СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕНИНГОКОККОВОГО СЕРОГРУППЫ В ЛИПООЛИГОСАХАРИДА Российский патент 1997 года по МПК A61K39/95 A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к медицине, в частности, к способам получения липоолиносахаридного антигена, как кандидата будущей вакцины.

Известен способ получения липоолигосахарида (ЛОС) Neisseria meningitidis серогруппы В (Chao-Ming Tsai, 1983) (1), включающий подготовку 8 часовой посевной культуры Neisseria meningitidis; засев в 1,4 л жидкой питательной среды триптиказо-соевый бульон (TSB: Difco Laboratories, Detroit, Mich. ), следующего состава:
бактотриптон 17 г/л
бактосоетон 3 г/л
содиум хлорид 5 г/л
дипотассиум фосфат 2,5 г/л
дистиллированная или деионизированная вода до 1 л.

pH среды 7,3 при t=25^oC;
культивирование Neisseria meningitidis в 2,8 л колбе Fernbach продолжительностью 18 ч при перемешивании на шейкере 130 об/мин, скорость шейкера изменяли от 90 до 140 об/мин, что соответствовало низкой и высокой аэрации; сбор культуры; отделение микробных клеток от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 G в течение 15 мин; лиофилизацию клеток; суспендирование клеток в буфере следующего состава: 50 mM Na-фостфат, 5 mM ЭДТА, 0,05% NaN₃ pH 7,0; обработку суспензии клеток на холоду лизоцимом (15500 ед/мг) при 4^oC в течение 16 ч (3), затем при 37^oC в течение 20 мин при добавлении 20 mM MgCl₂; обработку РНК-азой и ДНК-азой до концентрации 1 мкг/мл при 37^oC в течение 10 мин и при 60^oC в течение 10 мин; лиофилизацию; горячую водно-фенольную экстракцию по Westphal Jann (1965) (2); ультроцентрифугирование; лиофилизацию.

Недостатки способа:
1. Неуправляемое культивирование не позволяет поддерживать параметры роста культуры на заданном уровне.

2. Неуправляемое культивирование не позволяет получать стандартный целевой продукт антиген.

3. Неуправляемое культивирование не обеспечивает получение препарата в больших количествах.

4. Использование триптиказо-соевого бульона питательной среды, содержащей "нативный" белок, затрудняет ее применение на практике в связи с необходимостью дополнительной очистки антигена.

5. Описанный способ исключает получение ЛОС из культуральной жидкости.

6. Использование питательной среды, содержащей природные компоненты, не позволяет исследователю сделать объективные выводы о химической структуре ЛОС.

7. Очистка антигена включает дорогостоящую ферментативную обработку.

Таким образом, недостатками известного способа является то, что неуправляемый процесс культивирования не обеспечивает получение стандартного препарата ЛОС в большом количестве, а питательная среда, содержащая природные соединения, требует дополнительной очистки антигена.

Цель изобретения повысить выход препарата и получить высокоочищенный ЛОС из клеток и из культуральной жидкости.

Цель достигается тем, что выращивание проводят в условиях непрерывного культивирования, в жидкой синтетической питательной среде, дополнительно содержащей L-глутаминовую кислоту, хлористый калий, хлористый натрий, сернокислый аммоний 7-водный, хлористый аммоний, фосфорнокислый двухзамещенный натрий 12-водный, цитрат натрия трехзамещенный, глюкозу при следующем содержании компонентов (г/л) (4):
L-глутамат натрия 1,30
L-цистеин гидрохлорид 0,03
хлористый калий 0,09
хлористый натрий 6,00
сернокислый магний 7-водный 0,06
хлористый аммоний 1,25
фосфорно-кислый двухзамещенный натрий 12-водный 2,50
цитрат натрия трехзамещенный 0,50
глюкоза 1,60
дистиллированная вода до 1 л
pH среды 7,6 7,7 при T=25^oC;
дополнительно после отделения клеток от культуральной (бесклеточной) жидкости, культуральную жидкость концентрируют ультрафильтрацией через мембрану, собирая частицы размером 100 кД на установке "Millipor"; этот концентрат и клетки подвергают экстракции (45±1)% раствором фенола; очистку экстрактов осуществляют трехкратно; супернатанты объединяют и выделяют дополнительное количество ЛОС путем очистки их (2+1)% раствором цетавлона; окончательно очищают ЛОС-ы с помощью гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200 в буфере, содержащем дезоксихолат натрия (ДОХ-Na).

Пример N 1 (существления способа).

1. Приготовление синтетической питательной среды.

