Способ определения иммунодефицитного состояния у лиц, подвергающихся воздействию малых доз ионизирующей радиации Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и радиационной гигиене. Оно может быть использовано в клинико-лабораторной практике, как экспресс-лабораторный способ оценки уровня неспецифической резистенстности у молодых лиц, подвергающихся длительному воздействию смешанной внешней ионизирующей радиации в малых дозах, ранней донозологической диагностики ее иммунодепрессивного воздействия на организм молодых здоровых людей, выявления группы риска лиц, предрасположенных к инфекционным заболеваниям.

Целью изобретения является разработка нового высоко информативного, более надежного и простого иммунологического способа донозологической диагностики, иммунодепрессивного влияния смешанной внешней ионизирующей радиации в малых дозах на организм человека.

Поставленная цель достигается тем, что из пальца кисти обычным способом получают каплю крови, из которой приготавливают мазок крови и в последующем забирают кровь в лейкоцитарный меланжер обычным способом для .определения количества лейкоцитов в 1 мл крови, Материал забирают утром, натощак. Нефиксированный мазок можно окрашивать сразу, но не позже, чем через 24 ч после его приготовления. Окраску мазков производят в забуференном спиртовом растворе прочного зеленого при рН 8,15 в течение 20 мин. После окраски препарат ополаскивают дистиллированной водой и переносят в 0,25 %-ный раствор красителя

00

о

2

о

азура - А при рН 7,2 на 30 с. Краситель смывают водой, препарат высушивают и просматривают в иммерсионной системе микроскопа с желтым или оранжевым светофильтром.

В окрашенных препаратах определяют следующие показатели:

1. Содержание катионных белков в не.й- трофильных гранулоцитах по данным среднего цитохимического коэффициента (СЦК). СЦК содержания катионных белков в нейт- рофилах периферической крови вычисляют по формуле:

CUKЗ.а 4- 2 б + 1,5 в + 1 .г + 0.5.д + О.е 100

где буквы (a-ж) обозначают количество однотипных клеток с определенной степенью окрашиваемости цитоплазмы прочным зеленым, а цифры (3-0) - степень интенсивности окрашивания. В одном мазке учитывают 100 клеток.

О - отсутствие окраски цитоплазмы или ее слабое диффузное окрашивание

0,5.- в цитоплазме все гранулы бледно окрашены или единично окрашены 1,0 - половина цитоплазмы заполнена светлоокра- шенными гранулами, остальные бледно-зеленые;,

1,5 - цитоплазма равномерное заполнена гранулами, окрашивающимися в светло- зеленый цвет, среди них могут быть отдельные темно-зеленые гранулы;

2,0 - цитоплазма поровну заполнена темно и светло-зелеными гранулами;

3,0 - 2/3 или более гранул окрашиваются в темно-зеленый цвет.

2. В качестве второго показателя использовали процент (из 100 просмотренных нейтрофильных гранулоцитов) клеток, содержащих А-гранулы.

Аномальные гранулы (А-гранулы) определяли в цитоплазме полиморфоядерных лейкоцитов при световой микроскопии (ув 7 х 100), принимая за них гранулы, окрашенные в сиреневый цвет азуром-А. Данные гранулы легко выявляются из-за цветового контраста, создаваемого сочетанием зеленого цвета (из-за окраски красителем прочным зеленых катионных гранул) с сиреневым (из-за окраски А-гранул красителем азуром - А из -за отсутствия в гранулах катионных белков и наличия в них кислых гликопротеидов имукополисахаридов. имеющих средство к азуру А).

3. В качестве третьего показателя использовали среднее содержание А-гранул в одной клетке, который определяли с помощью следующего коэффициента:

Ixni хп2 -Ь 3 хг з + 4 хп ....„.„..„

где 1,2, 3,4 ... - количество А-гранул водной клетке.

Ш, т, пз, П4 ... - количество однотипных клеток с определенным содержанием аномальных гранул.

4. В качестве четвертого показателя использовали общее внутриклеточное содержание катионных белков (ОВСКБ) в нейтрофилах единицы объема крови (1 л), который рассчитывали с помощью следующей формулы:

АВСКБ- h

где СЦК - средний цитохимический коэффициент, характеризующий содержание катионных белков (КБ) в одной нейтрофиле в условных единицах;

Нф - количество нейтрофилов (фактическое) в единице объема исследуемой крови (1 х 109/л);

Нд- количество нейтрофилов (должное) в единице объема крови у лиц контрольной группы. Эта величина остается постоянной

во всех расчетах ОВСКБ.

Для определения абсолютного содержания нейтрофилов в 1 единице объема периферической крови в начале определяли процентное их содержание среди всех лейкоцитов(из 100 просмотренных) при микроскопии мазка периферической крови, а в последующем, определив обычным способом общее количество лейкоцитов рассчитывают абсолютное содержание

нейтрофилов в 1 л крови (Н) по следующей формуле:

Н

45

А X Б 100

где А - процентное содержание нейтрофилов;.

Б - общее содержание лейкоцитов в 1 л крови. .

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что для исследования у обследуемых забирается для изучения только периферическая кровь (из пальца) и изучаются только нейтрофильные лейкоциты (их количество в единице объема периферической крови и функциональное состояние их 02 - независимой антимикробной системы). При этом в

качестве основных критериев оценки биологического действия ионизирующей радиации используются показатели, характеризующие внутриклеточное содержание катионных белков:

1. Содержание КБ в нейтрофилах по данным СЦК - среднего цитохимичеекого коэффициента (в усл. ед.).

