Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к защите растений хлопчатника от поражения фито патогенными грибами.i
В качестве наиболее распространён-: ного метода предупреждения грибных болезней хлопчатника используется протравливание семян химическими препаратами (формалином, бропокотом, бропЬко- том с ксантаном, бропокотом с ГМТД). Известен способ предпосевной обработки семян хлопчатника синтетическим препаратом с целью повышения семян.
Однако химические способы имеют ряд существенных недостатков: высокая токсичность для человека и животных, накапливание в почве и растениях остаточных количеств ядовитых веществ, сложная технология протравливания, неэффективность против загнивания семян, гнили проростков и корневой гнили всходов; высокая сто- имостьидр.;
Известны биологические способы борьбы с различными болезнями растений, в том числе вызываемыми грибами. Способ борьбы с черной ножкой, корневой гнилью, шей- ковой гнилью основан на использовании препарата из Irichoderma ha rzlanum T - 315 (АТСС № 20671).;
Однако они не эффективны для защиты растений хлопчатника от таких болезней, как вертициллеэный вилт, фузариозное увядание и др.
Наиболее близким к изобретению является способ применения Bacillus polymyxa 9А для защиты растений от вертициллезноXI xl
сл о
го увядания. В. polymyxa 9A, выделенная из корней растений картофеля, росших на участках, сильно зараженных Vertlclllium dahllae. обладает способностью подавлять развитие вертициллезного увядания на таких культурах, как картофель и хлопчатник. В. polymyxa может быть использована в форме водных и неводных препаратов. Водные препараты содержат 105 - 109 кл/мл, а пасты Ю9 кл/мл. Неводные препараты включают дусты, смачивающие порошки, гранулы, эмульгоконцентраты. Рабочие составы могут применяться в виде растворов, гранул, дуста. Чаще всего составы используют для непосредственной обработки семен и семенного материала, хотя не исключается возможность обработки почЪы вокруг посадочного материала.
Однако данный способ не включает предупреждение таких болезней хлопчатника, как черная корневая гниль и фузариозное увядание.
. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего более широким спектром действия к возбудителям заболеваний хлопчатника.
Поставленная цель достигается использованием для предпосевного увлажнения семян хлопчатника суспензии полученной новой живой культуры Bacillus subtilis 26D с содержанием 5 108 - 1«109 кл/мл, применяемой в количестве 0,5-0,7 л на 1 кг семян при экспозиции 12-18 ч.
Штамм В.subtilis 26D получен из внутренних тканей стебля здорового растения хлопчатника в лабораторных условиях. После предварительной обработки и стерилизации поверхности стебля стерильным скальпелем снимали кору, и небольшие кусочки стебля помещали на поверхность питательного агара (картофельного агара) в чашку Петри. Чашки инкубировали при 28°С в течение 5-7 сут.
Штамм идентифицирован по определителю Берги (1984), на основании работ Gordon (1973), депонирован в коллекции- Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под NS 128. Штамм В. subtilis 26D имеет следующие основные культурально-морфологические и биохимические признаки. Грамположитель- ные подвижные аэробные спорообразую- щие палочки с закругленными концами, продуцирующие каталазу. Образуют эндоспоры, не раздувающие клетку. Размер клеток - 1.9x0,5 мкм; в мазках 18 ч культуры клетки расположены одиночно, попарно, реже в цепочки. Споры в клетке расположены центрально, размер спор 0,9x0,5 мкм.
При культивировании штамма на МПА в течение 24 ч при образуются складчатые колонии вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии изрезаны, На среде
Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), рН 6,8-7,0 после 24 ч термостатирования при 37°С образует кремово-белые колонии, складчатые, с кратерообразным центром, консистенция вязкая, края колонии изрезанные. Культура
0 ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, галактозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа; не разлагает дульцйт, рамнозу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауера, гидро5 лизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат, не использует пропионат. Не растет в анаэробных условиях, не образует включения поли- / -оксимасляной кислоты на среде МПА с
0 глюкозой.; не образует индол и сероводород. Не обладает лецитиназой, коагулазой, гиалуронидазой, Патогенными свойствами (токсическими, токсигенными, вирулентными) при парентеральном и пероральном вве5 дении белым мышам не обладает.
Проверка безвредности осуществлялась следующим образом.
Лабораторным животным вводили фильтрат культуральной жидкости В.