Сухая синтетическая питательная среда представляет собой порошок белого цвета. Для приготовления 1 л питательной среды взвешивают (11,75±0,9) г сухой питательной среды следующего состава (г/л)%
L-глутамат натрия 1,30±0,50
L-цистеин гидрохлорид 0,30±0,02
хлористый калий 0,09±0,08
хлористый натрий 6,00±1,00
серно-кислый магний 7-водный 0,06±0,01
хлористый аммоний 1,25±0,90
фосфорно-кислый двухзамещенный натрий 12-водный 2,50±0,60
цитрат натрия трехзамещенный 0,50±0,10
глюкоза 1,60±0,50
и растворяют в 1 л дистиллированной воды, подогревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают pH=7,6-7,7 с помощью (10,0±1,0)% NaOH, фильтруют через фильтр и разливают в емкости. Питательную среду стерилизуют при (112±1)^oC в течение (30±5) мин. После стерилизации добавляют стерильный раствор (40±10)% глюкозы из расчета (4,0±0,9) мл на 1,0 л питательной среды. В бутыли в стерильных условиях вставляют сифоны, позволяющие стерильно перекачивать питательную среду в ферментер.

2. Приготовление посевной культуры.

В стерильных условиях вскрывают ампулу с лиофильно высушенной культурой менингококка штамма N 125. Пастеровской пипеткой вносят в ампулу (0,5±0,4) мл стерильного (0,85±0,91)% раствора хлорида натрия, и полученную взвесь последовательно рассеивают на 3 чашки с 20% сывороточным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют при (37±2,5)^oC в течение 18-20 ч в эксикаторе со свечой. Выросшие колонии должны быть в s-форме, прозрачные с голубоватым оттенком, с ровными краями и гладкой блестящей поверхностью, не более 2-х мм в диаметре. В мазке, окрашенном по Грамму в модификации Калины, культура должна представлять собой мелкие грамотрицательные диплококки. Выросшая микробная взвесь должна давать положительную реакцию агглютинации на стекле с коммерческой сывороткой Neisseria meningitidis серогруппы В. Культуру, типичную по всем показателям, рассеивают на 15 чашках или 3 матрасах с 20% сывороточным агаром Хоттингера, инкубируют при (37±2,5)^oC в течение 18-20 ч, смывают стерильным (0,85±0,91)% раствором хлорида натрия и помещают в стерильную колбу с сифоном, и используют в качестве посевной культуры.

3. Культивирование в ферментере.

Посевную культуру, находящуюся в колбе с сифоном, присоединяют к шлангу засева и с помощью резиновой груши через шланг со стерильным фильтром в ней создают избыточное давление, позволяющее перелить содержимое колбы в ферментер. Культивирование культуры проводят в синтетической питательной среде. Процесс выращивания непрерывный при постоянно контролируемом уровне кислорода, оптической плотности биомассы и pH среды.

4. Отделение микробных клеток от культуральной жидкости.

К микробной культуре добавляют свежеприготовленный нейтральный (40±5)% раствор формалина до конечной концентрации (0,2±0,1)% Микробные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при (6000±1000) об/мин в течение (30±10) мин, промывают дистиллированной водой, при повторном центрифугировании.

5. Получение препарата ЛОС-антигена.

Получение препарата ЛОС осуществляют из клеток и из культуральной жидкости. На фиг.1 и 2 приведены схемы получения ЛОС из клеток и из культуральной жидкости и основные этапы очистки.

Как видно из схем к выросшей культуре Neisseria meningitidis добавляют формалин конечной концентрации (0,2±0,1)% микробные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, затем культуральную жидкость концентрируют с помощью ультрафильтрации. Клетки и концентрат культуральной жидкости высушивают. Затем проводят экстракцию раствором водного фенола при T+(62±5)^oC, собирают водные слои, диализуют их и 3-ех кратно ультроцентрифугируют, образовавшееся супернатанты и их осадки объединяют, объединенные супернатанты подвергают обработке (2±1)% раствором цетавлона, при этом удаляют образовавшиеся соли цетавлона и нуклеиновых кислот, объединенные осадки и очищенные цетавлоном объединенные супернатанты окончательно очищают с помощью гель-хромотографии на колонке с сефадоксом G-200 в буферном растворе с pH=8,0, содержащем дезоксихолат натрия (ДОХ-Na), и очищенный препарат ЛОС лиофильно высушивают.

6. Выход препарата ЛОС.

В таблице представлены данные, отражающие выход препарата ЛОС, полученного по выше приведенным схемам, и выход препарата ЛОС, выделенного способом, описанным в работе с.-м. Tsai(1). Выход ЛОС представлен в по сухому весу клеток и в мкг на млрд. клеток.

Сопоставление выхода препаратов ЛОС Neisseria meningitidis серогруппы В, полученного по схемам 1,2 и по способу, описанному с.-м. Tsai.

Из таблицы видно, что выход препарата ЛОС как в по сухому весу клеток, так и в мкг на млрд. кл. выделенного из клеток менингококка штамма N 125, примерно в 2 раза выше (% по сухому весуклеток) и в 3,5 раза больше (мкг/млрд. кл.), чем выход препарата ЛОС, полученного с.-м. Tsai.

