СОСТАВ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ПЛАЗМЫ КРОВИ, СПОСОБ ПАСТЕРИЗАЦИИ ПЛАЗМЫ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ ПЛАЗМЫ В ТЕРАПИИ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/16 A01N1/02 

Изобретение относится к составу, позволяющему стабилизировать плазму крови в процессе пастеризации, к способу пастеризации плазмы крови и к использованию стабилизированной плазмы в терапии введения или для терапии замещения факторов коагуляции крови.

Цельная плазма человека или плазма, лишенная криопротеинов, используется в качестве "средства для терапии введения" для пациентов с сильными ожогами, серьезными травмами или подвергшихся серьезным хирургическим вмешательствам, т.е. во всех случаях, когда пациенты испытывают значительные потери жидкостей.

Обычно для этого типа терапии используют плазму, взятую у одиночных доноров, являющихся здоровыми и подвергнутых предварительному контролю, во избежание опасностей передачи вирусных заболеваний. Однако эта процедура не позволяет устранить все опасности заражения вирусами в предсерологической фазе, в частности, различными вирусами гепатита и СПИДа.

Поэтому по-прежнему остается важным продолжать разработку методов инактивации вирусов и стабилизирующих составов, которые сохраняют основные биологические функции плазмы.

Было продемонстрировано, что вирус гепатита B полностью инактивируется нагревом до 60^oC в течение 10 ч в присутствии цитрата натрия 0,5 моль/л (Tabor и др., Thrombosis Res.22: 1981, 233-238). Однако эта обработка приводит к потере биологической активности некоторых белков плазмы (Tabor и др. и Barrowcliffe и др. Fr.J.Haematology 55, 1983, 37-46).

Различные белки, представляющие терапевтический интерес, очищенные от плазмы крови, могут быть подвергнуты классической пастеризации при 60^oC в течение 10 ч в присутствии различных стабилизаторов. Отмечается, однако, что составы, которые стабилизируют один вид биологической активности, могут быть полностью неэффективными в отношении другого вида биологической активности.

Эти различные экспериментальные данные подвели к мысли, что инактивация вирусов в цельной плазме (свежая плазма или замороженная свежая плазма) или в плазме, лишенной криопротеинов, не может быть осуществлена пастеризацией.

Однако в связи с существованием необходимости для медицины цельной плазмы заявитель разработал составы, обеспечивающие одновременную защиту биологической активности всех имеющих ценность в терапии факторов плазмы и предотвращающие их денатурацию в процессе пастеризации.

Так, в заявке на патент во Франции 9008375 заявитель показал, что смесь сорбита, гепарина, лизина и CaCl₂ эффективно стабилизирует биологическую активность факторов плазмы в процессе пастеризации.

Однако присутствие гепарина в этой стабилизирующей смеси и, следовательно, в готовом препарате не позволяет инъецировать эту плазму пациентам, уже подвергшимся воздействию гепарина.

С целью получения более универсальной композиции заявитель разработал другой стабилизирующий состав, сохраняющий высокую степень эффективности стабилизации.

Отметив ранее, что сорбит обеспечивает некоторую защиту от термической денатурации, но с результатами, меняющимися от одного образца плазмы к другому, и с низкими выходами, заявитель разработал различные добавки, смесь которых с сорбитом повышает ее стабилизирующую активность, в частности, были получены хорошие результаты при добавлении количества сахарозы, близкого к 50% от количества сорбита.

С другой стороны, из-за нестабильности CaCl₂ в процессе нагрева в течение длительного времени пришлось заменить его глюконатом кальция, который хорошо выдерживает условия пастеризации.

Кроме того, добавление тринатрийцитрата улучшает защитный эффект смеси, при условии, если тщательно регулировать его концентрацию, так как, в частности, слишком малая доза позволяет плазме спонтанно коагулировать, а слишком большая доза замедляет последующую активность факторов коагуляции в ходе терапевтического использования плазмы.

И, наконец, к смеси добавляют по крайней мере две аминокислоты, предпочтительно лизин и аргинин.

Таким образом, стабилизирующий состав согласно изобретению состоит из смеси сорбита, сахарозы, глюконата кальция, тринатрийцитрата, лизина и аргинина. Нижеследующие концентрации различных добавок регулируют на 1 л подлежащей пастеризации исходной плазмы:
сорбит, от 800 до 1400 г и предпочтительно 1300 г,
сахароза, от 400 до 600 г и предпочтительно 1514 г,
глюконат кальция, от 3 до 5 ммоль и предпочтительно 4 ммоль,
тринатрийцитрат, от 8 до 25 ммоль и предпочтительно 15 ммоль,
лизин, от 1 до 10 г и предпочтительно 5 г,
аргинин, от 1 до 10 г и предпочтительно 5 г.

Состав согласно изобретению добавляют к свежей плазме или к свежей плазме после замораживания-размораживания, или к плазме, лишенной белков криоосадка, перед тем, как подвергнуть ее пастеризации путем нагрева до (60±1)^oC в жидком состоянии в течение 10 ч.

После пастеризации температуру постепенно снижают до 20^oC и раствор подвергают диализу в целях удаления сорбита и сахарозы. Буфер для диализа имеет pH 7,5 и содержит тринатрийцитрат 10 ммоль/л, глюконат кальция 4 ммоль/л, хлористый натрий 0,1 ммоль/л, лизин с концентрацией 10 г/л и аргинин в концентрации 3 г/л. При необходимости также могут быть использованы буферы для диализа иного состава. Раствор затем концентрируют для восстановления физиологической дозировки белков плазмы. Полученный раствор подвергают фильтрованию, вначале осветляющему, а затем стерилизующему, кондиционируют, затем замораживают или лиофилизуют.

