Штамм бактерий Bacillus pumilus RCAM05516 для защиты растений от фитопатогенных грибов Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. и стимуляции роста растений Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и сельскохозяйственной биотехнологии, в частности касается нового природного штамма бактерий вида Bacillus pumilus в качестве действующего компонента для разработки биопрепарата, направленного на стимуляцию роста и защиту растений от грибных инфекций.

Актуальным трендом в современном сельском хозяйстве является применение микробных биопрепаратов для стимуляции роста и защиты растений от инфекций. Их нарастающая популярность обусловлена большей экологичностью и безопасностью для окружающей среды по сравнению с химическими пестицидами и удобрениями [1, 2, 3]. В качестве активных компонентов микробных биопрепаратов выступают бактерии рода Pseudomonas, грибы рода Trichoderma и пр [4, 5]. Однако наибольшую популярность получили бактерии p. Bacillus за счет своей неприхотливости при культивировании, способности к спорообразованию и высокой биологической активности. На отечественном рынке известны биопрепараты, содержащие в своем составе бацилл («Фитоспорин-М», «Бактофит», «Гамаир» и др.) [6], но пул биологических препаратов и используемых штаммов необходимо постоянно расширять для своевременной реакции на возникающую резистентность фитопатогенов и утрату полезных свойств у используемых микробных культур.

Известен штамм Bacillus licheniformis Б-5, обладающий антагонистическим эффектом по отношению к грибным фитопатогенам подсолнечника и увеличивающий всхожесть семян [7].

Однако для данного штамма не установлена способность к стимуляции роста корней растений и фунгицидная активность по отношению к плесеням хранения (Aspergillus, Penicillium и пр.).

Запатентован штамм Bacillus cereus ВКПМ В-12401, обладающий способностью стимулировать рост меристемной культуры Solarium tuberosum [8].

Недостатком штамма является то, что для него не установлен спектр антагонистического действия по отношению к фитопатогенным грибам.

Известен штамм Bacillus subtilis - И5-12/23 (93 ВИЗР), предназначенный для защиты картофеля от болезней при хранении [9].

Однако для данного штамма не установлена антагонистическая активность по отношению к грибам p. Penicillium, также поражающим картофель при хранении.

Известен штамм Bacillus subtilis subsp.subtilis 12501 HK, характеризующийся фунгицидным действием против фитопатогенных микромицетов, а также ростостимулирующими свойствами [10].

Однако для данного штамма бацилл не установлен фунгицидный эффект по отношению к плесеням хранения.

В качестве прототипа был выбран штамм Bacillus subtilis В-10 ВИЗР [11]. Данная бактерия входит в состав фунгицида «Алирин-Б», а также относится к группе Bacillus subtilis, как и заявленный штамм Bacillus pumilus RCAM05516.

Задачей изобретения является получение нового штамма Bacillus pumilus, характеризующегося антагонистическим эффектом против фитопатогенных грибов Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.и фитостимулирующими свойствами.

Задача решается путем выделения нового штамма Bacillus pumilus RCAM05516 из ризосферы рода Berteroa и определением фунгицидных и фитостимулирующих свойств штамма.

Технический эффект, получаемый от применения нового штамма, заключается в повышении продуктивности культурных растений за счет стимуляции их роста и повышения их устойчивости к болезням, вызываемым фитопатогенными грибами. Описание изобретения

1. Выделение нового штамма

Предлагаемый штамм Bacillus pumilus RCAM05516 был выделен из ризосферы p.Berteroa в Алтайском крае, Алтайском районе, в окрестностях села Ая, осенью 2018 года. Весной 2022 года штамм был депонирован в «Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM)» ФГБНУ «ВНИИСХМ», находящейся по адресу: 196608 Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3. Регистрационный номер - RCAM05516.

2. Видовая идентификация предлагаемого штамма

Идентификацию предлагаемого штамма до вида проводили с использованием метода мультисубстратного тестирования MicroPlate GENIII (BioLog). В соответствии с полученными результатами анализа, вероятность того, что данный штамм принадлежит виду Bacillus pumilus составила 77,5%, а к Bacillus safensis - 17,5%. Следовательно, штамм RCAM05516 относится к виду Bacillus pumilus (фиг. 1).

3. Культуральные, морфологические, физиологические и биохимические свойства нового штамма

Культуральные и морфологические признаки штамма Bacillus pumilus RCAM05516: колонии бело-кремового цвета, диаметром до 0,3-0,6 см, матовые, приподнятые, ровной округлой формы, со складчатой каймой. Цвет колоний на окраине белее по сравнению с центром. В колбе в условиях аэрации растет с образованием мути по всему объему, в термостате - с образованием пленки на поверхности бульона. При микроскопии палочки располагаются преимущественно одиночно или парами.

