СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И РАКА ЭНДОМЕТРИЯ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемый способ относится к области медицины и может быть использован для дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия.

К гиперпластическим процессам эндометрия согласно гистологической классификации ВОЗ 1980 года относятся фоновые процессы гиперплазии (железистая, железисто-кистозная, железистый полип) и предраковые состояния - атипическая железистая гиперплазия и железистый полип с явлениями пролиферации и атипии; к раку эндометрия - аденокарциномы разной степени зрелости. Дифференциальная диагностика фоновых и предраковых процессов от рака слизистой матки имеет исключительно важное практическое значение, так как на основе ее проводят выбор адекватного метода лечения (1,2). Так, для железистого полипа эндометрия вполне приемлемы методы удаления полипа под контролем гистероскопа и последующего гормонального лечения; при наличии железистого полипа с явлениями пролиферации и атипии прибегают в зависимости от возраста пациентки либо к длительной гормональной терапии, либо к оперативному лечению. Установлено, что в 72% случаев раку эндометрия предшествует железистая или атипическая гиперплазия, а интервал между развитием гиперплазии и рака эндометрия или полипов и рака эндометрия составляет соответственно 8, 4 и 4, 6 лет. Сложность диагностики гиперпластических (ГПЭ) и раковых процессов (АЦ) эндометрия заключается в схожести клинической картины, то есть основного симптома заболевания - маточного кровотечения. Существующие клинические методы диагностики (ультразвуковое исследование, радиометрия, гистеросальпингография, изучение гормонального статуса, определение рецепторов стероидных гормонов в ткани эндометрия, иммунологические методы, гистерокопия, выскабливание слизистой матки, зондирование матки) не могут полностью удовлетворить клиницистов ввиду недостаточной информативности, отсутствия возможности отразить нозологическую специфичность патологического процесса, длительны и трудоемки в исполнении и почти все являются инвазивными методами (2).

Основным диагностическим методом в распознавании внутриматочной патологии в настоящее время является гистологическое исследование соскобов слизистой матки, полученных при диагностическом выскабливани (3). Однако при этом непременным условием является придельная биопсия и удаление всей слизистой матки. Оставление измененных участков эндометрия в последующем может приводить к необоснованному диагнозу рецидива заболевания. К тому же морфологическое строение опухоли не всегда полностью соответствует биологическому течению опухолевого процесса, не позволяет оценить структурные и функциональные изменения хроматина ядра, являющиеся ключевым звеном как в процессах онтогенеза и клеточной адаптации, так и на ранних этапах патогенеза многих заболеваний, в том числе злокачественных опухолей (4). Наиболее распространенным во всем мире скрининг-методом диагностики рака эндометрия является цитологический метод исследования, точность диагностики которого достигает 60 - 84% (2,5).

При цитологическом исследовании (световой микроскопии) анализ проводится визуально и результатом является качественное описание морфологии, что не позволяет объективизировать и количественно оценить полученные результаты, интерпретация цитологических исследований может быть затруднена из-за плохого качества препаратов, а также факторов, которые могут вызвать изменения в эндометрии, особенно воспаление.

Электронно-микроскопическое исследование позволяет получить общие представления о распределении хроматина в ядре клетки, но методика не дает возможности оценить функциональное состояние генома, достаточно трудоемка, особенно в подготовке материала для исследования (4).

Цитохимические и иммунохимические исследования эндометриального материала, могут быть использованы в качестве вспомогательных тестов для формирования групп риска рака эндометрия, так как большинство из них с высокой частотой выявляются как при раке, так и при гиперплазии эндометрия.

В настоящее время в онкоморфологии применяются цитогенетические методы, позволяющие понять сущность наследственных изменений в клетках при развитии опухоли и ее прогрессии. Поскольку ядро является носителем наследственной информации, а структурное состояние хромосом в интерфазных ядрах соответствует активности генов, то по состоянию гетерохроматина можно судить о функционировании генома (6).

На основе сканирующей цитоспектрофотометрии клеточных ядер с последующей математической обработкой сканограмм при помощи различных статистических показателей (7) выявлено объективное увеличение гетерогенности структуры хроматина интерфазных ядер при атипической гиперплазии и раке эндометрия по сравнению с таковыми при железистой гиперплазии и неизмененном эндометрии.

