Способ получения кислого альфа-1-гликопротеина Советский патент 1996 года по МПК A61K39/00 

ON fO О fS

Ю VO

Изобретение касается фракционирования сыворотки крови человека. Цель - повышение выхода и специфической активности кислого альфа-1- гликопротеи- на, при этом балластный осадок гомогенизируют в воде я растворяют в гидрооксиде натрия. Полученный раствор охлаждают до 3 - 15°С и вносят в него этанол. После центрифугирования смеси надосадочную жидкость одновременно концентрируют и подвергают диафильтрации на полых волокнах. (Л с о ON fcs О W VO

Р СЯ

Изобретение относится к медицине, к Фракционированию сыворотки крови человека.

Целью изобретения является повышение выхода и специфической активности целевого продукта:-а; также упрощение способа. ..:;1 1

Способ .-осуществляют следующим образом. Балластный осадок гомогенизируют в дистиллированной ..чрде в течение 1 ч. Затем растворяют его в гидрооксиде натрия и перекачивают в реактор. Раствор охлаждают до температуры 3-5°С, доводят рН до 4,7 и вводят в него этанол со скоростью 0,5 л/мин.

Вновь коррегируют рН до 4,7, перемешивают в течение 1 ч и центрифугируют при температуре 3-15°С. Осадок отделяют, а центрифугат концентрируют на ультрафиль- трэционной установке, состоящей из двух аппаратов (АР-2). Концентрат пропускают через ДЭАЭ-целлюлозу, отмывают буфером, затем 0,15М NaCI и элюат собирают.

Затем концентрируют на аппарате разделительном АР-0,2. Продукт пропускают через КМ-целлюлозу и концентрируют на аппарате АР-0,2, проводят диафильтрацию, используя дистиллированную воду и получают чистый целевой продукт.

П р и м е р. 6 кг осадка заливают 30 л дистиллированной воды и гомогенизируют 40 мин. Вводят 2 н.раствор NaOH до рН 8,7 в количестве 2,8 л. Раствор загружают в реактор и охлаждают до 3°С, устанавливают рН 4,5 путем введения 4,2 л 1 н.раствора HCI.

Затем вводят 96% этанола до концентрации 20%. перемешивают в течение 1 ч и отделяют осадок центрифугированием при температуре 3°С. Осадок в количестве 5,6 кг отбрасывают, а центрифугат в объеме 47 л концентрируют на ультрафильтрационной установке, состоящей из двух параллельно соединенных аппаратов разделительных АР-2 из полых волокон ВПУ-15 (г.Кириши), манометра и перистальтического насоса НШР-15м.

Площадь фильтрации составляет 4 м2, при давлении 0.8-1.0 атм центрифугат концентрируют до 5 л в течение 1,5 ч. Далее концентрат подвергают диафильтрации, для чего продолжают процесс ультрафильтрации при непрерывном поступлении 0.025М ацетатного буфера с рН 3,7 (буфер Kb 1) из бутыли, расположенной на высоте 0,5-1 м от бутыли с продуктом. Расход буфера

составляет 25 л, процесс диафильтрации занимает 0,8-1,0 ч,

Концентрат в буфере № 1 в объеме 5 л пропускают через колонку с волокнистой

ДЭАЭ-целлюлозой (г.Олайне). Регистрируют оптическую плотность элюата при длине волны 280 нм, Белки, несвязывающиеся с целлюлозой, отбрасывают и промывают колонку буфером № 1 до экстинции 0,01.

Затем целлюлозу промывают 0.15М

NaCI, приготовленным на буфере № 1, и

собирают 4 л элюата, который содержит 7580% кислого альфа - 1-гликопротеида (КГП).

Элюат подвергают концентрированию

до 1 л и диафильтрации на аппарате разделительном АР-0,2, используя 6 л 0,01 М ацетатного буфера с рН 3,9 (буфер № 2).

КГП в буфере № 2 пропускают через волокнистую КМ-целлюлозу (г.Олайне) и собирают 1,5 л чистого КГП, несвязывающегося с КМ-целлюлозой в данных условиях.

Чистый КГП концентрируют до 0,5 л и диафильтруют, используя дистиллированную воду в объеме 3 л. Получают целевой

продукт (0,5 л КГП с концентрацией 21 мг), который подвергают стериализующей фильтрации, разливают в ампулы, высушивают из замороженного состояния и герметизируют.

Преимущества предлагаемого способа

состоят в следующем. По сравнению с прототипом длительность получения целевого продукта сокращается на две стадии. По прототипу длительность процесса составляет 4 суток, а по заявляемому методу только 1 сутки.

Выход целевого продукта увеличивается в 3,7 раза. Если по прототипу КГП от его содержания в исходной плазме составляет

10%, то по заявляемому методу выход составляет 37% или 0,3 г с 1 л исходной плазмы.

Биологическая активность целевого продукта, определенного по степени выживаемости изолированного кожного лоскута у мышей, увеличивалась на 30%. В тесте летальной синегнойной инфекции выживаемость животных, обработанных препаратом, полученным по заявляемому способу ,

возросла на 25%, а выживаемость животных на седьмые сутки составила 85% против 60% в группе мышей, обработанных препаратом по прототипу. Общая продолжительность жизни животных увеличилась в 1,5

раза и составила 7,2 суток против 5.5 суток по прототипу.

1 16620398

Формула изобретенияцелью повышения выхода и специфичеСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОГОской активности целевого продукта, а

АЛЬФА-1-ГЛИКОПРОТЕИНА путем рас-также УпР°Щения способа, осаждение

творения, осаждения этанолом, центри-э™рлом производят при температуре 3

фугирования, концентрирования надоса-5 - 15 С, а после центрифугирования наддочной жидкости с последующим«садочную жидкость одновременно конхроматографическим выделением целево-Центрируют и подвергают диафильтраго продукта, отличающийся тем, что, на полых волокнах.