Физиологические и биохимические свойства штамма Bacillus pumilus RCAM05516: спорообразующие палочки, положительно окрашивающиеся по Граму. Утилизируют сахарозу, арабинозу, маннит и ксилозу. Реакция на каталазу - положительная, на лецитиназу - отрицательная. Не восстанавливают нитрат, не ферментируют цитрат, реакция Фогеса-Проскауэра - отрицательная.

4. Условия культивирования заявленного штамма и питательные среды

На жидких питательных средах штамм растет в шейкер-инкубаторе при 200-250 об/мин, а на твердых - в термостате. Время и температура культивирования - до 24 ч при 37°С. Оптимальная питательная среда - L. Состав (г/л): дрожжевой экстракт и хлорид натрия -по 5, пептон и агар - по 15.

В биологических реакторах штамм Bacillus pumilus RCAM05516 культивируется на мелассно-кукурузной среде, следующего состава (г/л): меласса - 25, кукурузный экстракт - 12,5, дрожжевой экстракт - 1, пептон - 0,5, MgSO₄ - 0,25, MnSO₄ - 0,03, CoCl₂ - 0,046, CaCl₂ - 1, FeSO₄ - 0,05, CuSO₄ - 0,05. В качестве пеногасителя используется лапрол (мл/л) - 2.

Условия культивирования: водородный показатель (рН) - 6,8-7,4, количество оборотов двухуровневой мешалки в минуту - 250-500, время ведения ферментации - 24 ч, оптимальная температура роста культуры - 37°С, расход воздуха - до 500 л/ч, начало спорообразования - через 5-7 часов, с момента внесения культуры в аппарат, к 24 часам инкубирования культура полностью переходит в споры.

Для роста штамма характерно отсутствие лаг-фазы, потребление кислорода из среды, а также смещение водородного показателя сразу после внесения инокулята в ферментационную среду.

5. Фунгицидное действие предлагаемого штамма

Антагонистический эффект нового штамма Bacillus pumilus RCAM05516 был установлен по отношению к следующим фитопатогенным грибам: Phytophthora infestans, Altemaria sp, Aspergillus sp., Penicillium sp.

6. Стимуляция роста растений заявленным штаммом

Новый штамм стимулирует рост корней Клоповника посевного.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение фунгицидного действия штамма Bacillus pumilus RCAM05516 по отношению к фитопатогенам

Антагонистическую активность штаммов Bacillus pumilus RCAM05516 и Bacillus subtilis В-10 ВИЗР против фитопатогенных грибов определяли методом агаровых блоков. Используемые тест-культуры: Phytophthora infestans, Altemaria sp, Aspergillus sp., Penicillium sp.

Бацилл поверхностным газоном засевали в опытные чашки с питательным агаром (эксперимент с Phytophthora infestans) или средой YEP (для остальных микромицетов). В центр чашки Петри помещали блок с заранее выращенными грибами диаметром 7 мм, полученный с помощью стерильного сверла. В качестве контроля выступали чашки с блоками фитопатогенов без бацилл. Микроорганизмы инкубировали при 20-25°С в течение 10 дней, периодически оценивая взаимодействие микроорганизмов. О присутствии фунгицидного действия свидетельствует более слабое развитие мицелия микромицетов в опытных чашках по сравнению с контрольными. Степень ингибирования (СИ) выражали через формулу:

где Dк - диаметр колонии гриба в контроле,

Do - диаметр колонии гриба в опыте.

Согласно результатам, представленным в таблице 1, оба исследуемых штамма ингибируют рост исследуемых фитопатогенов. На протяжении всего эксперимента микромицеты в контрольных пробах разрастались по периметру всей чашки Петри, а в опытных иногда даже погибали на внесенном блоке (как в случае с Phytophthora infestans).

Если в контрольных вариантах через 10 дней инкубирования диаметр фитопатогенов составлял 79,00±6,51 мм для Phytophthora infestans, 73,00±3,58 мм для Alternaria sp., 73,33±1,53 мм для Aspergillus sp. и 67,00±4,76 мм для Penicillium sp., то в опытных чашках с предлагаемым штаммом грибы занимали 0 мм в случае с Phytophthora infestans и по 7 мм для остальных микромицетов. В чашках со штаммом-прототипом диаметр фитопатогенов составлял 0 мм для Phytophthora infestans, 12,00±1,00 мм для Alternaria sp., 9,50±1,97 мм для Aspergillus sp.и 12,33±1,75 мм для Penicillium sp.Заявленный штамм Bacillus pumilus RCAM05516 эффективнее ингибирует рост Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., чем Bacillus subtilis B-10 ВИЗР, на 6,85%, 3,4% и 7,96% соответственно. Пример 2. Установление стимуляции роста растений у штамма Bacillus pumilus RCAM05516