Морфометрическое и светооптическое исследование ядер эпителия эндометрия при предопухолевых поражениях и раке эндометрия в цитоморфологической диагностике поражений эндометрия были предприняты В.Н. Новиком и соавт. (1990). Изучены мазки материала, полученные из полости матки 57 женщин с помощью шприца Брауна (аспираты). Цитологические препараты, фиксированные 96-градусным спиртом и окрашенные гематоксилин-эозином, обесцвечивали и переокрашивали по Фельгену с использованием холодного гидролиза в 5 н. HCl. Исследовались морфометрические параметры ядер клеток эпителия эндометрия (площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметр), а также средняя оптическая плотность, дисперсия и интегральная оптическая плотность. Биометрические данные подтверждали цитоморфологическую диагностику и в 85,7% случаев способствовали разделению клеток нормального и гиперплазированного эпителия от клеток предрака и высокодифференцированного рака (8).

Этот метод можно рассматривать в качестве прототипа, поскольку он является наиболее информативным для дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия. Однако, в отличие от предлагаемого в данной заявке способа, в способе-прототипе в качестве объекта были использованы аспираты из полости матки, что предполагает получение менее богатого и качественного клеточного материала для исследования, менее щадящий способ забора, приготовления и фиксации препаратов, что может оказывать повреждающее влияние на структурные элементы ядра. Как свидетельствуют полученные результаты, в предлагаемом способе (по сравнению с прототипом) использован краситель, являющийся более чувствительным и специфичным для выявления структурных изменений интерфазного хроматина ядра клетки.

Целью настоящего изобретения является разработка способа, более чувствительного и специфичного для дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия.

Способ осуществляется следующим образом:
Соскоб эндометрия, полученный при диагностическом выскабливании слизистой матки, отмывают от эритроцитов раствором Хенкса и делают отпечатки на предметном стекле. Затем отпечаток фиксируют смесью Никифорова (этанол и эфир в соотношении 1:1) в течение 20 минут, высушивают на воздухе. Проводят рибонуклеазную обработку, рибонуклеаза (Reanal, ВНР) разводится в осмолярном растворе сахарозы в концентрации 200 ME/100 мл. Обработка длится 60 минут при температуре 37^oC, после чего отпечаток промывают в 3-х сменах дистиллированной воды. Окраску производят в растворе галлоцианин-хромовых квасцов (ГХК), приготовленном по стандартной методике (9) в течение 3-х часов при 37^oC. Препарат промывают 5 мин отстоявшейся водопроводной водой. Процесс окрашивания занимает в среднем 5 часов.

После окраски препарат заключается в канадский бальзам и проводится микроденситометрическое исследование на системе анализа изображений. Результатом микроденситометрии являются оптические, топологические и геометрические характеристики интерфазного хроматина по компонентам (эухроматин и гетерохроматин) и ядра в целом.

Процедура исследования одного отпечатка занимает 30 - 40 минут.

Предварительно на обучающих выборках для различных групп гиперпластических процессов (74 больных) и рака эндометрия (12 больных) были установлены наиболее информативные общепринятые показатели структуры интерфазного хроматина:
CompIOD1 - интегральная оптическая плотность гетерохроматина;
CStdOD2 - средне-квадратичное отклонение оптической плотности гетерохроматина;
IOD - интегральная оптическая плотность хроматина ядра;
PERIMETR - периметр ядра.

Для комплексной оценки этих показателей рассчитывается параметр DF для каждой группы
DF = 0,00013•CompIOD1 + 3,98725•CStdOD2 + 0,00001•IOD + 0,01213•PERIMETR-13,4409.

Формула для расчета параметров DF получена, применением линейного дискриминантного анализа (10) при помощи стандартного пакета статистических программ. При положительном значении показателя DF диагностировали рак эндометрия (АЦ), при отрицательном - гиперпластические процессы эндoмeтpия (ГПЭ) - железистую гиперплазию эндометрия (ЖГЭ), полипы эндометрия (ПЭ), атрофию эндометрия (АЭ).

