Изобретение относится к способу получения фактора X1 человеческой плазмы с очень высокой удельной активностью, предназначенного для терапевтического применения.
Фактор X1 или плазменный предшественник тромбопластина представляет собой гликопротеин, который, с одной стороны, составляет часть контактной фазы в механизме гомостаза за счет своего активирующего действия на фактор IX и, с другой стороны, составляет часть фибринолитической системы за счет своего активирующего действия на плазминоген.
Недостаточность фактора XI является наследственной и выражается в виде аутосомного рецессивного признака. Эта недостаточность является редкой, но она распространена у некоторых народностей Среднего Востока.
Как и для других факторов, недостаточность которых является редкой (фактор V, XIII, X), очищенные терапевтические продукты, полученные на основе человеческой плазмы, являются еще редкими или несуществующими, а единственная заместительная терапия осуществляется при помощи всей плазмы или всплывшей фракции криоосажденной плазмы, однако это приводит к одновременному введению бесполезных количеств других протеинов плазмы и, следовательно, к риску протекания различных вторичных существенных реакций после многократных инъекций.
Очистка фактора XI в опытном масштабе могла быть осуществлена лишь с трудом и при условии использования сильных ингибиторов, что указывает на то, что эта молекула является очень лабильной. Очистка была осуществлена в результате последовательности из 4 или 5 стадий и афинной хроматографии, либо исходя из плазмы (Bouma et Griffin, J Biol. chem. 1977, 252, 6432-6437), либо исходя из тромбоцитов (Schiffman et Yeh, Thromb, Res. 1990, 60, 87-97). Препарат бычьего фактора X1 высокой чистоты также очищался, исходя из 20 л плазмы методами осаждения и хроматографии, причем совокупность стадий была проверена примерно за 9 дн (Koide et al. Methods in Enzymology Blood clotting enzymes. 1975, pp 65-73). Единственный препарат с качеством, совместимым с терапевтическим применением, был описан (Winkelman at el. Internat. Congress ISBT-BBTS, London, 1988) в результате адсорбции на гепарин-сефарозе после извлечения факторов VIII и IX, однако его удельная активность не превышает 5 Ед/мг протеина, и он содержит большое количество остаточного AT III.
Таким образом, цель изобретения разработать новый способ очистки, приспособленный к очень большим объемам плазмы, который позволяет получать за небольшое число стадий, простых для промышленного осуществления, концентрат фактора XI с качеством, пригодным для терапевтического применения.
Следовательно, настоящее изобретение относится к концентрату человеческого фактора XI, получение которого включает только две стадии: первая представляет собой фильтрацию-адсорбцию, которая удерживает достаточно селективно фактор XI; после десорбции последнего он подвергается второй стадии, которая представляет собой хроматографию на катионообменной смоле.
Препарат фактора XI подвергается классической обработке для вирусной инактивации под действием растворителя-детергента перед хроматографической стадией, причем последняя позволяет полностью удалять остаточные продукты, оставшиеся после этой обеззараживающей стадии.
Способ по настоящему изобретению позволяет получать фактор XI для терапевтического применения, исходя из примерно 1 100 л плазмы, за достаточно короткое время (примерно 28 ч), которое включает 8 ч обработки для инактивации вирусов.
Способ очистки по настоящему изобретению применяется для всплывающей фракции криоосажденной плазмы и может быть приспособлен для объемов от 1 000 до 1 200 л.
Первая стадия очистки представляет собой фильтрации на батарее из 3 фильтрующих элементов с пористостью, заключенной между 0,5 и 2 мкм, которые в основном заряжены отрицательно (фильтры Зета плюс 
, поставленные фирмой Куно, Process Filtration Products, филиалом Commercial Intertech Corp. USA, которые описаны в патентах США N 4783262 и 4859340 и называются ниже "фильтры Куно"). Эти фильтры образованы очищенной целлюлозой, перлитами и небольшим количеством смолы, заряженной положительно. Могут также использоваться другие системы фильтров, имеющиеся в распоряжении торговли.
Фильтры промываются буферным цитрат-фосфатным раствором, содержащим цитрат натрия, двунатриевый фосфат, фосфат калия, хлорид натрия и двунатриевую Эдта, и доводятся до значения pH, заключенного между 5,5 и 6,5, а предпочтительно до значения pH 6. Эта стадия фильтрация удаляет большую часть плазменных протеинов.
Фактор XI, который остается адсорбированным на фильтрационных слоях вследствие их отрицательного заряда, десорбируется с них в результате увеличения ионной силы буферного раствора путем регулирования конечной концентрации хлорида натрия от 0,5 до 2 M. К последнему буферному раствору прибавляется еще небольшое количество антитромбина III (АТ III) от 0,1 до 0,2 Ед/мл, чтобы защитить фактор XI от действия протеаз.
