Способ получения конъюгированных антигенов Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

1 1

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу получения конъюгированного антигена бензидин - антигенный носитель, который может найти применение в медицине и биологии для получения антител к бензидину, а также для определения концентрации и локализации бензидина в жидкостях и тканях организма .

091691

Известен способ получения конън1гированных антигенов, предусматривающий активацию бензидина диазотитрованием его нитритом натрия в концентрированной соляной кислоте при 0-2°С и связывание активированного производного бензидина - его диазониевой соли с антигенным белковым носителем в реакции азосочетания при рН 7-8 и весовом соотношении 1: 20.

HyN

Очистку конъюгированного антигена проводят колоночной гель-хроматографией на сефадексеС-25. Получают конъюгированные антигены, содержащие от 8 до 17 молекул бензидина на одну молекулу белкового антигенного носителя 13Недостатком этого способа получения конъюгированных антигенов (КА) бенз1един - белок является невысокое качество образзтощегося целевого продукта, которое обусловлено тем, что молекула исходного бензидина (гаптен) существенно модифицируете;, в ней исчезает аминогруппа и появляется новая азо-связь, в результате чего поверхность молекулы гаптена изменяется. Поэтому антитела, полученные с помощью такого КА, лучше .связьшают модифицированное производное бензидина, чем исходный бензидин, что свидетельствует о существенном иммунохимическои недостатке этого конъюгированного антигена. Кроме того, в КА имеется только один участок связывания бензидина с белком, поэтому антитела, индуцируемые таким КА, направлены также только к одному участку молекулы гаптена противоположному месту присоединения его к белковому носителю. В результате указанного при использовании в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) конъюгированного антитела бензидин - белок, полученного диазоспособом, не удается выявить низкий уровень иммунного ответа антитела к бензидину в сыворотке крови животных, длительно получавших бензидин (выявляемый титр 1:256).

Таким образом, известный способ отличается высокой специфичностью выявления антитела к бензидину и/или бензид.ина, -связанной с модификацией молекулы гаптена (изменение пространственной организации молекул гаптена).

Цель изобретения - улучшение иммунохимических свойств получаемого продукта.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов, предусматривающему активацию бензидина и связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем при рН 7-8, активацию бензидина осуществляют окислением его пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода при массовом соотношении реагентов (1-10):5:(0,62,4), а связывание активированного пизводного бензидина с антигенньм белковым носителем проводят при весовом соотношении соответственно (6,617,4):20.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что согласно способу получают новые реакционноспособные производные бензидина (свободные радикалы и хинонимины) окислением бензидина пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода. Эти реакционноспособные производные при взаимодействии с белковым антигенным носителем образуют гетерогенную смесь конъюгированнь1Х антигенов, отличающихся положением присоединения бензидина к белку, в которых молекула исходного гаптена не модифицируется.