Подобную связь между численными значениями установили при обследовании групп больных пре- и постменопаузального периода, находящихся на обследовании и лечении в гинекологическом отделении 31 ГКБ г. Москвы с подозрением на патологию эндометрия. В результате проведенного анализа выявили наиболее значимые показатели структуры интерфазного хроматина железистых клеток эндометрия, рассчитали производный параметр DF для выявления вида патологии эндометрия.

Предлагаемый способ демонстрируют следующие клинические примеры:
Пример 1.

Больная М., 54 года N истории болезни - 940, 31 ГКБ.

Поступила в клинику с жалобами на кровяные выделения в постменопаузе (ПМП) впервые, ПМП-5 лет.

Клинический диагноз: Железисто-фиброзный полип эндометрия. Во время обследования и лечения в клинике предлагаемым способом был исследован хроматин интерфазных ядер железистых клеток эндометрия, полученных при диагностическом выскабливании слизистой матки. Исследуемая ткань эндометрия была отмыта от эритроцитов в растворе Хенкса и сделаны отпечатки на предметном стекле. Полученный отпечаток высушивали на воздухе, фиксировали смесью Никифорова. Далее для устранения влияния рибонуклеиновой кислоты на результаты сканирования проводили рибонуклеазную обработку. Рибонуклеазу разводили в осмолярном растворе сахарозы в концентрации 2000 Е на 100 мл раствора. Препараты обрабатывали в этом растворе в течение 1 часа при 37^oC, после этого их промывали в 3-х сменах дистиллированной воды. Затем проводили окрашивание препаратов в растворе ГХК. Раствор ГХК готовился по стандартной методике (9). Окрашивание проводили в течение 3 часов в термостате при 37^oC, после чего препараты промывали 5 мин отстоявшейся водопроводной водой.

Окрашенные препараты заключали в канадский бальзам, после высушивания исследовали на системе анализа изображений.

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
CompIOD1 - 4932,3; CStdOD2 - 0,9779;IOD - 129710;
PERIMETR - 469,76
Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = - 1,90529.

Значение показателя DF < 0, следовательно, у больной выявлены изменения структуры интерфазного хроматина, соответствующие доброкачественным процессам (ПЭ) эндометрия, что полностью совпадает с данными клинических и лабораторных исследований.

Пример 2.

Больная Г., 61 год, N истории болезни - 1843, 31 ГКБ.

Поступила в гинекологическое отделение 31 ГКБ с жалобами на мажущие кровяные выделения из половых путей.

Клинический диагноз: Полип эндометрия?
С помощью предлагаемого способа исследуется структура хроматина железистых клеток эндометрия больной (см. Пример 1). Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
CompIOD1 - 4020,12; CStdOD2 - 0,698019; IOD - 108930; PERIMETR - 528,769
Для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = - 2,63184.

Значение показателя DF < 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при доброкачественных процессах (ПЭ) эндометрия.

Пример 3.

Больная С., 51 год, N истории болезни - 2640, 31 ГКБ. Поступила в стационар с жалобами на нарушения менструальной функции (нерегулярные менструации с задержками до 2 месяцев).

В анамнезе - дважды производилось диагностическое выскабливание матки по поводу кровотечения, ранее диагностированы полип и железистая гиперплазия эндометрия.

Наряду с клиническим обследованием при диагностическом выскабливании произведены отпечатки и изучены изменения структуры интерфазного хроматина железистых клеток эндометрия (см. Пример 1).

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
CompIOD1 - 7228,66; CStdOD2 - 0,870088; IOD - 115035; PERIMETR - 493,088
Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = -1,90041.

Значение показателя DF < 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при доброкачественных процессах (ЖГЭ) эндометрия, что подтверждено клинико-лабораторными исследованиями.

Пример 4.

Больная К., 47 лет, N истории болезни - 2823, 31 ГКБ.

Поступила с жалобами на обильное кровотечение из половых путей впервые.

Клинический диагноз: Дисфункциональное маточное кровотечение пременопаузального периода, аденомиоз.

Использование предлагаемого способа определило следующие показатели структуры хроматина железистых клеток эндометрия (см. Пример 1):
CompIOD1 - 11069,9; CStdOD2 - 0,823681; IOD - 149059; PERIMETR - 565,161
Рассчитанный показатель DF был равен - 0,3716.

