СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОЯЗВЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1997 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине, конкретно, к гастроэнтерологии и может быть использовано для лечения больных с язвенной болезнью желудка, находящихся на интенсивной терапии.

Наиболее близким прототипом к предлагаемому способу является способ получения средства, обладающего противоязвенным действием является способ получения плантаглюцида, препарата, обладающего противоязвенным действием путем экстракции водой сухого листа подорожника в соотношении 1:10, кипячения в течение 20-25 мин, настаивания 3-4 ч, фильтрации экстракта, упаривания в пленочном аппарате до 1/10 первоначального объема при температуре 60-75^oС, осаждения полисахаридного комплекса трехкратным количеством этанола, отделения осадка и высушивания под вакуумом при температуре 50-60^oС до содержания влаги не более 10% /Технология лекарственных форм, под ред.А.А.Ивановой, М, Медицина, 1991, т.2, стр.440/.

Целью изобретения является расширение арсенала средств с противоязвенным действием из природного сырья, стабильного при хранении.

Поставленная цель достигается путем экстракции коры осины репеколяцией с законченным или незаконченным циклом в батарее из 5-6 диффузоров при температуре 18-25^oС и измельчонности 5-10 мм, при соотношении сырье: экстрагент 1: 2,3-1: 3 в течение 8-16 ч однократно и отстаивании в течение 3 сут при температуре 6-8^o, экстрагируют 40^o этиловым спиртом, очищенное извлечение сгущают в течение 18 ч при 32^oC под вакуумом, а затем высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40^oС в течение 3-6 ч, или 40^o извлечение сушат распылительным методом, предварительно отогнав под вакуум 1/2 чть экстрагента или разбив извлечение в 2 раза водой, при температуре на входе 120^oС, а на выходе 65^oC в течение 2-3 с.

Новые признаки в заявляемой совокупности проявили неизвестные свойства, что позволило получить более эффективный противоязвенный препарат и большую стабильность при хранении. Впервые подобраны условия экстракции и сушки, позволяющие получить новый, неизвестный ранее положительный эффект. С учетом изложенного следует считать заявляемое решение соответствующим критерию "существенные отличия".

Данная концентрация этилового спирта (40^o) обеспечивает большую устойчивость препарата в процессе экстракции по сравнению 20^o этанолом и меньший расход этилового спирта, по сравнению с 60^o и 80^o, а также сухой экстракт, полученный на 40^o этиловом спиртовом, имеет меньшая гигроскопичность и поэтому большую стабильность при хранении (фиг.1,табл.1).

Фенологликозиды являются наиболее термолабильным компонентом биологически активных веществ получаемого экстракта, в связи с чем выбор оптимальных параметров процесса сушки проводили по данным соединениям.

Исследовано два вида сушки: сушка в вакуумном-сушильном шкафу (с предварительным сгущением извлечения) и распылительная сушка (с предварительным отгоном под вакуумом 1/2 чти экстрагента или разбавлением в 2 раза водой). На стадии сгущения вакуумной сушки отгон экстрагента проводили при температуре 32^oC и 40^oC, время сгущения составляло 18 и 1,5 ч соответственно. Сушку сгущенного излечения осуществляли при четырех температурных режимах 40^o, 50^o, 60^o и 70^oС, которым соответствовало время сушки (6 и 3 ч, 5 и 2,5 ч, 4 и 2 ч, 3 и 1,5 ч). Данные проведенных исследований представлен в табл. 2,3.

Из полученных результатов видно, что, несмотря на более длительное время сгущения вытяжки (18 ч), температура отгона 32^oC обеспечивает более высокое содержание фенологликозидов в сухом экстракте коры осины обыкновенной. Так, при увеличении температуры отгона от 32^o до 40^oC (время сгущения вытяжки 1,5 ч) содержание фенологликозидов в экстракте снижается в 1,4-1,3 раза.