Изобретение также относится к способу пастеризации плазмы, который включает в себя добавление состава согласно изобретению к плазме до ее нагрева и затем диализ пастеризованной плазмы с применением вышеуказанного буфера.

Этот способ особенно выгоден, так как он может быть применен для больших партий плазмы, полученных в результате нескольких независимых сборов. Так, пастеризация партий порядка 60 л или более позволяет, после проведения соответствующих операций контроля, гарантировать постоянство биохимического качества продукта.

Изобретение также относится к пастеризованным растворам плазмы, полученным с помощью способа согласно изобретению, причем указанные растворы содержат цельную плазму или плазму, лишенную некоторых белков, (таких как белки из криоосадка), и предназначены для терапевтического применения, либо для замены целью плазмы, либо для компенсирования нехватки конкретного фактора крови.

Состав и способ согласно изобретению также могут быть применены к плазме животного происхождения. Их целесообразно, например, применять для бычьей плодной сыворотки, используемой в качестве добавки для клеточных культур, в особенности предназначенных для приготовления терапевтических продуктов.

В нижеследующем примере описан вариант осуществления изобретения, не ограничивающий, однако, его объем.

Пример. К 60 л размороженной плазмы добавляют следующую смесь при слабом перемешивании (приводится количество на 1 л исходной плазмы):
Сорбит, г - 1300
Сахароза, г - 514
Глюконат кальция, ммоль - 4
Тринатрийцитрат, ммоль - 15
Лизин, г - 5
Аргинин, г - 5
Пастеризацию проводят в термостатированной ванне путем нагрева до 60^oC в течение 10 ч.

После пастеризации температуру постепенно снижают до 20^oC, затем раствор подвергают диализу для удаления сорбита и сахарозы.

Диализ проводят, например, на ультрафильтрационной системе на кассетах (Pellicon ).

Состав буфера для диализа следующий:
Тринатрийцитрат, ммоль/л - 10
Лизин, г/л - 10
Аргинин, г/л - 3
Глюконат кальция, ммоль/л - 4
Хлористый натрий, ммоль/л - 0,1
Удаление сорбита проверяют колориметрическим определением, а удаление сахарозы - ферментативным определением на готовом продукте.

В случае необходимости за диализом может следовать концентрирование на том же самом материале для доведения содержания факторов коагуляции до примерно 1 ед/мл, как в терапевтической плазме хорошего качества. Продукт подвергают диализу при осмолярности 370 мосмол/л и при pH 7-7,5.

Затем продукт стерилизуют фильтрацией, например, на фильтре Millipack 40 (Millipore ) с порами 0,22 мкм. Затем расфасовывают продукт в пластиковые мешки или во флаконы для замораживания или для лиофилизации.

Эффективность пастеризации на инактивацию вирусов оценивали по подборке вирусов, рекомендованной "группой экспертов в биотехнологии/фармацевтике европейских инстанций по использованию способов удаления и инактивации вирусов из биологических продуктов". Результаты представлены в табл.1.

Результаты контроля качества, проведенного на 6 последовательных опытных партиях, приведены в табл. 2, 3, 4.

Плазма, пастеризованная в присутствии приведенного стабилизирующего состава, соответствует нормам, предусмотренным для терапевтического применения.

Состав, предназначенный для стабилизации плазмы крови, в процессе пастеризации, состоящий из смеси сорбита, сахарозы, глюконата кальция, тринатрийцитрата лизира, аргинина, помогает пастеризовать очень большие объемы плазмы, порядка 60 л. Способ пастеризации плазмы предполагает использование стабилизирующего состава, обеспечивающего универсальность композиции. Полученная пастеризованная плазма предназначена для терапевтического применения. 3 с. и 7 з. п. ф-лы, 4 табл.

1. Состав для стабилизации плазмы крови в процессе пастеризации, состоящий из смеси сорбита, препарата кальция и лизина, отличающийся тем, что он дополнительно содержит сахарозу, тринатрийцитрат и аргинин при следующем соотношении компонентов на 1 л плазмы:
Сорбит, г - 800 - 1400
Сахароза, г - 400 - 600
Глюконат кальция, ммоль - 3 - 5
Тринатрийцитрат, ммоль - 8 - 25
Лизин, г - 1 - 10
Аргинин, г - 1 - 10
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что концентрация сорбита составляет 1300 г/л. 3. Состав по пп.1 и 2, отличающийся тем, что концентрация сахарозы составляет 514 г/л. 4. Состав по пп.1 - 3, отличающийся тем, что концентрация глюконата кальция составляет 4 ммоль/л. 5. Состав по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что концентрация тринатрийцитрата составляет 15 ммоль/л. 6. Состав по пп.1 - 5, отличающийся тем, что концентрация лизина и аргинина составляет 5 г/л. 7. Способ пастеризации плазмы крови, включающий добавление к плазме крови перед термообработкой стабилизирующего состава, нагревание и последующий диализ для удаления сахара против буферного раствора, содержащего тринатрийцитрат, хлористый натрий, лизин и препарат кальция, отличающийся тем, что добавляют стабилизирующий состав по пп.1 - 6, а диализ проводят против буферного раствора, содержащего дополнительно аргинин. 8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что буферный раствор для диализа содержит 10 ммоль/л тринатрийцитрата, 4 ммоль/л глюконата кальция, 0,1 моль/л хлористого натрия, 10 г/л лизина и 3 г/л аргинина. 9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что он применяется для объемов плазмы в пределах от 1 до нескольких сот литров. 10. Средство для терапии препаратом плазмы, отличающееся тем, что представляет собой плазму, полученную по пп. 7 - 9.