Значение показателя DF < 0, следовательно, обнаруженные изменения структуры интерфазного хроматина характерны для доброкачественных процессов (ЖГЭ) эндометрия, что подтверждено гистологическим исследованием слизистой матки.

Пример 5.

Больная Ф., 64 лет, N истории болезни - 6274, 31 ГКБ.

Жалоб при поступлении нет. Постменопауза, 10 лет. Наследственность отягощена: у бабушки и матери - рак матки. Из анамнеза: дважды проводилось выскабливание слизистой матки и удаление полипов эндометрия. В стационаре исследование выявило утолщение эндометрия. Произведены гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание слизистой матки, при этом обнаружены тонкий эндометрий и слизь. Гистологически: мелкие обрывки гипопластического эндометрия.

С помощью предложенного способа исследовалась структура хроматина железистых клеток эндометрия (см. Пример 1).

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
СоmpIOD1 - 5154,77; CStdOD2 - 0,847275; IOD - 102923; PERIMETR - 574,834
Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = -1,39052.

Значение показателя DF < 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при доброкачественных изменениях (АЭ) слизистой матки.

Пример 6.

Больная Д., 51 год, N истории болезни - 6888, 31 ГКБ.

Поступила с жалобами на кровотечение из половых путей на фоне 2 лет постменопаузы.

Клинический диагноз: Дисфункциональное маточное кровотечение постменопаузального периода.

В анамнезе - производилось диагностическое выскабливание матки по поводу кровотечения.

Наряду с клиническим обследованием при диагностическом выскабливании произведены отпечатки и изучены изменения структуры интерфазного хроматина железистых клеток эндометрия (см. Пример 1):
СоmрIOD1 - 5202,47; CStdOD2 - 0,542494; IOD - 113359; PERIMETR - 459,794
Рассчитанный показатель DF был равен - 3,89064.

Значение показателя DF < 0, следовательно, обнаруженные изменения структуры интерфазного хроматина характерны для доброкачественных процессов эндометрия.

Клинико-лабораторное исследование подтвердило наличие у больной кровотечения на фоне атрофии эндометрия.

Пример 7.

Больная Г., 69 лет, N истории болезни - 3942, 31 ГКБ.

Поступила с жалобами на кровяные выделения из половых пути на фоне 19 лет менопаузы.

Из анамнеза - с 1988 г. после двусторонней мастэктомии получала лучевую терапию и длительно тамоксифен. Дважды производилось диагностическое выскабливание слизистой матки по поводу маточных кровотечений.

Диагноз при поступлении: Полип эндометрия, миома матки.

В стационаре произведена гистероскопия и диагностическое выскабливание, при которых обнаружен полип эндометрия.

С помощью предложенного способа исследовалась структура хроматина железистых клеток эндометрия (см. Пример 1).

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
CompIOD1-17148,5; CStdOD2 - 1,04596; IOD - 160650;
PERIMETR - 574,917
Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = 1,53916.

Значение показателя DF > 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при раке эндометрия.

При гистологическом исследовании удаленного полипа обнаружены участки малигнизации по типу высокодифференцированной аденокарциномы. Больной произведено оперативное лечение.

Пример 8.

Больная Г., 54 года, N истории болезни - 5582, 31 ГКБ.

Поступила в стационар с жалобами на кровяные выделения из половых путей, пременопауза 6 месяцев.

С помощью предлагаемого способа проведено исследование структуры интерфазного хроматина железистых клеток эндометрия (см. Пример 1).

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
CompIOD1 - 14652,5; CStdOD2 - 0,918475: IOD - 177132; PERIMETR - 6 06,035
Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = 1,24863
Значение DF > 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при раке эндометрия.

Клинически при гистероскопии и диагностическом выскабливании обнаружена железистая ткань, распадающаяся под током вводимой в полость матки жидкости. Гистологическое исследование обнаружило высокодифференцированную аденокарциному эндометрия.

Таким образом, клиническое обследование больной подтвердило наличие у больной рака эндометрия.

Совпадение результатов проведенных тестов с помощью предложенного способа и клинико-лабораторных исследований свидетельствует о специфичности способа диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия.