Повышение температуры сушки извлечения, сгущенного при температуре 32^o с 40^o до 70^oC также влечет за собой снижение содержание фенологликозидов в экстракте с 14,86% до 13,39% несмотря на уменьшение времени сушки с 6 до 3 ч.

Таким образом, оптимальными параметрами вакуумной сушки экстракта коры осины являются температура отгона 32^oC 18 ч, температура сушки 40^oC 3-6 ч. При этих значениях достигается максимальное содержание фенологликозидов в сухом экстракте коры осины обыкновенной (14,78-14,95%).

При получении сухого экстракта распылительным методом были изучены следующие параметры на входе 50^o, 65^o и 80^oС при постоянной температуре на входе (120^oC), время сушки составляло 2-3 с. Данные проведенных исследований представлены в табл. 4.

Из полученных результатов видно, что при температуре 50^oC невозможно получить сухой сыпучий препарат, в связи с тем, что точка росы находится выше температуры сушки, и экстракт превращается в густую клейкую массу темно - коричневого цвета.

Наряду с этим выявлено, что температура 65^oC обеспечивает получение сухого экстракта, представляющего собой мелкий сыпучий порошок желтого цвета с содержанием фенологликозидов не менее 15,21%
При увеличении температуры с 65^o до 80^oС внешний вид экстракта не меняется, но содержание фенологликозидов снижается до 11,35-11,40%
Таким образом, оптимальными параметрами распылительной сушки при получении сухого экстракта коры осины следует считать:
Температура на входе 120^oC, температура на выходе 65^oC, время сушки 2-3 с.

Исходя из вышеописанного, оба метода сушки могут быть рекомендованы для получения сухого экстракта коры осины, так как полученные экстракты содержат значительные количества биологически активных веществ (14,78-14,95% и 15,71-15,30% соответственно для вакуумной и распылительной сушки) обладают более высоким фармакологическим действием.

Сущность изобретения заключается в следующем: процесс экстракции проводится по двум вариантам.

Вариант 1 (законченный цикл). В каждый диффузор загружают в равных количествах кору осины, измельченную до 5-10 мм в 5-6 приемов для более плотной укладки.

В первый диффузор при открытом спускном кране заливают 40^o этиловый спирт до появления его первых порций, затем кран закрывают и добавляют экстракт "до зеркала" ( соотношение сырье экстрагент в данном и последующих диффузорах составляет 1:2,3 1:3).

Диффузор оставляют для настаивания в течение 8 ч, по истечении этого времени производят слив извлечения, которое направляется во 2-й диффузор. Недостающее "до зеркала" количество экстрагента во втором диффузоре получают путем пропускания необходимого количества 40^o этилового спирта через первый диффузор.

В 1-й диффузор заливают свежую порцию 40^o этилового спирта "до зеркала ", оба диффузора оставляют для настаивания в течение 16 ч. В дальнейшем аналогично, по принципу противотока, при котором извлечения, полученные из второго диффузора, заливают в третий, из третьего в четвертый и т.д. Все пять или шесть порций свежего экстракта ( в случае пяти или шести диффузоров в батарее) подаются в первый диффузор. После ввода в работу всех диффузоров батареи отбор всех пяти или шести порций готовой вытяжки производится из головного пятого или шестого ( соответственно для батарей из 5 и 6 диффузоров ) диффузора, выводя поочередно хвостовые диффузоры. Экспозиция настаивания на каждой ступени экстрагирования составляет 8 или 16 ч. Продолжительность экстрагирования в каждом диффузоре составляет 72 ч, а общая продолжительность процесса 6 сут.

Полученные вытяжки тщательно перемешивают и производят очистку путем отстаивания при температуре 6-8^oC в течение 3 сут, после чего фильтруют. Очищенную вытяжку сгущают под вакуумом течении 18 ч при 32^oC, а затем высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40^oC в течение 3-6 ч. Высушенную массу измельчают в измельчителе типа "кофемолки".

