СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВОЗДЕЙСТВИЯ МАЛЫХ ДОЗ РАДИАЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологическим способам диагностики воздействия малых доз радиации, что дает возможность оценивать влияние неблагоприятных экологических воздействий окружающей среды.

Поскольку одним из сравнительно рано возникающих и тяжелых последствий воздействия ионизирующей радиации являются заболевания кроветворной и лимфатической тканей, большое внимание следует уделить правильной, своевременной и эффективной организации гематологического мониторинга за населением, проживающим на контролируемых территориях. Гематологический мониторинг должен включать в себя ежегодные осмотры населения с проведением комплекса клинико-морфологических исследований. Для получения достоверной информации относительно гематологического здоровья населения специалисты должны быть хорошо осведомлены о результатах радиационной экспертизы данной местности и осматриваемых лиц. Надо подчеркнуть, что особенную активность проблемы радиационных поражений, в частности проблема малых доз ионизирующей радиации, приобрела в последние годы в связи с тем что население страдает от превышения уровня промышленных отходов, результатов непродуманного вмешательства в природу и последствий ядерных испытаний, а на территории нашей страны в связи с аварией на ЧАЭС.

Некоторые ориентировочные признаки, которые могут помочь врачу при формировании группы риска возникновения заболевания системы крови и решения вопроса о направлении на консультацию к гематологу, можно сгруппировать следующим образом: жалобы больного общая слабость, лихорадка, снижение апетита, сердцебиение, одышка, головокружение, головные боли, боли различных локализаций, анамнестические указания на кровоточивость из слизистых оболочек, кровоизлияния в кожу; объективные показатели гемоглобин менее 120 г/л: эритроцитов менее 3,8•10¹²/л; лейкоцитов менее 4,0•10¹²/л или более 9,0•10¹²/л; тромбоцитов менее 10¹²/л; СОЭ больше 15 мм/ч; сдвиг лейкоцитарной формулы влево (палочкоядерных нейтрофилов больше 10% появление других молодых форм клеток); лимфоцитов более 40% или менее 20% увеличение размеров лимфатических узлов; увеличение размеров селезенки; увеличение размеров печени; геморрагические проявления; тахикардия и систолический шум, сочетающиеся с бледностью кожных покровов и слизистых оболочек. Наличие перечисленных признаков или части из них дает врачу основание заподозрить заболевание системы крови и направить больного к гематологу [1]
В последние годы все большую актуальность приобретает поиск биологических средств оценки эффектов воздействия в диапазоне малых доз и малых мощностей дозы как в ранние, так и в отдаленные сроки после радиационных воздействий. Принято относить к понятию "малые дозы" уровни радиационного воздействия, не вызывающие определяемых клинико-гематологических изменений (диапазон 0-1 Гр) [2]
Первая обобщенная классификация лабораторных методов индикации лучевых поражений предложена В.К.Мазуриком в 1980 г. Выделено пять групп показателей
цитогенетические (хромосомный анализ), гематологические (изменение количества, морфологии и соотношения форменных элементов периферической крови), биофизические (пострадиационные изменения физических свойств биологических молекул и надмолекулярных комплексов), биохимические (изменение химических свойств крови и мочи), иммунобактериологические (изменение иммунной реактивности организма и состава микробной флоры покровной ткани кишечника).