Таким образом, по сравнению с прототипом предложенный способ диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия позволяет:
1. значительно ускорить диагностическую процедуру;
2. использовать способ широко в практической медицине при обследовании больших групп населения, обеспечивая хорошую воспроизводимость результатов цитодиагностического анализа, за счет улучшения качества препарата;
3. повысить точность диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия.

Литература
1. Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии.- Медицина, Ленинград.-1989. с. 68-75, 275-336.

2. Бреусенко В.Г. Патология эндометрия в периоде постменопаузы (Патогенез, клиника, диагностика, терапия) Дисс. докг. мед. наук.: Москва, 1989.

3. Hoffken H., Hemmersbach E., Hebeirling D., Leppien G.- Moglichkeiten und Grenzen der konventionellen Differentiol - diagnostik am Endometrium.- Zentralbl Gynakol., 1984, 106,7, 421-430.

4. Ганина К.П. Цитогенетическая диагностика в онкоморфологии. Киев: Наукова Думка. 1980.-176 с.

5. Ferenczy A. Cytodynamics of endometrial hyperplasia and neoplasia.- Part 2: in vitro DNA histodutoradiography.- Hum. Pathol., 1983, 14, 1, 77-82.

6. Zhukotsky A.V., Kogan E.M.: Automated analysis of chromatin structure in interphase cell nuclei. Sov. Med. Rev. B. Physicochem. Asp. Med. Vol.2, 25 - 77, 1989.

7. Бойко Ю.В. Морфофункциональные особенности хроматина интерфазных ядер эпителиальных клеток при гиперплазии и раке эндометрия. Канд. дисс. Киев. 1990.

8. Новик В.И., Агроскин Л.С., Папаян Г.В., Соловьева Л.В. Биометрические исследования в цитоморфологической диагностике патологии эндометрия. Эксперим. Онкология. Том 12, N. 2, 30 - 33, 1990.

9. Пирс Э. Гистохимия.-М.,1962, с. 190 - 192, 746.

10. Афифи А. , Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ. Пер. с англ. - М.: Мир, 1982, - 488 с.

Изобретение относится к медицине и может быть использован для дифференциальной диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия. Способ основан на количественном морфоденситометрическом исследовании изменений интерфазного хроматина ядер железистых клеток эндометрия при гиперпластических процессах и раке эндометрия. Способ диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия путем цитологического анализа взятого у больной биологического материала отличается тем, что в качестве биологического материала берут отпечатки эндометрия, полученные при диагностическом выскабливании слизистой матки, фиксируют смесью Никифорова, проводят рибонуклеазную обработку, окрашивают галлоцианин-хромовыми квасцами, заключают в канадский бальзам, микроденситометрируют интерфазный хроматин железистых клеток эндометрия и на основании полученных параметров (Comp IOD 1, C Std OD2, IOD, PERIMETR) рассчитывают показатель: DF = 0,00013 Comp IOD 1 + 3,98725 C Std OD2 + 0,00001 IOD + 0,01213 PERIMETR - 13,4409 и при положительном значении показателя диагностировали рак эндометрия, при отрицательном - доброкачественные процессы эндометрия. Изобретение позволяет проводить диагностику с большей специфичностью и чувствительностью.

Способ диагностики гиперпластических процессов и рака эндометрия путем цитологического анализа взятых у больных клеток эндометрия и исследования гетерофазного хроматина ядер клеток, отличающийся тем, что берут отпечатки клеток эндометрия, проводят рибонуклеазную обработку, окрашивают галлоцианин-хромовыми квасцами, заключают в канадский бальзам, микроденситометрируют интерфазный хроматин железистых клеток эндометрия и на основании полученных параметров - Comp10D1 - интегральная оптическая плотность гетерохроматина, CStd OD2 - среднеквадратическое отклонение оптической плотности гетерохроматина, 10 - интегральная оптическая плотность хроматина ядра, PERIMETR - периметр ядра рассчитывают дискрименантную функцию DF
DF = 0,00013 • Comp10D1 + 3,98725 • CStdOD2 + 0,00001 • 10D + 0,01213 • PERIMETR - 13,4409,
и при положительном значении показателя DF диагностируют рак эндометрия, при отрицательном - доброкачественные процессы эндометрия.