36 смешивали с компонентами композиции в соотношении 1:1 и вносили в почву по 100 г под растение.

В течение вегетации наблюдали за развитием бактериального увядания (Clavibacter michiganense subsp. michiganensis) растений томата и распространением серой гнили. Заявленные композиции существенно снижают число пораженных бактериозом растений. Особенно эффективна композиция, включающая в состав в качестве микроба-антагониста гриб Trichoderma lignorum Т-36, снижающая число пораженных бактериозом растений томата в 3 раза. Аэрогенная инфекция (серая гниль) является одним из наиболее опасных фитопатогенов, приносящих существенный вред посадкам овощных культур в защищенном грунте. Композиция оказала положительное влияние на повышение болезнеустойчивости растений томата, что проявилось в значительном снижении распространения и степени развития серой гнили (возбудитель Botrytis cinered).

Биологическая эффективность композиций составила 62,1-55,7% и превысила эффективность действия прототипа на 18,5-12,1% соответственно (фитопатологический учет 25.09).

Приведенные примеры свидетельствуют о высоком защитном и ростостимулирующем действии заявленных композиций при их экологической безопасности. Высокая биологическая активность в сочетании со стимулирующим действием на рост растений обеспечит эффективную защиту сельскохозяйственных культур от грибной и бактериальной инфекции.

Литература

1. Патент США № 4812159, заявл. 13.03.87, опубликован 14.03.89.

2. Патент РФ № 2158510, заявл. 15.05.97.

3. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, Москва, Госхимкомиссия РФ Минсельхоза России, стр.243-246, 2002 г.

4. Bell, A.A., Hubbard, J.C., Liu, L., Davis, R.M. and Sabbarao, K.V. Effects of Chitin and Chitosan on the Incidens and Severity of Fusarium Yellows of Celery // Plant Disease, v.82, #3, p.322-238.

5. Титова Ю.А., Новикова И.И., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В. Триходермин на основе вторичной биоконверсии отходов и его эффективность против болезней огурца // Микология и фитопатология, 2002, Т.36, Вып.4, С.76-80.

6. Новикова И.И., Бойкова И.В. Новые биопрепараты для сельского хозяйства // Биотехнология - народному хозяйству, 2000, М., 2000, С.47-48.

7. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур, М., 1985.

Таблица 2
Влияние предпосевной обработки семян на пораженность растений огурца фузариозной инфекцией (вегетационный опыт, искусственный инфекционный фон, возбудитель Fusarium oxysporum)№ ппВариантРаспространенность болезни, %Биологическая эффективность, %20 сутки30 сутки30 сутки6Контроль: искусственное заражение грибом F.oxysporum21,435,7-7Композиция10,515,855,78ТМТД10,030,115,79Прототип12,530,614,3 HCP_.013,92,52,1

Таблица 4
Влияние композиции на рост и развитие растений томата (вегетационный опыт)№ примераВариант опыта10-е суткиВысота растения, смЧисло листьев, шт. Контроль - вода7,75,75Контроль - искусственное заражение грибом F. oxysporum4,53,36Композиция+искусственное заражение грибом F. oxysporum5,13,97Композиция без искусственного заражения грибом F. oxysporum11,86,2 HCP_.010,80,5

Таблица 5
Влияние композиции на распространение и развитие фузариозной инфекции растений огурца (вегетационный опыт, инфекционный фон, возбудитель Fusarium oxysporum)№ ппВариантРаспространение болезни, %Развитие болезни, %Биологическая эффективность, %10 сутки20 сутки30 сутки20 сутки30 сутки1Контроль+искусственное заражение грибом F. oxysporum25,045,365,020,542,5-2Композиция5,020,027,29,416,760,73Прототип10,040,045,419,629,631,8 НСР_.01  9,1 8,8 

Таблица 6
Влияние заявленной композиции на рост, развитие и пораженность растений томата возбудителем некроза сердцевины стебля (Р. corrugata), (вегетационный опыт, 120-е сутки опыта)№ ппВариант опытаВес надземной части 1-го растенияВес корня 1-го растенияРаспространенность болезни, %г% к контролю1Контроль19,81001,176,22Заявленная композиция25,4128,31,825,03Прототип22,0111,11,540,0

Таблица 7
Влияние композиции на пораженность растений томата бактериозом и серой гнилью (САОЗТ «Лето»)№ ппВариантПоражено растений, %Погибло растений, %Биологическая эффективность по погибшим растениям, %Бактериоз (Clavibacter michiganensis)Серая гниль (Botrytis cinered)Дата учета13.0925,0911,1025,1025,0911,1025,091Контроль14,230,986,789,94,242,5-2Прототип18,815,560,462,71,035,843,63Композиция с B.subtilis М-22 (10⁸ КОЕ/мл)8,911,740,152,3017,362,14Композиция с T.lignorum Т-36(10⁶ КОЕ/мл)4,813,759,263,10,827,255,7

Изобретение относится к биотехнологии. Композиция содержит хитозан, хитин, янтарную, глутаминовую кислоты, гетероауксин и штамм Bacillus subtilis M-22 или штамм Trichoderma lignorum T-36. Композиция обладает антагонистической активностью в сочетании со стимулирующим действием на рост растений и обеспечивает эффективную защиту овощных культур от грибных и бактериальных болезней. 6 табл.

Композиция для защиты овощных культур от грибных и бактериальных болезней, включающая хитозан, янтарную кислоту, глутаминовую кислоту, гетероауксин, воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит хитин и штамм Bacillus subtilis M-22 или штамм Trichoderma lignorum T-36 при следующем содержании компонентов, г:

Хитозан, М 100-150 кДа0,03-3,0Хитозан, М 10-15 кДа0,007-0,7Хитин0,025-2,5Янтарная кислота0,007-0,7Глутаминовая кислота0,03-3,0Гетероауксин0,001-0,1ВодаДо 100,

причем штамм Bacillus subtilis M-22 с титром 10⁶-10¹⁰ КОЕ/мл или Trichoderma lignorum T-36 с титром 10⁵-10⁸ КОЕ/мл смешан с водной суспензией компонентов в соотношении 1:1.