Фракция после десорбции, диализа и концентрирования затем вводится в хроматографическую колонку с катионообменной смолой, в частности, с гелем сульфата сефарозы, приведенной в равновесие с буферным раствором, образованным цитратом натрия, хлоридом натрия, лизином и оргинином, при значении pH от 5,5 до 6,5, а предпочтительно при pH 6.
Эта колонка пропускает имеющиеся загрязняющие протеины и агенты для вирусной инактивации.
Гель сульфата сефарозы неожиданным образом имеет очень большую удерживающую способность по отношению к фактору XI (от 300 до 450 Ед/мл геля), что позволяет избежать последующей стадии ультрафильтрации, которая приводит к уменьшению выхода. Более того, связывание на сульфате сефарозы позволяет проводить элюирование при помощи практически физиологического буферного раствора, тогда как другие (описанные выше), которые основаны на сульфопропильных группировках, требуют более жестких условий элюирования.
После промывания колонки цитрат-фосфатным буферным раствором, содержащим цитрат натрия, двунатриевый фосфат, фосфат калия, хлорид натрия, лизин и аргинин, который имеет значение pH, заключенное между 6,1 и 6,9, а предпочтительно значение pH 6,5, фактор XI десорбируется в результате увеличения значения pH буферного раствора между 7 и 8, предпочтительно до 7,5, и концентрации хлорида натрия от 0,15 до 0,20 M, а предпочтительно до 0,17 M.
С момента своего элюирования фактор XI стабилизируется путем прибавления от 0,5 до 3 Ед/мл АТ III высокой чистоты и от 0,5 до 4 Ед/мл гепарина. Затем раствор стерилизуется путем фильтрации, доводится до кондиции и лиофилизируется.
Коэффициент очистки по настоящему способу превышает 10000 относительно исходной плазмы.
Фактор XI, полученный по способу в соответствии с настоящим изобретением, имеет удельную активность, равную по меньшей мере 100 Ед/мг протеинов.
Высокая чистота полученного фактора XI подтверждается методом электрофореза на геле полиакриламида-SDS, при помощи биохимических анализов, а его безвредность при помощи биологических тестов на животных.
Концентрат фактора XI, полученный по способу в соответствии с настоящим изобретением, является, таким образом, особенно хорошо приспособленным для терапевтического применения, в частности, в виде заместительной терапии в случаях врожденной или приобретенной недостаточности фактора XI.
Следующий пример иллюстрирует вариант осуществления по настоящему изобретению, не ограничивая однако его сферу действия.
Пример. Исходный материал.
Каждая партия фактора XI получается исходя из объема примерно 1000 литров всплывающей фракции криоосажденной человеческой плазмы.
Первая стадия очистки.
Всплывающая фракция криоосажденной плазмы пропускается через фильтрующие элементы "фильтров Куно", расположенных в батареи по три. Используют либо фильтры с размерами 0,5-1 мкм (типа 50 S), либо фильтры с размерами 1-2 мкм (типа 30 S).
После удаления фильтрата, который содержит большинство протеинов всплывающей фракции криоосажденной плазмы, фильтрующие элементы промываются цитрат-фосфатным буферным раствором, содержащим 5 мМ цитрата натрия, 5 мМ двунатриевого фосфата, 5 мМ фосфата калия, 0,065 М хлорида натрия и 0,5 мМ двунатриевой ЭДТА, и доводится до значения pH 6 при помощи лимонной кислоты.
Наблюдают относительно селективную адсорбцию фактора XI на фильтрационных слоях.
Фактор XI десорбируется с фильтров в результате увеличения ионной силы промывающего буферного раствора путем регулирования концентрации NaCl до значения 1 М. К нему прибавляют также 0,2 Ед/мл АТ III, чтобы защитить фактор XI от действия остаточных плазменных протеаз, ЭДТА буферного раствора также участвует в этом защитном действии.
Выделенный таким образом раствор фактора XI концентрируется в 30 раз и диализируется для удаления ЭДТА при помощи системы для ультрафильтрации Миллипор 
, образованной 10 кассетами с мембранами 10 K.
Буферный раствор для диализа состоит из 5 мМ цитрата натрия, 0,14 М хлорида натрия, 5,5 мМ L-лизина и 20 мМ L-аргинина и имеет pH 6.
Раствор после диализа пропускается через фильтр 0,45 мкм DSLK2NLP (PALL 
) для осветления раствора и удаления, в случае необходимости, бактериальных загрязнений.
Обработка для вирусной инактивации.