Вариант 2 ( незаконченный цикл ). Кору осины обыкновенной, измельченную до размеров 5-10 мм, загружают поровну в четыре (или пять) диффузора с 1 по 4 (1 по 5). 40^oC этиловый спирт подают в перколятор 1 при открытом спускном кране до появления его первых порций, затем кран закрывают и добавляют 40^o этиловый спирт "до зеркала" (в данном и последующих диффузорах соотношение сырье экстрагент 1:2,3 1:3). Диффузор оставляют для настаивания в течение 8 ч. По истечении этого времени производят слив извлечения, которое направляется во второй диффузор. Недостающее "до зеркала " количества экстракта во втором диффузоре получают пропускания 40^o этилового спирта через первый диффузор. В первый диффузор заливают свежую порцию 40^o этилового спирта "до зеркала", оба диффузора оставляют для настаивания в течение 16 ч. В дальнейшем экстрагирование проводят аналогично, по принципу противопотока, при котором извлечение, полученное из второго диффузора, заливают в третий, а затем в четвертый (из 4 в 5), из которого принимают первую порцию готовой вытяжки.

Все 4 (или 5) порций экстракта поступают в 1 диффузор.

Во время работы батареи загружают сырье в диффузор 5 (или 6), а как только будет истощен диффузор 1, его отключают от батареи. 40^o этиловый спирт теперь поступает в диффузор 2, готовую вытяжку принимают из диффузора 5 (или 6). Освобожденный от выработанного сырья 1 диффузор загружают свежим сырьем. После истощение диффузора 2 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 3, а готовую вытяжку принимают из диффузора 1. Разгружают и загружают диффузор 2. Затем 40^o этиловый спирт поступает в диффузор, а вытяжку принимают из диффузора 2. Разгружают и загружают диффузор 3. 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 5, а вытяжку принимают из диффузора 3. Разгружают и загружают диффузор 4.

Далее после отключения 5 диффузора, в котором сырье истощено, и включения диффузора 4 в случае получения вытяжки в батарее из 5 перколяторов процесс извлечения идет по вышеописанной схеме.

В случае получения вытяжки в батарее из 6 диффузоров 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 6, а вытяжку принимают из диффузора 4. Разгружают и загружают диффузор 5. Даже после отключения 6 диффузора, в котором сырье истощенно и включение диффузора 5 процесс извлечения идет по вышеописанной схеме.

Процесс экстрагирования проводят при температуре 18-25^oC. За серию готовой вытяжки считают смесь извлечений, полученной из 5 или 6 перколяторов (соответственно для батареи из 5 и 6 диффузоров).

Очистку вытяжки производят путем отстаивания при температуре 6-8^oC в течение 3 сут, после чего ее фильтруют.

Очищенную вытяжку сгущают под вакуумом в течение 18 чов при 32^oC и высушивают распылительным методом, предварительно отогнав под вакуумом 1/2 чть экстрагента или разбавив 40^o извлечение в 2 раза водой, при температуре на входе 120^oC, а на выходе 65^oC в течение 2-3 с. Высушенную массу измельчают в измельчителе типа "кофемолки".

Полученные экстракты представляют собой порошок желтого цвета со своеобразным запахом, горького вкуса. Содержание суммы фенологликозидов составляет не менее 9,35% флавоноидов не менее 7,74%
Пример 1. 1000 г коры осины, измельченной до чтиц размером 10мм, загружают поровну по 200г в пять диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки в количестве 3000 мл порциями по 600 мл заливают в 5 приемов в 1 диффузор. Экстрагирование проводят при 25^oC по принципу противотока, при котором извлечение полученное из 2 диффузора, направляется в 3, а из 3 в 4 и т. д. ( см. схему " Вариант 1" ). Экспозиция настаивания составляет 8 или 16 ч. Готовую вытяжку получают из 5 диффузора в пять приемов. Общий объем вытяжки составляет около 1600мл.