0 subtilis 26D, выращенной в течение 10 сут на мясо-пептонном бульоне при 28°С; суспензии клеток В. subtilis 26D, выращенной на мясо-пептонном агаре при 28°С в течение 24 ч, суспензии инактивированных про5 греванием клеток В. subtilis 26D, выращенной в течение 24 ч на МПА при 28°С.
Проверку патогенности осуществляли на белых мышах весом 18-20 г. Животным
0 вводили суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в инъекциях.
В табл. f представлены результаты исследования токсичности фильтрата культуры В, subtilis 26D после роста на МПБ (токси5 генность культуры).
В табл. 2 приведены результаты введения животным МПБ (контроль).
В табл. 3 приведены результаты исследования вирулентности культуры В. subtilis
0 26D, выращенной на МПА при 28°С в течение 24 ч.
В табл. 4 приведены результаты исследования токсичности инактивированных клеток культуры В. subtilis 26D.
5 Наблюдения за животными проводили на протяжении 15 дней после окончания курса инъекций или перорального введения. В период наблюдения все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не
нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле была сходной. Все подопытные и контрольные животные после окончания срока наблюдения были умерщвлеяы, вскрыты, их органы подвергнуты макроскопическому изучению.
Результаты вскрытия показали следую- щее.
Сердце обычной формы и величины, у подопытных животных такое же, как и у контрольных. Легкие по объему, строению долей у опытных и контрольных животных одинаковые; поверхности легких гладкие, доли легко отделяются друг от друга, спа ек не отмечено. Желудок, петли тонкого и толстого кишечника внешне обычные, признаков воспалительных изменений не отмечено. При вскрытии просвета виден неизмененный (такой же. как и у контрольных животных) рисунок слизистых. Печень темно-красного цвета, среднего кровенаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие. Почки по размерам и форме, не отличаются у контрольных и опытных животных, поверхности гладкие, на разрезе виден четкий рисунок коркового и мозгового вещества. Селезенка не увеличена, обычной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета.
Введение суспензии живых, а также инактивированных клеток 24-часовой куль- туры В. subtilis 26D перорально в дозах 0,5- 1,0 млрд. микробных - клеток и внурибрюшинно в дозах 0,5-1,0 млрд. микробных клеток на мышь не вызвало у животных каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не. выявило у них признаков патологического процесса и изменений, регистрируемых макроскопически.
Введение мышам фильтрата среды рос- та (после культивирования штамма В. subtilis 26D на мясо-пептонном бульоне) не выявило у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних ор- ганов животных.
Таким образом, полученные данные дают основание отнести изученный штамм к 4-му классу по классификации, приведенной в Методических указаниях МЗ СССР, Главного санэпидуправления Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов и на их основе готовых форм препаратов..., т.е. к микроорганизмам,
практически не обладающим аллергенным и общетоксическим действием.
Культура В. subtilis 26D пересевается на среде Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), сусло-агаре, среде Гаузе № 2; рН 6,8-7,0. Растет при 10-50°С, температурный оптимум 37°С.
Хранится культура на среде Громыко, либо среде Гаузе М 2, либо картофельном агаре в течение 2-3 мес при комнатной температуре, а под слоем стерильного минерального масла на указанных выше средах -неменее 1-2лёт. В лиофильновысушенном состоянии культура хранится до 3 лет и более. Для этого штамм В. subtilis 26D выращивают на среде Громыко или среде Гаузе № 2, или сусло-агаре в течение 5-7 сут при 28 или 37°С. С агаризованной среды биомасса снимается физиологическим раствором. В качестве защитной среды используется сахарозо-желатиновый наполнитель. Температура замораживания не выше -25°С, режим высушивания от -25°С до 32°С в течение 32 ч.
После хранения под минеральным маслом или в лиофилизированном состоянии культура образует однотипные колонии: на МПА - складчатые, вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии изрезанные.
Антагонистические свойства. Антагонистическую активность В. subtilis 26D по отношению к фитопатогенным грибам определяли методом отсроченного антагонизма, а именно радиальных штрихов. Штамм-антагонист засевали в центре чашки Петри на среду Гаузе №2. инкубировали при 28°С в течение 72 ч, затем радиальными штрихами подсевали тест-культуры, суспензии которых готовили в физиологическом растворе с содержанием 0,5 млрд. спор в 1 мл. Учет результатов проводили по величине зоны задержки роста тест-штамма в миллиметрах.
В табл. 5 приведены данные по антагонистической активности В. subtilis 26D по отношению к некоторым фитопатогенным грибам.