Список литературы.

1. Tsai C. M. Robert Boyking, Carl E.Frasch / Journal of Bacteriology- 1983 v.155. N 2. p.498 504.

2. Westphal O. Jann K. / Methods Carbohydr. Chem. 5. p.83 91.

3. Johnson K.G. M.B. Perry /Can J. Microbiol. 22: p.29 34.

4. Баснакьян И.А. Карабак В.И. Артемьева Т.А. Кувакина В.И. Аллилуев А. П. Котельников О.В. Способ получения биомассы менингококка. Авторское свидетельство СССР N 1022487, кл. C 12 Т 1/00, 1981.

Целью изобретения является повышение выхода препарата и получение высокоочищенного липоолигосахаридного антигена из клеток и из культуральной жидкости. Для достижения этой цели выращивание проводят в условиях управляемого культивирования, в жидкой синтетической питательной среде, содержащей 4-глутамат натрия, хлористый натрий, хлористый калий, сернокислый магний 7-водный, хлористый аммоний, фосфорнокислый двухзамещенный натрий-12 водный, цитрат натрия трехзамещеный, глюкозу, при следующем содержании компонентов (г/л): L-глутамат натрия 1,30±0,5, L-цистеин гидрохлорид 0.03±0,02, хлористый калий 0,09±0,08, хлористый натрий 6,00±1,00, сернокислый магний 7-водный 0,06±0,01, хлористый аммоний 1,25±0,9, фосфорнокислый двухзамещенный натрий 12-водный 2,5±0,6, цитрат натрия трехзамещенный 0,50±0,1, глюкоза 1,6±0,5, дистиллированная вода - до 1 л. К выросшей культуре N.meningitidis добавляют формалин до конечной концентрации (0,2±0,1)% , микробные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, затем культуральную жидкость концентрируют с помощью ультрафильтрации. Клетки и концентрат культуральной жидкости высушивают. Затем проводят экстракцию раствором водного фенола при T(62±5)^oC, собирают водные слои, диализуют их и 3-ех кратно ультроцентрифугируют, образовавшиеся супера и осадки объединяют, объединенные супера подвергают обработке (2±1)% раствором цетавлона, при этом образовавшиеся соли цетавлона и нуклеиновых кислот, объединенные осадки и очищенные цетавлоном объединенные супера окончательно очищают с помощью гель-хромотографии на колонне с сефадексом G-200 в буферном растворе, содержащем дезоксихллат натрия (ДОХ-Na), и очищенный препарат ЛОС лиофильно высушивают. 1 табл., 2 ил.

Способ получения липоолигосахарида N meningitidis серогруппы В, включающий засев в жидкую питательную среду, содержащую хлористый натрий, выращивание микроорганизмов в условиях перемешивания, сбор культуры, отделение микробных клеток, экстракцию целевого продукта из клеток (45 ± 1)%-ным раствором фенола при (62 ± 5)^oС с последующим диализом, ультрацентрифугированием и выделением целевого продукта из осадка, отличающийся тем, что выращивание проводят в условиях непрерывного управляемого культивирования в жидкой синтетической питательной среде, дополнительно содержащей L-глутамат натрия, L-цистеин гидрохлорид, хлористый калий, сернокислый магний 7-водный, хлористый аммоний, фосфорнокислый двузамещенный натрий 12-водный, цитрат натрия трехзамещенный, глюкозу, при следующем содержании компонентов, г/л:
L-Глутамат натрия 1,30 ± 0,5
L-Цистеин-гидрохлорид 0,03 ± 0,02
Хлористый натрий 6,00 ± 1,00
Хлористый калий 0,09 ± 0,08
Сернокислый магний 7-водный 0,06 ± 0,01
Хлористый аммоний 1,25 ± 0,9
Фосфорнокислый двухзамещенный натрий 12-водный 2,50 ± 0,6
Цитрат натрия трехзамещенный 0,50 ± 0,1
Глюкоза 1,60 ± 0,5
Дистиллированная вода До 1 л
рН среды 7,6 7,7 при (25 ± 2)^oС, культуральную жидкость концентрируют ультрафильтрацией через мембрану, собирая частицы размером 100 кД, из полученного концентрата дополнительно экстрагируют целевой продукт, каждый экстракт ультрацентрифугируют трехкратно, осадки и супернатанты объединяют между собой соответственно, объединенный супернатант обрабатывают (2 ± 1)%-ным раствором цетавлона и отделяют надосадок, далее полученный надосадок и объединенный осадок лиофильно высушивают и подвергают гельхроматографии на колонке с сефадексом С-200 в буферном растворе, содержащем дезоксихолат натрия, фракции с КD 0,75 объединяют, и полученный целевой продукт лиофильно высушивают.