Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклонального антитела к фактору Виллебранда системы свертывания крови человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/20 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунометрического определения фактора Виллебранда с помощью специфических моноклональных антител (монАТ).

Цель изобретения - получение штамма гибридомы мыши - продуцента монАТ к ФВ.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под № 317Д. Авторское наименование 380Ф2.

Штамм получают следующим способом.

Мышей линии BaLb/c 1,5-2-месячного возраста иммунизируют дважды, одновременно внутрибрюшинно и подкожно по 6 ЕД на мышь с интервалом в 3 нед. Первая иммунизация антигеном в смеси с полным адьювантом Фрейнда, вторая без адьюван- та. Через 72 ч после последней иммунизации проводят слияние 100x10 спленоцитов

иммунизированной мыши с 25x10 клеток мышиной миеломы х63Ад8.653.А. обрабатывая смесь клеток раствором полиэтиленгли- коля (50%)с молекулярной массой 1000. Для выращивания гибридом используют фидерный слой из перитонеальных макрофагов мышей и среду Игла в модификации Дуль- бекко(ДМЕМ), содержащую 15% инактиви- рованной нагреванием взрослых коров, 20% кондиционированной клетками хбЗ.Ад8.653.А ростовой среды. В среду добавляют селективные добавки: гипоксан- тин. тимидин и аминоптерин. Тестирование клонов-продуцентов проводят с помощью иммуноферментного анализа. В качестве сажаемого на твердую фазу антигена используют тот же аппарат, что был использован для иммунизации. Первичный скрининг

О

ю

со

о

Јь

О

проводят прямым методом по схеме антиген - мышиные моноклональные антитела клонов-продуцентов - кроличий антимышиный иммунопероксидазный конъюгат. Специфический скрининг проводят конкурентным иммуноферментным методом, используя коммерческую поликлональную кроличью антисыворотку к фактору УШ человека. В результате из 30 клонов положительных в первичном тексте отбирают 21 клон в специфическом конкурентном методе. Среди них для дальнейшей работы берут один клон, который дважды реклонируют методом предельных разведений на слое перитонеальных макрофагов мышей. 100% полученных реклонов позитивны при тестировании на AT к фактору Виллебранда. Один из полученных клонов (авторское название 380Ф2) реклонируют и замораживают.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Стандартными условиями культивирования штамма являются: температура 37°С, среда ДМЕМ или MEM с 10% инактивиро- ванной сыворотки крупного рогатого скота, по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, культивирование в герметично закрываемых флаконах Карреля или в чашках Петри в атмосфере с 5% СОа в воздухе и 100%-ной влажностью. Культура представляет собой взвесь одиночных клеток или рыхлых агрегатов по 4-16 и более клеток, легко разъединяющихся при встряхивании. Оптимальная посевная доза 0,5-1,0х106 клеток в 1 мл среды. Для поддержания культуры в пролифе- рирующем состоянии клетки рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1/8-1/10. Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,0-1,2х106 кл/мл. Клетки в культуре выглядят прозрачными, округлыми, часть их прилипает к поверхности культуральных сосудов. Видовая принадлежность штамма подтверждается тем, что гибридные клетки прививаются мышам линии BaLb/c. Для этого мыши сенсибилизируются введением внутрибрюшинно по 0,5 мл на мышь пристана или вазелинового масла за неделю до прививки внутрибрюшинно каждой мыши 5,0х106 клеток. Асцит образуется через 2-3 нед. в объеме 1,5-2,0 мл. Проверка штамма на присутствие контаминирующих микроорганизмов, проведенная на культурах, постоянно выращиваемых без антибиотиков, показывает отсутствие бактерий, грибов, дрожжей и ми- коплазм

Клетки штамма 380Ф2 продуцируют в среду иммуноглобулины IgGi класса. Это показано в твердофазном иммуноферментном

анализе с помощью серии моноспецифических кроличьих антисывороток к мышиным антителам классов IgGi, lgG2a, lgG2B, 1дСз и 1дМ. Специфичность антител оценивают в

конкурентном иммуноферментном анализе с коммерческой сывороткой к фактору УШ R:Ag и методом иммуногистохимического окрашивания эндотелиальных клеток пуповин ной вены человека.

0 Криоконсервирование штамма проводят в среде следующего состава. %: среда MEM или ДМЕМ 50; сыворотка крупного рогатого скота 40; диметилсульфоксид 10. Замораживание осуществляют в следую5 щем режиме: клетки в концентрации 1,0- 5,0x10 кл/мл криосреды помещают на 24 ч в низкотемпературный холодильник (-70°С), после чего быстро переносят в жидкий азот. Для размораживания ампулу из жидкого

0 азота перекладывают в воду с температурой 40°С, через 5 мин клетки центрифугируют и помещают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 75-80% в тесте с трипановым синим.

