ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГРИБНЫХ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к защите растений от поражения фитопатогенными грибами.

Известен ряд штаммов бактерий рода Bacillus, являющихся антигонистами различных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Штамм Bacillus subtilis B-116 оказывает антогониотическое действие на грибы Pythium и Rhysoctonia. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N128 используется для получения препарата против грибковых заболеваний хлопчатника [1]
Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных грибковых возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является штамм бактерий Bac.subtilis ВНИИСХМ N131, используемый для получения препарата против возбудителей гнилей яблок и винограда при хранении[2]
Однако данный штамм также оказывает ограниченное действие, направленное на отдельных грибных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.

Задачей настоящего изобретения является создание такого штамма бактерий Bac. subtilis, который обладал бы более широким спектром антагонистической активности на возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, в частности, против грибковых болезней картофеля, огурцов, клевера, а также цветов.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Bacillus subtilis IC-5, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7036 от 30.05.95 г.

Штамм выделен из почвы в образцовом хозяйстве Новосибирской области в 1993 году, идентифицирован по "Определителю микроорганизмов Берги".

Штамм подвергался селекции на подавление бактериального роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: Phytophthore infestans, Microsporium solani, Fusarium solani (возбудитель сухой гнили).

Культурально-морфологические признаки Bacillus subtilis ВКПМ В-7036. Культура спороносная, аэробная, граммположительная.

В мазках из колоний, выросших на МПА через 17 ч. обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером (0,7-0,85)-(2,5-2,7) мкм. Расположены клетки одиночно или образуют цепочки, преимущественно короткие. Хорошо образуют эндоспоры на картофельном агаре. Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Околоспоральных включений не обнаружено.

Через 48 ч. роста при +37^oC на суслоагаре культура имеет непрозрачные матовые колонии с фестончатым краем. Хорошо снимается петлей с поверхности агара.

Минимальная температура роста Bac. subtilis ВКПМ В-7036 колеблется в пределах +5-20^o)C; максимальная от +45^oC до +55^oC; оптимальная от +28^oC до +37^oC.

PH среды: минимальные 4; максимальные 8; оптимальные 6-7.

Штамм размножается при 37^oC на средах МПБ и МПА.

Для длительного хранения штамм консервируется в лиофилизованном виде.

Маркерный признак штамма: устойчив к антибиотику канамицину.

Физиолого-биохимические свойства.

Ферментирует глюкозу, арабинозу, маннит, ксилозу с образованием кислоты без газа. Гидролизует крахмал, желатину, растет при 7% NaCl, утилизирует цитрат, пропионат не использует.

Культура не растет в анаэробных условиях и при 10% NaCl, не образует газ из NO в анаэробных условиях.

Данные о непатогенности штамма Bac.subtilis ВКПМ В-7036 представлены в таблице.

Анализ таблицы показывает, что предлагаемый штамм является безвредным для животных.

Антагонистическая активность штамма представлена следующими примерами.

Пример 1. Препарат ФИТОП на основе штамма Bac.subtilis ВКПМ В-7036 приготавливают следующим образом.

В начале приготавливают смесь сахара с крахмалом в соотношении 1:1. Далее к 5 частям полученной смеси наполнителя добавляют 1 часть биомассы спор бактерий и перемешивают. В полученную смесь добавляют физиологический раствор, объем которого равен объему биомассы бактерий, и интенсивно перемешивают. При этом происходит иммобилизация спор бактерий на частицах крахмала. Далее в полученную смесь вводят сахар при соотношении биомассы спор бактерий и сахара не более 1:50. В результате получают готовый концентрированный препарат при следующем соотношении компонентов (масс%):
споры бактерий Bac. subtilis
ВКПМ В-7036 с титром 7•10¹⁰ спор/г 0,1-1,0
крахмал 0,2-3,0
сахар остальное
Остаточная влажность препарата составляет не более 2-5%
Пример 2. Испытание препарата ФИТОП на основе штамма Bac.subtilis ВКПМ В-7036 в споровой форме. Испытуемое растение роза сорта Мерсед, пораженное мучнистой росой. Пораженные листы роз опрыскивали р-ром препарата в концентрации (1-3) г/л.

При концентрации предлагаемого препарата 3 г/л развитие и распространение гриба на листьях прекратилось, поверхностный мицелий полностью уничтожен, на пораженных листах остались побуревшие пятна. Лечащий эффект, при использовании такой концентрации препарата ФИТОП, превышает контрольный вариант, где использовался коммерческий препарат БЕНЛАТ. При концентрации ФИТОПа 1 г/л мицелий угнетен, кроме того отмечено замедленное распространение инфекций; эффективность действия в этом случае равна эффективности контрольной обработки препаратом БЕНЛАТ. Через месяц, после обработки, наблюдалось слабое распространение мучистой росы.

Пример 3. Взяты клубни картофеля из хранилища. Сделана оценка на пораженность грибными болезнями. Выявлена Phytophthora infestans, Microsporium solani, Fusarium solani.