Первая группа классификации включает в себя методы, основанные на радиационно-химических реакциях в биомолекулах, приводящих, в частности, к образованию длительно живущих радикалов. Практическое значение имеет определение радикалов методом ЭПР в твердых тканях. Обнаружена линейная дозовая зависимость в широком диапазоне при исследовании ЭПР-спектров тканей животных и человека. Сделан вывод о том, что ЭПР-спектроскопия позволяет определять дозы облучения в биологических материалах, являясь таким образом "биологическим дозиметром". Следует также отметить, что ЭПР-спектроскопия - поздний метод диагностики и применима, следовательно, для реконструкции дозиметрической ситуации по прошествии некоторого периода времени после радиационной аварии. Хотя метод позволяет проводить биоиндикацию в диапазоне "малых" доз, но для диагностики воздействия облучения на организм человека он неприменим, так как позволяет анализировать изменения на молекулярном уровне, не давая возможности экстраполировать зарегистрированные изменения на весь организм, что необходимо для диагностики любых поражений. К недостаткам метода для применения в широкой клинической практике относятся также трудоемкость и длительность используемой методики [3]
Вторая группа включает показатели, основанные на определении повреждений генома. Исходя из специфичности возникновения одиночных и двойных разрывов в ДНК и их линейной зависимости от дозы облучения представляется, что данные типы повреждений могли бы лежать в основе создания индикатора облученности, если использовать для исследования доступный материал, в частности, клетки периферической крови. Рядом авторов сделаны попытки применить определение разрывов ДНК для целей диагностики лучевых поражений. Однако существенное препятствие для практического использования данного показателя быстрая и эффективная репарация радиационных повреждений ДНК уже в течение 1-го часа после облучения, что существенно затрудняет применение данного метода в клинической диагностики радиационных повреждений [4]
К третьей группе биологических индикаторов могут быть отнесены нарушения генома, регистрируемые с помощью цитогенетических и цитологических методов. Определение частоты аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови свыше 20 лет используется в качестве биологического дозиметра при аварийных ситуациях и других случаях переоблучения людей. Из всех видов аберраций хромосом для целей диагностики радиационных поражений чаще всего используется подсчет дицентриков, ацентрических фрагментов и центрических колец. Разработанные авторами методические подходы и уравнения регрессии были использованы для оценки доз у лиц, пострадавших при аварии на ЧАЭС. Использование подсчета аберраций хромосом наряду с гематологическими показателями (прежде всего падением числа лимфоцитов) было решающим для определения уровня поглощенной дозы. Однако метод биодозиметрии с помощью аберраций хромосом имеет ряд ограничений, связанных с трудностью процедуры, требующей высокой квалификации персонала. Весьма успешным для биологической индикации лучевых воздействий, равно как и для мониторинга любых других генотоксических факторов, оказалось использование определения частоты клеток с микроядрами и числа микроядер на клетку в ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов и полихроматофильных эритроцитах костного мозга. Однако дозовые кривые, свидетельствующие о том, что индикация указанным методом может осуществляться в диапазоне доз более 1 Гр, различаются в значительной степени в зависимости от лаборатории, где они были получены. Следовательно, однозначной оценке микроядерного теста существенно препятствуют весьма значительные колебания фоновых значений показателя у человека за счет индивидуальных различий [5]
Четвертая группа биоиндикаторов лучевого поражения связана с воздействием на структуру клеточных мембран. Один из подходов для выявления индуцированных радиацией мембранных повреждений метод седиментации эритроцитов в градиенте плотности. Эритроциты проникают в урографин после повреждения их мембран, но при сохранении клеточной целостности. Однако прямым методом не удавалось выявить зависящего от дозы увеличения ни количества клеток в осадке, ни количества распавшихся мембран. При внесении изменения в методику, заключающегося в обработке клеток поверхностно-активными веществами, указанный метод позволяет регистрировать дозозависимые изменения, однако только в области доз 2-5 Гр, которые вызывают лучевую болезнь средней степени тяжести. Таким образом, метод седиментации не может являться методом индикации лучевых поражений в области малых доз [6]
К пятой группе индикаторов можно отнести показатели, основанные на репродуктивной клеточной гибели, прежде всего гематологические показатели, сдвиги которых в периферической крови отражают дозозависимое опустошение костного мозга. Для исследования костного мозга производят пункцию грудины или подвздошной кости с последующим цитологическим анализом мазков пунктата, а также трепанобиопсию подвздошной кости с последующим гистологическим исследованием срезов костного мозга [7] Пункцию грудины или подвздошной кости проводят в процедурном кабинете с соблюдением правил асептики.

Ход определения: пунктат костного мозга разводят в 200 раз, для чего в пробирку с 4 мл слабого раствора уксусной кислоты вносят пипеткой 0,02 мл пунктата (в таком виде пробирка должна быть для дальнейшего исследования доставлена в лабораторию). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и заполняют счетную камеру Горяева. После оседания форменных элементов (через 1-2 мин) подсчитывают миелокариоциты, т.е. все ядерные элементы в 100 больших квадратах. Рассчитывают количество миелокардиоцитов на 1 мкл пунктата по следующей формуле:

где n количество миелокариоцитов в 100 больших квадратах, 200 - разведение, 250 множитель для приведения к 1 мкл, так как объем большого квадрата равен 1/250 мкл. Нормальная величина: 41600-195000 в большой степени зависит от разведения пунктата кровью.