Полученные извлечения отстаивают при температуре 8^oC в течение 3 сут, затем фильтруют в течение 18 ч при 32^oC и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40^oC в течение 6 ч. Высушенную массу измельчают в измельчителе типа "кофемолки".

Содержание суммы фенологликозидов в данном экстракте составляет 14,95-14,78% флавоноидов 2,82-2,86% при влажности 1,23-1,27%
Пример 2. 1000 г осины обыкновенной, измельченную до 5 мм, загрузили поровну по 100 г в пять перколяторов с 1 по V. Экстрагент подали в перколятор 1 при открытом спускном кране до появления его первых порций, затем кран закрыли и добавили экстрагент " до зеркала" (в данном и последующих диффузорах соотношение сырье экстрагент для настаивания в течение 8 ч, по истечении этого времени производили слив извлечения, которое направляется во второй диффузор. Недостающее "до зеркала" количество экстрагента получили путем пропускания 40^o этилового спирта через 1 диффузор. В 1 диффузор залили свежую порцию экстрагента "до зеркала", оба диффузора оставили для настаивания в течение 16 ч.

В дальнейшем экстрагирование проводили аналогично, по принципу при 18 ^oC, при котором извлечение, полученное из 2 диффузора, заливали в 3, 4, а затем в 5, а из последнего принимали первую порцию готовой вытяжки.

Все пять порций экстрагента поступали в 5 диффузор.

Во время работы батареи загрузили сырьем перколятор 6, а как только перколятор истощился, его отключили от батареи.

Свежий экстрагент поступает теперь в перколятор 2, а вторую порцию вытяжки приняли из перколятора 6. Из перколятора 1 истощенное сырье направили на рекуперацию спирта, а сам перколятор загрузили свежим сырьем.

После истощения перколятор 2, свежий экстрагент поступает в перколятор 3, а в третью порцию готовой вытяжки приняли из перколятора 1. Разгрузили и загрузили перколятор 2. Свежий экстрагент поступает в перколятор 4, а четвертую порцию вытяжки приняли из перколятора 2. Разгрузили и загрузили перколятор 3.

Свежий экстрагент поступает в перколятор 5, а пятую порцию вытяжки приняли из перколятора 3. Разгрузили и загрузили перколятор 4.

Свежий экстрагент поступает в перколятор 6, а шестую порцию вытяжки приняли из перколятора 4. Разгрузили и загрузили перколятор 5.

Общий объем готовой вытяжки оставил около 1000 мл.

Полученное извлечение отстаивают при температуре 6-8^oC в течение 3 сут, затем фильтруют и высушивают распылительным методом, отогнав предварительно под вакуумом 1/2 экстрагента или разбавив в 2 раза водой, при температуре на входе 120^oC, а на выходе 65^oC в течение 2-3 с.

Содержание суммы фенологликозидов в данном экстракте составляет 15,21-15,30% флавоноидов 2,9-2,94% влажность 3,95-4,05%
В экспериментах по изучению противоязвенного действия сухого экстракта коры осины в качестве препарата сравнения был использован алантон. Алантон представляет собой комплекс сесквитерпеновых лактонов, выделенный из корней девясила высокого. Препарат усиливает кровообращение в слизистой оболочке желудка, ускоряет процессы буферной репарации, а также стимулирует выработку буферных веществ, прежде всего гликозаминогликанов в желудке. Повышение выделения буферных веществ слизистой оболочкой желудка сопровождается увеличением содержания в желудочном соке связанной хлористо-водородной кислоты, а также снижением пепсина за счет его ингибирования слизью (Машковский М.Д. Лекарственные средства Т.1. М. Медицина, С. 624).

Наиболее адекватной моделью язвенной болезнью, по данным литературы является модель нейрогенной язвы (в данном случае иммобилизация на 22 ч за шейную складку). Кроме того данная модель используется в качестве скрининговой для определения оптимальной дозы исследуемого препарата.

