Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для скрининга населения для отбора групп с высоким риском онкологических заболеваний, картирования зон проживания с высоким риском канцерогенеза, для оценки степени опасности радиационного поражения, мониторинга рабочих, занятых в потенциально канцерогенных производственных процессах, слежение за лечением и выявление рецидивов.
Известно использование моноклональных антител (мкат) для дифференциального иммуногистохимического исследования пунктатов, скарификатов, мазков, соскобов с опухолей при хирургических операциях с целью уточняющей диагностики.
Для целей скрининга и мониторинга, выявления рецидивов неприемлема пункционная биопсия для забора биологического материала.
В связи с этим используют свойство антигенов опухолей слущиваться и поступать в кровоток, где они могут быть определены с помощью мкат.
С целью расширения возможности диагностики злокачественных новообразований в последнее десятилетие широко разрабатываются методы серологического определения в сыворотке опухолеассоциированных антигенов. Для целей мониторинга рака молочной железы с большим или меньшим успехом используют такие маркеры, как РЭА (раковоэмбриональный антиген), CA-15-3, MCA, CA-125, TPS (The Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation, V. 55, 1995; Tumor Markers. Current Status and Future Trends).
Прототипом данного технического решения может служить набор фирмы Hoffman La Roche для определения муциноподобного ассоциированного с карциномами антигена (МСА), высокомолекулярного гликопротеина, который обнаруживается иммуногистологически в различных карциномах, особенно карциномах молочной железы и в отдельных случаях нормального эпителия слизистой. (Cancer Res., V. 48, P. 6799-6802 (1988).
Набор состоит из шариков из полистирола, покрытых мышиными мкат против МСА, конъюгата мышиных мкат против МСА с пероксидазой хрена, стандартные растворы с концентрациями МАС 125, 25 и 50 U/мл, контрольная сыворотка с известным содержанием МСА, буфер, концентрат субстрата ТМБ пероксидазы, перекись водорода в буфере, останавливающий энзиматическую реакцию раствор-серная кислота.
В качестве диагностических признаков используются следующие критерии: 1) повышение уровня маркера против верхней границы нормы,
2) выраженная динамика снижения уровня маркера после лечения не менее чем на 50%. Анализ МСА может быть использован для мониторинга и обнаружения рецидивов.
Однако анализ, предусматривающий использование этого набора, является длительным, продолжительность его составляет 4 - 6 ч.
Другой недостаток заключается в невозможности определения опухолевых маркеров в образцах крови. Связанная с этим необходимость получения сыворотки также увеличивает время проведения анализа.
На сегодняшний день все маркеры, используемые для серодиагностики злокачественных опухолей, содержатся в сыворотке здоровых доноров. Процесс злокачественного роста сопровождается повышением уровня этих маркеров в сыворотке. Поэтому эти маркеры не могут быть использованы для скрининга. Их используют только для мониторинга терапии, обнаружения рецидивов.
Не существует диагностикума для скрининга, а также для обнаружения опухолеассоциированных антигенов в цельной крови.
Цель изобретения заключается в устранении указанных недостатков.
Поставленная цель достигается использованием нового маркера опухолевого роста, определяемого в сыворотке мкат, продуцируемыми штаммом гибридных культивируемых клеток мышей Mus. musculus L No BCKK/П/456Д (SU N 1698287 A1, 1989, БИ N 46, 1991), использованием в скрининговом экспреасс-анализе принципа агглютинации антигеном антител, покрывающих частицы гидроксида железа.
В состав набора-диагностикума входит: гидрозоль оксида железа (2 мл), нагруженный 800 - 1400 мкг мкат, рабочий буфер для разведения проб и гидрозоля (0,06М ацетатный буфер pH 7,2 с добавкой 0,15 М NaCl), планшет U-образный, положительный контроль с содержанием гликопротеинового маркера не менее 1-2 мкг и отрицательный контроль - донорская сыворотка или кровь.