Немытые клубни обработали ФИТОПом в концентрации 5г/л и поместили во влажную (100% ) камеру с температурой 22-25^oC. Через неделю получен результат: налета грибницы нет, есть точечное прорастание мицелия (4 точки диаметром 1 мм на клубне). При микроскопировании выявлены: Penicillinium, Fusarium.

Спороношение Phytophthora infestans не отмечено. В контроле клубни полностью покрыты мицелиями грибов.

Через неделю провели повторное наблюдение. Контрольные клубни сгнили, опытные дали ростки. Развитие и распространение повреждений не отмечаются.

Заключение: Препарат ФИТОП оказывает защитной действие против наиболее опасных и распространенных заболеваний картофеля в период хранения.

Пример 4. Розы в оранжерее ЦСБС СО РАН г.Новосибирска, пораженные мучнистой росой (Sphaerotheca pannosa Lev.) во 2-й степени по 3-х бальной системе обработаны раствором ФИТОПа: 30 г на 10 л водопроводной воды. Опрыскивание мелкодисперсное из опрыскивателя "Квазар".

Контроль не обработанные розы с той же оценкой пораженности.

Через неделю проверили результаты эксперимента. В опытном варианте пятна налета мицелия гриба локализованы. Мицелий приобрел серый оттенок, образование плодовых тел не наблюдается. Распространения заболевания нет. В контрольном варианте развитие и распространение гриба продолжается.

Дальнейшее наблюдения за опытом показали, что в опытном варианте в течение месяца после обработки раствором ФИТОПа гриб испытывал угнетение, растения роз развивались нормально.

Пример 5. Провели опыт на розах в оранжерее ЦСБС СО РАН.

Сорта роз Тамара и Коктейль с оценкой поражения мучнистой росой 2 балла по 3-х бальной шкале обработали раствором препарата 30 г на 10 л воды. Обработку сделали из опрыскивателя "Квазар".

Далее провели проверку эффективности обработки. Результат: развитие и распространение гриба на обработанных растениях прекратилось, мицелий гриба угнетен.

Дальнейшие наблюдения в течение месяца, показали, что на обработанных растениях гриб-возбудитель мучнистой росы развивается очень слабо и практически не имеет распространения. Растения (розы) развивались нормально.

Пример 6. На участке ЦСБС СО РАН проведена 3-х кратная обработка клевера, зараженного Peronospora sp. препаратом ФИТОП в дозе 30 г на 10 л воды. Опыт заложен с контрольным (клевер не обработан) вариантом. По окончании эксперимента вегетативная масса клевера с обоих участков скашивалась. После взвешивания установлено, что на опытном участке зеленой массы клевера на опытном участке на 50% больше, чем на контрольном. На опытном участке поражение листьев заболеванием оценивается в 30% тогда как в контрольном варианте отмечено 80% пораженных листьев.

Пример 7. Проведен опыт по обработке препаратом ФИТОП огурцов сорта "Тополек", зараженного ложной мучнистой росой (Pseudoperonospora cubensis Rostovs). После 3-х кратной обработки пораженность огурцов на опытном участке составляет 10% а на контрольном 40%
Пример 8. В весенний период посадки картофеля проделан ряд экспериментов по обработке посадочного материала препаратом ФИТОП. Брали из хранилища картофель, обмывали и погружали в раствор препарата ФИТОП в концентрации 30 г на 8 л воды. Картофель выдерживают и помещают в секции: 1 и 2 секции обработаны препаратом (опытные), а 3 и 4 секции не обработаны препаратом. Уход за растениями (прополка, окучивание) во всех секциях осуществлялся одновременно. В середине августа надземные части растений секций 1 и 4 были обработаны (методом опрыскивания) раствором препарата ФИТОП в концентрации 30 г на 8 л воды. Перед копкой картофеля в начале сентября обнаружено, что в 1-й и во 2-ой секциях картофельная ботва зеленая, а в 3- и 4-ой секциях на 70% поражена фитофторозом. Урожай картофеля в 1-й и во 2-й секциях был больше, чем в 3-й и 4-й секциях в 1,21 и 1,36 раза соответственно. Наличие поврежденных фитофторой клубней картофеля в опытных секциях не обнаружено. В контрольных 3-й и 4-й секциях процент поражения клубней картофеля фитофторой составил 10% на момент его уборки.

Таким образом, из примеров 1-8 по проверке предлагаемого штамма на антагонистическую активность видно, что он эффективно действует против грибковых заболеваний картофеля, клевера и других кормовых трав, роз разных сортов и огурцов.

Промышленная применимость. Предлагаемое изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве и пищевой промышленности при хранении овощей.

Использование, биотехнология, производство средств защиты растений от поражения фитопатогенными грибами. Сущность изобретения: Штамм бактерий Bacillus subtilis 1С-5 выделен из почвы, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-7036. Препарат получают путем смешивания спор бактерия штамма с наполнителем, в качестве которого используют смесь сахара с крахмалом в соотношении 1:1. 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7036 для получения препарата против грибных болезней растений.