Метод гистологической обработки трепатана: трепанат фиксируют в ценкерформоле (9 частей жидкости Ценкера и 1 часть 40% формалина) в течение 10-16 ч. Промывают водопроводной водой. Помещают в смесь, состоящую из равных частей 85% муравьиной кислоты и 20% цитрата натрия на 18-20 ч. Помещают в 5%-ный раствор алюмокалиевых квасцов на 3-4 ч. Проводят через спирты: 70% 24 ч, 96% 1-2 сут. Погружают в жидкий целлоидин с гвоздичным маслом на 2-3 сут. Помещают в хлороформ на 2-3 ч, а затем в хлороформ с парафином при 37^oC, на 18 ч. Парафин I, парафин II 1-2 ч, парафин III 1,5-1 ч, заливают в парафин. Готовят среды и окрашивают их азур II-эозином. Для выявления ретикулиновых волокон проводят импрегнацию серебром по Гомори. Пострадавших от радиации людей по степени тяжести костномозгового синдрома можно разделить на 5 групп: легкой степени (1-2 Гр), средней (2-4 Гр), тяжелой (4-6 Гр), крайне тяжелой (6 Гр и более) и группу лиц, получивших дозу облучения менее 1 Гр. Однако, так как методы анализа костномозгового кроветворения очень травматичны, трудоемки и длительны, то эта группа индикаторов не может использоваться для гематологического скрининга.

Этот метод был взят за прототип, так как позволяет выделить группу лиц, получивших дозу облучения менее 1 Гр.

Целью изобретения является снижение травматичности и ускорение диагностики воздействия малых доз радиации на организм человека.

Цель достигается тем, что неокрашенный мазок крови, взятой из пальца, фиксируют 96% -ным спиртом, заключают в канадский бальзам и микроденситометрируют эритроциты на системе анализа изображений. Результатом микроденситометрии является функции профиля эритроцита, представляющая собой зависимость оптической плотности эритроцита D от расстояния от его края r (фиг.1). Рассчитываются показатели этой функции: показатели кривизны [8] Curl средняя кривизна восходящей части тора эритроцита, Cur2 средняя кривизна нисходящей части тора эритроцита, Cur3 средняя кривизна пэллора эритроцита, а также предложенный нами параметр: Dx показатель формы эритроцита:


Для комплексной оценки этих 4-х показателей рассчитывается параметр FI:
FI=54.06•Cur1-40.09•Cur2+31.74•Cur3+3.27•D_x+2.81.

Формула для расчета параметра FI получена применением линейного дискриминантного анализа [9] при помощи стандартного пакета статистических программ. При отрицательном значении этого показателя диагностируют воздействие малых доз радиации.

Подобную связь между численными значениями установили при обследовании группы из 28 детей в возрасте от 7 до 14 лет, из них 18 норма, 10 дети, подвергшиеся воздействию малых доз радиации в Красногорском районе Брянской области [10] В результате проведенного анализа выявили наиболее значимые показатели кривизны мембраны эритроцита, рассчитали производный параметр FI для оценки воздействия малых доз радиации для детей в возрасте от 7 до 14 лет.

Пример 1. Больной А, подвергшийся воздействию малых доз радиации (<1 Гр) в Красногорском районе Брянской области. В марте 1993 г. при обследовании у больного А из крови, взятой из пальца, был сделан мазок. Затем мазок зафиксировали 96% -ным спиртом. После этого мазок заключили в канадский бальзам, после чего эритроциты микроденситометрировали, в результате чего получили среднюю функцию профиля эритроцита, изображенную на фиг.2.

Затем на основании функции профиля были рассчитаны параметры:
Cur1=0.127
Cur2-0.178
Cur3=0.162
D_x=0.248
Далее для комплексной оценки этих параметров был рассчитан параметр FI= -4.31.

Примеры 2 и 3. Больные Б и В аналогичны примеру 1.

Примеры 4-6. Больные Г,Д,Е аналогичны примеру 1, отличаются тем, что больные подверглись воздействию малых доз ионизирующей радиации в Суражском районе Брянской области.

Примеры 7-9. Больные Ж,З,И аналогичны примеру 1, отличаются тем, что больные были подвергнуты облучению во время лечения лимфогранулематоза.

Больной Ж получил суммарную дозу облучения: в августе 1994 г. на шею при облучении шейно-надключичных л/у 25 Гр, в ноябре 1994 г. на очаг в доле правого легкого 30,4 Гр.

Больной 3 получил суммарную дозу облучения: в октябре 1986 г. на шейно-ключичные л/у 40 Гр, в октябре 1986 г. на подмышечные л/у 40 Гр, в декабре 1986 г. на селезенку 46 Гр, в декабре 1986 г. на средостенные л/у - 35 Гр.