Проведение анализа. Разведения сыворотки (или цельной крови, к которой предварительно добавлен 4% цитрат натрия в соотношении 1:9) готовят в планшетах в интервале 1 - 100 в ацетатном буфере pH 7,2. После этого добавляют 50 мкл разведенного в 10 раз гидрозоля оксида железа, нагруженного мкат. Иммунохимическая реакция проходит в течение 10 - 15 мин. В случае положительного результата имеет место яркая точка, в случае отрицательного результат - зонтик.
Основные характеристики диагностикума приведены в таблице 1.
Пример 1. Кровь 7 здоровых доноров в возрасте от 22 до 40 лет исследовали на присутствие антигена, определяемого с помощью данного набора. Ни в одном из случаев не наблюдали положительной реакции.
Пример 2. Образцы сывороток и крови 15 пациентов с неонкологической патологией в возрасте от 26 до 45 лет исследовали на присутствие антигена. Ни в одном из случаев не наблюдали положительной реакции.
Пример 3. Образцы сывороток или крови 21 пациента, у которых при гистологическом обследовании установлен рак молочной железы разных стадий развития, исследовали на присутствие антигена. В сыворотке или крови 12 пациентов обнаружена положительная реакция.
Пример 4. Образцы сывороток 11 пациентов, у которых при гистологическом исследовании установлена злокачественная лимфома, исследовали на присутствие антигена. У 10 пациентов обнаружена положительная реакция.
Пример 5. Образцы сывороток 7 пациентов, у которых при гистологическом исследовании установлен рак яичников II, III, IV стадий, исследовали на присутствие антигена. У 4 пациентов обнаружена положительная реакция.
Пример 6. Образцы сывороток 9 пациентов, у которых при гистологическом исследовании установлен рак легких III и IV стадий, исследованы на присутствие антигена. У 5 пациентов обнаружена положительная реакция.
Результаты экспериментов представлены в таблице 2. Из таблицы видно, что с помощью предлагаемого диагностикума выявляется 50-60% онкологических больных по анализу сыворотки или цельной крови, взятой из пальца. В таблице 3 представлены результаты анализа образцов сывороток двумя методами с использованием моноклональных антител, продуцируемых штаммов гидридных клеток мышей Mus. musculus L: количественным ИФА и иммуноагглютинационным, описанным в данной заявке. Как видно из таблицы, наблюдается корреляция этих двух методов в отношении выявления нового опухолевого маркера.
Набор предназначен для скрининга населения при формировании групп с высоким риском заболевания онкологическими заболеваниями, при картировании зон проживания с высоким уровнем канцерогенеза, для оценки степени опасности радиационного поражения рабочих, занятых в потенциально канцерогенных производственных процессах. Набор содержит носитель с иммобилизованными моноклональными антителами, буферный раствор и контрольные образцы. В качестве носителя набор содержит 2 мл гидрозоля оксида железа (III) с размером частиц 0,1 - 0,8 мкм. На носитель иммобилизовано 800 - 1400 мкг моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L Nо ВСКК/П/456Д. К качестве буферного раствора набор содержит 0,06 М ацетатный буфер, имеющий pH 7,2, с добавкой 0,15 М хлорида натрия. В качестве контрольных образцов - положительный контроль, содержащий гликопротеин-онкомаркер, и отрицательный контроль - донорскую сыворотку или цельную кровь. Использование набора позволяет выявить 50 - 60% онкологических больных по анализу сыворотки или цельной крови. 3 табл.
Набор для скринингового анализа онкомаркера, содержащий носитель с иммобилизованными моноклональными антителами, буферный раствор и контрольные образцы, отличающийся тем, что в качестве носителя набор содержит 2 мл гидрозоля оксида железа (III) с размером частиц 0,1 - 0,8 мкм, на котором иммобилизовано 800 - 1400 мкг моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L No ВСКК/П/456Д, в качестве буферного раствора набор содержит 0,06 М ацетатный буфер, имеющий pH 7,2, с добавкой 0,15 М хлорида натрия, а в качестве контрольных образцов - положительный контроль, содержащий гликопротеин-онкомаркер, и отрицательный контроль - донорскую сыворотку или цельную кровь.