Раствор, содержащий фактор XI, подвергается обработке при помощи растворителя-детергента, известного своей эффективностью против вирусов с липидной оболочкой (Horowitz et al. Transfusion, 1985, 25, 516-522), и которая включает инкубацию в течение 8 ч при 25oC в присутствии 0,3% три-н-бутил-фосфата (ТнБФ) и 1% Твина 80.
Вторая стадия очистки.
Используют хроматографическую колонку с катионообменной смолой, в частности, с гелем "сульфата сефарозы со стабильным потоком" 
(поставленная фирмой Фармация, Уппсала, Швеция).
Колонка приводится в равновесие с буферным раствором для диализа, описанным выше.
Поместив протеиновый раствор в колонку, промывают последнюю при помощи 10-15 объемов буферного раствора для промывания, чтобы удалить слабо адсорбированные протеины и агенты для вирусной инактивации. Этот буферный раствор для промывания содержит 10 мМ цитрата натрия, 5 мМ двунатриевого фосфата, 5 мМ фосфата калия, 0,12 М хлорида натрия, 27 мМ лизина и 11,5 мМ аргинина с pH 6,5.
Линейная скорость потока буферного раствора для приведения в равновесие, промывания и элюирования составляет величину 50 см/ч.
Фактор XI элюируется из колонки в результате увеличения значения pH буферного раствора до величины 7,5 и увеличения концентрации NaCl до величины 0,17 М.
С начала его элюирования к фактору XI прибавляется 2 Ед/мл Ат III (т.е. примерно 1,5-2,5% от содержания фактора XI) и 5 Ед/мл гепарина (т.е. 1,5-2,5% от содержания фактора XI) для его стабилизации. (Оба продукта являются высокой частоты и с качеством, пригодным для инъекции человеку).
Полученный таким образом раствор фактора XI стерилизуется путем фильтрации на фильтре 0,22 мкм DSLK1NFZP (PALL
), распределяется (по 10 мл на пузырек) и лиофилизируется.
Биохимические и биологические анализы концентрата фактора XI.
Были проанализированы шесть последовательных партий.
Удельная активность фактора XI составляет 130-150 Ед/мг протеинов (т.е. Ф XI + АТ III). Перед прибавлением АТ III удельная активность составляет 210 Ед/мг.
Фактор XI, доведенный примерно до 100-120 Ед/мл перед лиофилизацией, имеет коагулирующую активность от 90 до 110 Ед/мл.
Таблицы показывают характеристики очищенного продукта.
Малое количество протеиновых загрязнений (за исключением специально добавленного АТ III) подтверждается методом иммунонефелометрии.
Электрофорез на геле полиакриламида-SDS показывает одну основную полосу при 160 KDа и одну небольшую полосу при 62 КДа, которая соответствует АТ III. После восстановления протеинов β -меркаптоэтанолом не детектируется никакая полоса в области 50-30 КDа, что доказывает, что молекулы фактора XI не были активированы в ходе процесса очистки (Bouma et Griffin, Blood coagulation, Ed. Hemker, 1986, p. 103-129).
Отсутствие остаточного загрязнения за счет факторов коагуляции и компонентов кининной системы тщательно контролируется в соответствии с классическими методами.
После воссоздания лиофилизированного продукта на животных были проведены классические тесты по определению допустимой для организма дозы:
тест тромбогеничности на кроликах,
тест гипотензии на крысах,
тест токсичности на мышах.
Тесты на кроликах показывают, что продукт не является тромбогенным, что DE50 (эффективная доза 50) превышает 1000 Ед ФXI/кг, тогда как тот же самый параметр составляет от 40 до 60 Ед/кг для концентрата PPSB, который, следовательно, является намного более тромбогенным и может эффективно вызывать явления тромбоза и внутрисосудистого свертывания крови, распространенного у людей при большой дозе.
Концентрат не вызывает явлений гипотензии, когда он вводится внутривенным путем крысам с дозой величиной 50 Ед ФXI/кг. Это модельное животное является очень чувствительным к присутствию плазменных компонентов с вазоактивными свойствами, что доказывает отсутствие этих компонентов в концентрате фактора XI, полученном по описанному способу.
Введенный внутривенным путем мышам с большой дозой (2500 Ед/кг) он не вызывает никакого летального исхода и никакого отклонения в поведении в течение периода в 7 дн.
Изобретение относится к области медицины, точнее к препарату человеческого фактора XI с высокой удельной активностью, полученного по способу, включающему стадию фильтрации-адсорбции и единственную стадию хроматографии на катионнообменной смоле. Полученный концентрат прекрасно используют для терапевтического применения при заместительной терапии в случаях недостаточности фактора XI. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.
| J | |||
| Biol | |||
| Chem | |||
| Шеститрубный элемент пароперегревателя в жаровых трубках | 1918 |
|
SU1977A1 |