) где - другие возможные места присоединения бензидина к белку. В результате таких превращений получают КА с повьшенным качеством улучшенными иммунохимическими характеристиками. С помощью полученного; предлагаемым способом конъюгированно антигена бензидин - белок выявляются антитела к бензидину у животных, которым вводили дпительное время этот канцероген per os, выявляемьш титр 1:512, что недоступно для КА, получе ного известным диазометодом. Кроме того, при иммунизации животных конъюгированными антигенами, получен ными предлагаемым и известным способами, индуцируются антитела различно специфичности. Антитела, полученные с помощью предлагаемого способа, в незначительной степени перекрестно реагируют.с вторым конъюгированным антигеном и наоборот. В предлагаемом способе получения КА бензидин - антигенный носитель реакционноспособное производное бенз идина получают при добавлении к раст вору бензидина в диоксане раствора пероксидазы хрена и перекиси водорода в фосфатном буфере при рН 7-8 в указанном весовом соотношении при 20-25°С. Смесь добавляют к 0,5%-ному раствору антигенного белкового носителя в фосфатном буфере при рН 7-8 в весовом отношении (6,6-17,4):20 со ответственно при 0-25С-по каплям пр перемешивании, инкубируют 10 мин. КА бензидин - белок очищают от низкомолекулярных продуктов реакции и перокс дазы хрена колоночной гель-хроматогр фией на акрилексе П-60 Количество бензидина в КА определяют спектрофотометрически (2). В зависимости от соотношения реагентов получают коныо . /ЬЧ :vC Беуюк I 5елок f .(HH-ffPAOK) гированные антигены бензидин - антигенный носитель, в которых с одной молекулой белка ковалентно связано 540 молекул бензидина. В предлагаемом способе соотношение бензидина,белкового носителя и системы пероксидаза - перекись водорода, активирующей бензидин, выбрано в таких пределах, при которых образуется конъюгат юптимального качества, т.е. содержащий 5-40 молекул бензидина на одну молекулу антигенного носителя. При меньшей посадке гаптена на антигенный носитель ухудшаются его антигенные свойства, при большем замещении возможны побочные явления при иммунизации животных, кроме того, ухудшается растворимость КА. Выбранный интервал температуры и величина рН дозволяет проводить реакцию ковалентного связывания бензидина с антигенным носителем с достаточно высокой скоростью при стабильности фермента и белкового антигенного носителя. Иммунохимические исследования проводят на различных группах кроликов, иммунизированных КА, полученными диазометодом и предлагаемым способом, а также на.группе крыс, кормленных длительное время бензидином. Наличие антител к-бензидину определяют в сыворотке крови иммунизированных и получавших гаптен per OS животных стандартной РПГА и реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), используя эритроциты барана (ЭБ), сенсибилизированные соответствующими антигенами. Максимальный титр антител к бензидину у животных, иммунизированных КА бензидин - антигенный носитель, полученным предлаSгаемым способом, составляет 1:512, а у животных, иммунизированных КА, полученным диазометодом - 1:256, Антитела, индуцируемые первым кон-ы гированным антигеном дают слабые перекрестные реакции «со вторым КА наоборот. Определяют низкий уровен иммунного ответа (титр антител 1:32) на бензидин в сыворотке крови крыс, длительно кормленных гаптеном, лишь с помощью конъюгированного антигена бензидин белок, полученного предлагаемым способом. Пример 1. Способ пёлучени КА бензидин-бычий сывороточный аль бумин. К 10 мг (3,) бензидина в 0,5 мл диоксана добавляют 5 мг (1,1- ) пероксидазы хрена в 1 мл Oj1 М фосфатного буфера рН 7, и 0,8 мл (6,4-10-5м) 0,3%-ного раствора перекиси водорода. Смесь перемешивают и по каплям добавляют к раствору бычьего сывороточного альбумина 20 мг в 2 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4. Реакционную массу инкубируют при комнатной температуре в течение 10 ми Полученный конъюгат бензидин-бьтий сывороточный альбумин очищают колоночной гель-хроматографией на акрилексе П-60. По данньм спек,трофотометрий с одной молекулой -белка в КА ковалентно связано 29 молекул бензидина. Пример 2. Способ получени КА бензидин-бычий сывороточный аль бумин . К 1 мг (3,5-10М) бензидина в 0,5 М.П диоксана добавляют 5 мг (1,1 10М) пероксидазы хрена в t мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7, иО,2мл. (1,) 0,3% раствора перекиси водорода. Далее реакцию проводят аналогично примеру 1. Получают КА, в котором с первой молекулой белка ковалентно связано 40 молекул бензидина. Пример 3. Способ получени КА бензидин-бычий сьшороточный альбумин. К раствору 5 мг (1,) бен идина в 0,5 мл диоксана добавляют пероксидазу хрена и перекись водорода в соотношении, указанном в примере 2. Далее реакцию проводят аналогично примеру 1. Получают КА, 96 в котором на одну молекулу белка приходится 15 молекул бензидина. Пример 4. Антигенные свойства КА бензидин-бычий сывороточный альбумин. Кроликам весом 2 кг вводят внутрикожно в 10-15 разных точек 5мг/кгвеса животного коньюгированный антиген, полученный по примеру 3, в смеси с равным.объемом полного адъюванта Фрейнда. Аналогичную иммунизацию проводят через 7 дней. Через две недели дважды с интервалом в 7 сут животным вводят КА внутримьш1ечно в дозе 10 мг/кг без адъюванта. Спустя месяц проводят реиммунизацию четырьмя внутримышечными инъекциями КА 10 мг/кг с недельным интервалом. Через семь дней после последней иммунизации у животных берут кровь из краевой ушной вены и определяют титры антител к бензидину с помощью РИГА. Реакцию РПГА проводят на полистироловых пластинках В каждую лунку пластин вносят по 0,025 мл среды рН 8,2. Затем в первую лунку каждого ряда добавляют по 0,025 мл иммунной сыворотки, предварительно декомплементированной при 56° в течение 1 ч. Далее сыворотку раститровывают и добавляют в каждую лунку 0,025 мл суспензии ЭБ, сенсибилизированных КА бензидин-бычий сывороточный альбумин, полученным известным химическим или предлагаемом методом. Пластины инкубируют при 37°С в течение двух часов. Оценку агглютинации проводят визуально по характеру осадка в лунках. Реакция считается положительной, когда наблюдают агглютинацию ЭБ при отсутствии агглютинации в контрольных лунках (без иммунной сыворотки).. Сравнительные иммунохимические характеристики КА представлены в таблице 1. В прямых РПГА титр антител к КА бензидин-бычий сывороточный альбумин, полученному химическим диазоспособом, составляет -log 21, синтезированному предлагаемьм методе -logj 24. Низкий уровень иммунного ответа на длительное кормление крыс бензидином удается выявить лишь с помощью ЭБ, сенсибилизированных КА, полученным предлагаемым способом, титр антител составляет logj 5.

9

Таким образом, при использовании предлагаемого способа получения конъюгированного антитела бенэидинантигенный носитель по сравнению с известным повышается качество реагента для иммунохимических исследований. В известном диазометоде исходный гаптен модифицируют при ковалентном связывании с белковьм антигенные носителем. В предлагаемом способе образуется смесь КА, о10916910

личающихся лишь положением присоединения бензидина к белку. Иммунохимические эксперименты показывают различие антигенных детерминант срав5 ниваемых конъюгированных антигенов, причем с помощью КА, полученного предлагаемым способом, определяют низкий уровень иммунного ответа - наличие антител к бензидину в

10 сыворотке крови животных, длительно получавших гаптен.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ, предусматривающий активацию бензидина и связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем при рН 7-8, отличающийся тем, что, с целью улучшения иммунохимических свойств получаемого продукта, активацию бензидина осуществляют окислением его пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода при массовом соотношении реагентов