Как видно из приведенных в табл. 5 данных, штамм В. subtilis 26D обладает выраженной антифунгальной активностью в отношении грибов - возбудителей корневых гнилей, фузариозного увядания, вертицил- лезного вилта.
Культуру В. subtilis 26D использовали для получения препарата.
Препарат на основе В. subtilis 26D представляет собой лиофилизированную взвесь культуры в физиологическом раство- ое NaCI с добавлением защитной среды, В
качестве защитной среды использовали 1% желатины и 1%сахарозы. Культуру В. subtilis 26D выращивали на среде сусло- агар (рН 6,8-7,0) в течение 7-10 сут при 28- 32°С. С агаризованной среды биомассу смывали физиологическим раствором Nad и готовили суспензию, содержащую 2-3-1011 клеток в 1 мл, Суспензию соединяли с наполнителем (сахарозо-желатиновой средой). Полученную взвесь разливали в емкости из нержавеющей стали по 300 мл и замораживали при -(25-30)°С в течение не менее 24 ч. Проводили лиофилизацию в камере в режиме от (-30) до 32°С в течение 32 ч. Высушенную биомассу помещали в полиэтиленовые пакеты и укупоривали горячим способом.
Для обработки семян хлопчатника бактериальную лиофилизированную культуру за 1-2 ч до начала обработки растворяли в небольшом количестве водопроводной воды с целью оживления бактериальных спор и клеток. Затем из маточного раствора готовили рабочую суспензию, доводя титр до 5, - 1,0«109 кл/мл. Для обработки 1 т семян необходимое приготовление 500-700 л рабочей суспензии. Обработку семян производили либо в имеющейся емкости, либо в специально приготовленной зацементированной яме. Обработку начинали за 12-18 ч до начала сева. В емкость засыпали до 1 т семян и поливали вручную из лейки. Необходимое количество рабочей суспензии использовали в 2-3 приема с интервалом в 4-6 ч, чтобы семена хорошо впитали раствор. Вслед за каждым увлажнением семян их
тщательно перелопачивали и накрывали брезентом. Последнее увлажнение проводили перед посевом. Если посев задерживался, семена подсушивали, рассыпав их слоем в 5-10 см, а непосредственно перед
внесением в грунт их увлажняли водой.
Результаты предпосевной обработки семян хлопчатника с целью предупреждения поражения растений грибными болезнями, повышения всхожести представлены
в табл. 6.
Влияние В. subtilis 26D на прорастание семян и пораженность корневыми гнилями. В табл. 7 приведены результаты предпосевной обработки семян хлопчатника с
целью предупреждения поражения растений корневыми гнилями, вертициллезным вилтом, повышения урожайности.
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности
предлагаемого способа для предпосевной обработки семян хлопчатника.
Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИ- ИСХМ 128 для получения препарата против возбудителей заб -еваний хлопчатника.
Т а б л и ц а 1
Использование: микробиологическая промышленность, получение средств защиты растений, в частности хлопчатника, от возбудителей заболеваний. Штамм выращивают на сусло-агаре при рН 6.8-7,0 в течение 7-10 сут .при 28-32°С, смывают выросшие колонии физиологическим раствором и готовят суспензию с тиром (2-3)v «10 кл./мл. В суспензию вносят криолро- тектор (сахарозожелатиновую среду) и лио- филизируют. Для обработки семян хлопчатника лифилизированную культуру разбавляют водой до содержания 5,0«10 - 1, кл./мя. Длявбработки 1 т семян хлопчатника используют 500-700 л рабочей суспензии. Препарат на основе штамма позволяет защитить хлопчатник от возбудителей кормовой гнили на 93-94%, вертициллезного вилта на 85.2-86%. 7 табл.. со С
35
Таблица 2
При. ме-чание.1. В качестве тест-культур использовали штаммы фитопатогенных грибов, изолированные из пораженных растений хлопчатника, выращенных в различных районах Таджикской ССР. Штамм Fusarium oxysporum 6365 получен из коллекции Института микробиологии и вирусологии АН УССР.
Та блица 6 Влияние В. subtills 26D на прорастание семян и пораженность корневыми гнилями
Таблица 3
Таблиц а 4
Таблица 5
Та б л и ц а 7
Влияние В. subtllls 26D на пораженность растений хлопчатника . корневыми гнилями, вертициллезным вилтом, повышение урожайности
| Патент США № 4663162 | |||
| кл | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