Изучение действия сухого экстракта коры осины в дозах 100, 250, 500, 750, мг/кг на модели язвообразования нейрогенного генеза проведено на 68 мышах-самцах линии СВА. Стресс вызвали подвешиванием животных за шейную складку на 22 ч (предварительно у мышей за 24 ч из клеток убирали корм). Животные получали препарат в течение 6 сут до начала эксперимента зондом в желудок, в 0,2 мл дистиллированной воды, седьмое введение осуществляли за 1 ч до подвешивания. В качестве эталонного препарата применяли алатон в дозе 100 мг/кг по идентичной схеме. Контрольные животные получали растворитель в эквиобъемных количествах.

Распространенность и выраженность процесса язвообразования оценивали с помощью интегрального показателя индекса Паулса и подсчета противоязвенной активности. Расчет этих показаний проводили следующим способом:


В том случае, если показатель противоязвенной активности равен 2 или превышает это значение, то препарат считают активным в противоязвенном отношении.

Статистическую обработку результатов поводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (V) и углового преобразования Фишера ( Φ ).

При использовании сухого экстракта коры осины в дозах 100, 200, 250, 500 и 750 мг/кг наблюдали выраженный противоязвенный эффект (табл. 5 ). В данных группах степень изъязвления снижалась в 2,9; 2,3; 2,3 и 2,5 раза соответственно, причем данный эффект реализовался за счет значительного снижения изъязвлений всех локализаций. Следует отметить, что в данном случае максимальная выраженность эффекта наблюдалась при использовании дозы 100 мг/кг. Все показатели алатона остались на уровне тенденции.

Для дальнейшего изучения противоязвенного действия сухого экстракта коры осины использовали модель резерпинового повреждения слизистой желудка. Резерпин, истощающий депо катехоламинов и снижающий трофическую функцию симпатической нервной системы, широко применяется для получения модели деструкций желудочно-кишечного тракта с целью поиска новых противоязвенных средств. В данной работе использовано 68 беспородных мышей-самцов. Испытуемый препарат применяли в дозах 100, 200 мг/кг, превентивный курс составил 7 введений. Эталонный препарат алантон применяли по идентичной схеме в дозе 100 мг/кг. Резерпин вводили однократно орально в ульцерогенной дозе 15 мг/кг (на 5% растворе диметилсульфоксида).

Значительная активность исследуемого препарата в дозах 100 и 200 мг/кг наблюдалась на данной модели: степень изъявления слизистой уменьшилась в 2,7 и 3,8 раза соответственно по сравнению с группой контроля. Обнаружена способность препарата в значительной степени предотвращать возникновение деструктивных изменений в желудке: достоверно уменьшилось количество крупных полосовидных язв, а число животных с язвами снизилось в 1,8 и 1,9 раза соответственно по сравнению с контролем (табл. 6). Также характерной особенностью действия сухого экстракта коры осины явилось уменьшение гиперемии слизистой. При анализе значений противоязвенной активности наблюдалась дозозависимость эффекта фитопротектора: при переходе от дозы 100 к 200 мг/кг данный показатель увеличился в 1,6 раза.

Проведено изучение противоязвенной активности сухого экстракта коры осины в сравнении с алантоном на модели язвы желудка по H.Sray, сочетающей в своем генезе нейродистрофические процессы и агрессивность пептического фактора желудочного сока. Изучение влияния испытуемого препарата на процесс язвообразования и секрецию желудка проведено на 37 крысах-самцах разводки Вистар массой 180-220 г. Экстракт коры осины вводили животным через зонд в желудок в течение 7 дней по операции в дозах 50 мг/кг. Последнее введение препарата крысам наложения лигатуры на область привратника. Операцию проводили под легким эфирным наркозом. После перевязки ткани ушивали послойно. Через 4 ч животных умерщвляли передозировкой эфирного наркоза, желудок извлекали, предварительно наложив на пищевод. Желудочное содержимое переносили в пробирки и центрифугировали 10 мин при 1,5 тыс об/мин. Определяли объем, рН сока, общую кислотность, дебит соляной кислоты, а также дебит пепсина по методу В.Н.Туголукова. На слизистой оболочке желудка подсчитывали число язвенных деструкций. Установлено, что наибольшей противоязвенной активностью обладает экстракт коры осины в дозе 100 мг/кг (табл. 7). Выраженный противоязвенный эффект наблюдали и у животных, получавших экстракт коры осины в дозе 50 мг/кг. В этих опытных группах антиульцерогенный эффект реализовался в достоверном снижении числа крупных (1 мм в диаметре), полосовидных и точечных изъязвлений по сравнению с контрольной группой. У крыс, которым вводили алантон, достоверно снизился выход крупных язв.