Ростостимулирующий эффект штаммов Bacillus pumilus RCAM05516 и Bacillus subtilis В-10 ВИЗР на семена Клоповника посевного устанавливали методом влажных камер. Для этого семена из опытных проб протравливали культуральными жидкостями суточных культур бактерий рода Bacillus. Расход - 100 мкл культуральной жидкости на 10 г семян. Контрольные семена не протравливались ничем. Опыт закладывали в 4-х кратной повторности, в одну чашку Петри выкладывали по 20 семян. Результаты эксперимента учитывали на 5-е сутки.

В соответствии с данными в таблице 2, оба исследуемых штамма стимулируют рост корней у семян Клоповника посевного. Однако предлагаемый штамм Bacillus pumilus RCAM05516 дает прибавку в длине корня к контролю на 2,5% больше, чем прототип Bacillus subtilis В-10 ВИЗР.

И в опытных, и в контрольном вариантах всхожесть семян была выше 90%. Ни в одной из экспериментальных чашек Петри не было зафиксировано больных семян, поэтому в данном опыте не было возможности оценить фунгицидное действие изучаемых штаммов на возбудителей грибных инфекций Клоповника посевного. Литература

1. Shternshis М. Biopreparations for plant protection in Siberia: application and enhancement of activity // Journal of Agricultural Biotechnology, 2005. - Vol. 1. - Is. 1. - P. 1-18.

2. Pogacean M.О., Gavrilescu М. Plant protection products and their sustainable and environmentally friendly use // Environmental Engineering and Management Journal, 2009. - Vol. 8. - Is. 3. - P. 607-627. doi: 10.30638/eemj.2009.084

3. Nugmanova T. Biopreparations for the production of environmentally safe food - part I // Ecological Engineering and Envirnment Protection, 2017. - Vol. 2. - P. 63-69. doi: 10.32006/eeep.2017.2.6369

4. Смирнова И.П., Каримова Е.В., Шнейдер Ю.А. Некоторые перспективы использования метаболитов рода Trichoderma // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Агрономия и животноводство, 2016. - №3. - С. 22-29.

5. Gaete A., Andreani-Gerard С, Maldonado J. Е., Munoz-Torres Р.А., Sepulveda-Chavera G. F., Gonzalez M. Bioprospecting of Plant Growth-Promoting Traits of Pseudomonas sp. Strain C3 Isolated from the Atacama Desert: Molecular and Culture-Based Analysis // Diversity, 2022. - Vol. 14. - Ar. 388. doi: 10.3390/dl4050388

6. «Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов», разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Часть I Пестициды. - М.; Минсельхоз России, 2022. - 887 с.

7. Маслиенко Л.В., Лавриченко О.А. Пат. 2032345, МПК 51 С 12 N 1/20. Штамм бактерий Bacillus licheniformis для получения препарата против белой гнили подсолнечника, 1995.

8. Ренев Н.О., Субботин А.М., Петров С.А., Мальчевский В.А. Пат. 2724538, МПК 51 С 12 N 1/20. Средство для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum, 2020.

9. Новикова И.И., Бойкова И.В., Павлюшин В.А., Зейрук В.Н. Пат. 2538157, МПК 51 С 12 N 1/20. Штамм бактерий Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при хранении, 2015.

10. Каменева И.А., Мельничук Т.Н., Алексеенко Н.В., Якубовская А.И., Паштецкий В.С., Абдурашитов С.Ф., Гритчин М.В., Смирнова И.И. Пат. 2764695, МПК 51 С 12 N 1/20. Штамм бактерий Bacillus subtilis subsp. subtilis - антагонист фитопатогенных микромицетов с ростостимулирующими свойствами и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и защиты их от грибных болезней, 2022.

11. Корнева О.Г., Полякова Е.В., Киселева Г.Н., Соколов А.С. Эффективность применения биопрепаратов для защиты картофеля от болезней в условиях дельты волги // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета, 2019. - №2. - С. 69-72.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Bacillus pumilus, обладающий антагонистическим действием против фитопатогенных грибов Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., задепонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) под регистрационным номером RCAM05516. Штамм бактерий Bacillus pumilus RCAM05516 может быть использован для разработки микробных биопрепаратов с целью защиты растений от грибных инфекций и фитостимулирования. 1 ил., 2 табл.

Штамм бактерий Bacillus pumilus RCAM05516, выделенный из ризосферы рода Berteroa, характеризующийся фунгицидным действием по отношению к фитопатогенным грибам Phytophthora infestans, Alternaria sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. и способностью к стимуляции роста растений.