Больной И получил суммарную дозу облучения: в марте 1987 г. на шейно-ключичные л/у 40 Гр, в марте 1987 г. на рубец до 46 Гр, в марте 1987 г. на подмышечные л/у 40 Гр, в мае 1987 г. на средостенные л/у 46 Гр, в ноябре 1987 г. на селезенку 45 Гр, в ноябре 1987 г. на параортальные л/у - 36 Гр.

Примеры 10-12. Пациенты К,Л,М аналогичны примеру 1, отличаются тем, что пациенты не были подвергнуты облучению (норма).

Результаты анализа приведенных примеров сведены в таблице.

Таким образом, как видно из приведенных примеров, предложенный способ диагностики позволяет регистрировать воздействие облучения на организм человека как в области высоких доз, так и благодаря высокой чувствительности в области малых доз радиации. Время анализа занимает 20-30 мин, что значительно меньше по сравнению с прототипом (6 суток).

Источники информации:
1.Абдулкадыров К.М. Самускевич И.Г. Организация гематологического мониторинга за населением, проживающим в районах жесткого радиационного контроля//Клиническая лабораторная диагностика, 1993, N5.

2. Комар В.Е. Индикация радиационных поражений// Радиобиология, 1992, т. 32, вып.1, c.84-97.

3. Biololpgical Indicators for Radiation Dose Assessments. MMV/Eds.A. Kaul, L. Dehos, W. Bogl et al. Munchen: Medizin Verlag, 1986, bga Schriften 2/86.376 S.

4.Боровков Т.В. и др.//Радиобиология, 1984, т.24, вып.1, c.69-71.

5.Пяткин Е.К. и др.//Мед. радиология, 1989, N6, c.52-57.

6. Михайлов В. Ф. Потемкин Л.А. //Радиобиология, 1985, т.25, вып.6, c. 54-55.

7. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник /Под ред. В.В. Меньшикова. М.Медицина, 1987, 386с.

8.Математический словарь высшей школы: Общ. часть /В.Т.Воднев, А.Ф.Наумович, Н.Ф.Наумович; под ред. Ю.С.Богданова. 2-е изд. -М.Изд-во МПИ, 1988.-527 с. ил.

9. Афифи А. Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ. Пер. с англ. -М. Мир, 1982.-488 с.

10. Буянкин В.М. Изменение пула периферических лимфоцитов у детей, проживающих на радиационно-загрязненных территориях: Автореф. дисс. канд. мед. наук. -М. 1994.-26 с.

Использование: в медицине, а именно диагностика воздействия малых доз радиации. Сущность изобретения: у больного берут мазок крови из пальца, фиксируют 96%-ным спиртом, заключают в канадский бальзам, микроденситометрируют эритроциты и на основании полученной зависимости оптической плотности эритроцита D от расстояния от его края r рассчитывают параметры: Cur1 - средняя кривизна восходящей части тора эритроцита, Cur2 - средняя кривизна нисходящей части тора эритроцита, Cur3 - средняя кривизна пэллора эритроцита, а также показатель формы эритроцита по формуле где r_min и r_max - абсциссы минимума и максимума соответственно, после чего рассчитывают параметр: FI = 54,06•Cur1-40,09•Cur2+31,74•Cur3+3,27•D_x+2,81 и при отрицательном значении этого параметра диагностируют воздействие малых доз ионизирующей радиации. Способ позволяет диагностировать воздействие облучения на организм человека как в области высоких доз, так и в области малых доз радиации благодаря высокой чувствительности, значительно сокращает время проведения анализа. 1 табл., 2 ил.

Способ диагностики воздействия малых доз радиации на организм человека путем цитологического анализа взятого у больного биологического материала, отличающийся тем, что в качестве биологического материала берут мазок крови, взятый из пальца, фиксируют 96%-ным спиртом, заключают в канадский бальзам, микроденситометрируют эритроциты и на основании полученной зависимости оптической плотности D эритроцита от расстояния r от его края рассчитывают параметры Cur1 среднюю кривизну восходящей части тора эритроцита, Cur2 - среднюю кривизну нисходящей части тора эритроцита, Cur3 среднюю кривизну пэллора эритроцита, а также показатель формы эритроцита по формуле D_x r_max/(r_min r_max), где r_m i n и r_m a x абсциссы минимума и максимума соответственно, после чего рассчитывают параметр
FI 54,06•Cur1-40,09 • Cur2+31,74•Cur3+3,27•Dx+2,81
и при отрицательном значении этого параметра диагностируют воздействие малых доз ионизирующей радиации.