В группе крыс, получавших экстракт коры осины в дозе 50 мг/кг, отмечено снижение числа ее титрационных единиц (табл. 8). Экстракт коры осины в дозе 50 мк/кг способствовал снижению дебита пепсина на 17% а в дозе 100 мг/кг на 26% Анантон вызвал некоторое повышение протеолитической активности желудочного сока, судя по показателям дебита пепсина. У крыс, получавших экстракт коры осины в дозе, отмечено повышение значение рН-сока; 3,2±0,5 в контроле, что также свидетельствует о снижении "агрессивности" желудочного сока в этой опытной группе. Так, ингибиция секреция базальной чти желудочного сока, вызываемая экстрактом осины, позволяет предположить, что в основе противоязвенного действия препарата лежат его антацидные свойства. Кроме того, содержащиеся в нем флавоноиды, дубильные вещества, фенологликозиды оказывают на слизистую оболочку желудка вяжущее противовоспалительное, способствуя ликвидации поверхности эрозий и изъявлений.

Способ получения средства, обладающего противоязвенным действием, относится к медицине, конкретно, к гастроэнтерологии, и может быть использовано для лечения больных с язвенной болезнью желудка, гастритом с целью профилактики стрессовых язв у пациентов, находящихся на интенсивной терапии. Цель изобретения - повышение противоязвенной активности за счет увеличения выхода биологически активных веществ, а также повышение стабильности препарата при хранении. Сущность способа заключается в экстракции коры осины реперколяцией с законченным или незаконченным циклом в батарее из 5-6 диффузоров при температуре 18-25^oС и измельченности 5-10мм при соотношении сырье-экстрагент 1:2,3 - 1:3 в течение 8-16 ч однократно и отстаивании в течение 3 суток при температуре 6-8^oС. Новизна изобретения заключается в том, что экстрагируют 40^o этиловым спиртом, очищенное извлечение сгущают в течение 18 ч при 32^oС под вакуумом, а затем высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40 ^oС в течение 3-6 ч, или 40^oC извлечение сушат распылительным методом, предварительно отогнав под вакуумом 1/2 часть экстрагента или разбив 40^o извлечение 2 раза водой, при температуре на входе 120^oС, а на выходе 65^oC в течение 2-3 с. 8 табл. 1 ил.

Способ получения средства, обладающего противоязвенным действием, путем экстракции, настаивания, фильтрации, сгущения и сушки сырья природного происхождения, отличающийся тем, что экстрагируют 40^o этиловым спиртом измельченную до 5 10 мм кору осины с законченным или незаконченным циклом в батарее из 5 6 диффузоров при 18 25^oС при соотношении сырье - экстрагент 1 2,3 3 в течение 8 16 ч однократно, настаивают в течение 3-х сут при 6 8^oС, сгущают в течение 18 ч при 32^oС под вакуумом, а затем высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40^oС в течение 3 6 ч, или 40-градусное извлечение сушат распылительным методом, предварительно отогнав под вакуумом 1/2 часть экстрагента, или разбавив 40-градусное извлечение в 2 раза водой, при температуре на входе 120^oС, а на выходе 65^oС в течение 2 3 с.