5 Основанием для выделения гибридом- ного штамма 380Ф2 в качестве нового штамма является то, что клетки этого клона растут на среде с сывороткой крупного рогатого скота, что исключает использование

0 дорогостоящей сыворотки эмбрионов коров, применяемой для культивирования близких штаммов.

Пример 1. Иммуногистохимическое окрашивание криостатных срезов пуповин5 ной вены и кожи человека.

Криостатные срезы пуповинной вены и кожи человека, фиксированные ацетоном и хлороформом в течение 10 мин, инкубируют при комнатной температуре с моноклональ0 ным антителом клона 380Ф2, затем последовательно с кроличьей антисывороткой к иммуноглобулинам мыши RAM (1:50) и РАР- реагентом мыши (1:150). Время инкубации с моноклональными антителами 45 мин, да5 лее по 30 мин и между этими процедурами - отмывки в трис-HCI буфере (10 мМ трис, 20 мМ NaCI, pH 7,4) по 15 мин каждая. После последней промывки активность перокси- дазы, входящей в состав РАР-реагента, вы0 являют инкубацией срезов в течение 5 мин в трис-НС1-буфере (50 мМ трис. рН 7,6). содержащем 0,6 мг/мл диаминобензидина и 1 мкл/мл 33%-ного На02. Затем срезы отмывают в дистиллированной воде, окрашива5 ют гемалауном Майера 5 мин, снова промывают в проточной воде и после обезвоживания заключают в бальзам. Для нейт- раллизации эндогенной пероксидазы используют смесь глюкозы (10 мг/мл) и глю- козоксидазы (0.75 ЕД/мл) на трис-НС -буфере (10 мМ трис, 20 мМ NaCI, pH 7,4), которая наносится одновременно с RAM. При микроскопии препаратов установлено, что клетки эндотелия пуповинной вены и сосудов кожи имеют диффузное окрашивание цитоплазмы коричневого цвета. При этом на контрольных срезах (обработка RAM и РАР-реагентом) окрашивание отсутствует.

Пример 2. Использование монокло- нальных антител для определения уровня фактора Виллебранда в крови здоровых доноров и больных.

Лунки в планшетах заполняют раствором кроличьих поликлональных антител к фактору Виллебранда в разведении 1:2000 на фосфатно-солевом буфере А (0,14 мМ NaCI, 0,2 мМ KCI, 8 мМ №2Н2РСм, 1,5 мМ КН2Р04. рН 7,2), инкубацию проводят в течение ночи при 4°С. Далее последовательно наносят человеческую плазму (1:100). мышиные моноклональные антитела к фактору Виллебранда (культуральная жидкость в разведении 1:1), козий антимышиный конъ- югат в разведении 1:2000. Все разведения производят на фосфатно-солевом буфере Б (0,5 мМ NaCI, 2,5 мМ KCL, 8 мМ N32HPCM, 1,5 мМ КН2РСМ, рН 7.2), содержащем 0,1% твина 20. Каждый слой инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, после чего планшеты трижды промывают буфером Б. Все растворы наносят в лунки по 50 мкл. После последней промывки активность пероксидазы.

входящей в состав коньюгата, выявляют инкубацией в течение 30 мин в цитрэтно-фос- фатном буфере (34 мМ безводной лимонной кислоты, 68 мМ Na2HPG(,pH 5,0), содержащем 0,5 мг/мл ортофенилдиамина и 1мкл/млЗЗ%-ного H2U2. Реакцию тормозят добавлением в лунки равного объема 12,5%- ного раствора Й2504. Оценку результатов производят на вертикальном многоканальном спектрофотометре (при 490 нм). Нормальная человеческая плазма от 20 здоровых доноров была использована как стандарт. Контроль неспецифического связывания был сделан с нормальными мышиными иммуноглобулинами (вместо моноклональных антител).

Результаты показывают, что монАТ в сэндвич-ИФА выявляют достовернее повышение содержания в крови фактора Виллебранда у больных лимфогранулематозом, раком молочной железы, раком головки под- желудочной железы.

МонАТ могут быть использованы в разработке тест-системы для количественного

определения антигена.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L Ns ВСКК(П) 317Д - продуцент моноклонального антитела к фактору Виллебранда системы свертывания крови человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения фактора Виллебранда (ФВ) с помощью специфических моноклональных антител. Цель изобретения - получение штамма гибридомы мыши - продуцента монАТ к ФВ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗХбЗАд 8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных частично очищенным ФВ. МонАТ отбирают методом иммуноферментного анализа на том же антигене. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Штамм способен расти в виде асцитных опухолей в организме сингенных мышей. Класс монАТ Jg G1. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 317Д. fe