2. Количество клеток, содержащих аномальные гранулы (в %).

3. Среднее содержание А-гранул в одном нейтрофиле.

4. Общее внутриклеточное содержание КБ в нейтрофилах единицы объема крови (1

4

Сведения об использовании перечисленных критериев для оценки биологического действия ионизирующих радиации в малых дозах на организм здоровых молодых людей в доступной отечественной и зарубежной литературе мы не обнаружили.

Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения Новизна.

Известны способы, в основном которых для оценки биологического действия радиации предложены различные гематологические, цитохимичёские, морфологические и иммунологические показатели. Однако все перечисленные способы не обеспечивают быстрой (30-40 мин), высоко-информативной и малотрудоемкой оценки действия на организм радиации. Это позволяет сделать вывод о его соответствии критерию существенные отличия. Использование ЛКТ для этих це лей (с учетом анализа предложенных показателей) позволяет более качественно (с учетом индивидуальной реакции организма) оценивать биологический эффект ради- ации в малых дозах. Увеличение содержания в периферической крови нейтрофилов с низким содержанием катионных белков в лизоеомах характеризует общий ингибирующий эффект малых доз радиации на продукцию данных белков и нейтрофилах костного мозга. Учитывая тот факт, что при. воздействии малых доз инонизирую- щих излучения происходит уменьшение в периферической крови содержание нейтро- фильных гранулоцитов, представляется существенным оценка внутриклеточного содержания КБ в данных клетках в единице крови. Разработанный нами показатель (ОВСКБ) позволяет объективно оценивать эти изменения с учётом абсолютного количества нейтрофилов в единице объема крови (1 л).

Известно, что под влиянием ионизирующей радиации возникают сложные морфо- функциональные изменения в клетках

крови, в том числе и в гранулоцитах. На фоне развития общего неспецифического адаптационного синдрома стресса малые дозы радиации способны вызывать соматические 5 мутации, с которым может быть связано развитие одного из отдаленных последствий действий радиации - лейкоза. Как в эксперименте, так и на людях обнаружено нарушение дифференцировки лейкоцитов под

0 влиянием малых доз радиации.

Поэтому увеличение в периферической крови нейтрофилов с аномальными (А-гра- нулы) гранулами свидетельствует о самых ранних нарушениях гранулогенеза и частич5 ной утрате клетками КБ под влиянием радиации. Показано, что2-гранулы появляются в нейтрофилах на фоне снижения у них КБ при ожоговой болезни и хроническом миелолей- козе (Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А. и др.

0 1983).

Увеличение среднего количества А-гранул в сегментоядерном нейтрофиле дополняет и расширяет представления о данном процессе (Пигаревский В.Е. 1988).

5 Таким образом предлагаемый нами способ позволяет комплексно оценивать мо- рфо-функциональноесостояние нейтрофилов их 02-независимой антимикробной системой у здоровых лиц, подверга0 ющихся длительному воздействию малых доз ионизирующей радиации.

С целью объективного определения информативности предлагаемого нами способа мы изучили его динамику у 193 здоровых

5 молодых мужчин в возрасте 18-35 лет, проживающих в средних широтах. Из них группу в количестве 123 человек составили лица, условия труда которых были связаны с источниками ионизирующих излучений. Ос0 новную массу обследованных составили лица, подвергавшиеся облучению на уровне 3-5 БЭР в год (группа А, п 62). В остальных случаях дозы, как правило не превышали 2 -3 БЭР в год (группа Б, п 61). Контрольную

5 группу составили 70 человек (ионизирующая нагрузка у них была исключена). Группы обследованных формировались по стажу работы (1 г., 2 г., Зг., 5-7 лет, 8-10лет) и уровню облучения (А-группа при уровне облучения

0 3-5 ЮЭР и Б-группэ - при уровне облучения 2-3 БЭР в год).

Все обследованные были здоровы и трудоспособны по своей специальности. Забор материала для исследования проводился в

5 одно и то же время года (осень) и суток (утром натощак). Результаты исследования представлены в табл. № 1. Из представленных данных видно, что у лиц контрольной группы не обнаружено аномальных гранул в нейтрофилах, а уровень внутриклеточного

катионного белка соответствует значениям СЦК. У лиц, работающих с источниками ИИ 1 год также не обнаружено достоверного снижения КБ (см. табл. № 1). Однако анализ результатов в группе А выявил их достоверное снижение (см. табл. № 2). У всех лиц обслуживающих ускоритель в течение 1 года обнаружено достоверное увеличение лейкоцитов по сравнению с контрольной группой (см. табл. № 1). Однако в большой степени эти изменения были характерны для рабочих группы В. При общей оценке изменений абсолютного количества нейтрофилов нами не обнаружено его достоверное снижение. В группе А, в отличии от общих изменений данного показателя у всех рабочих, было обнаружено его достоверное (р 0,001) снижение. Снижение значений показателя ОВСКБ (общее внутриклеточное содержание катионных белков) у данной категории обследованных не обнаружено. Однако у большинства были обнаружены аномальные гранулы в цитоплазме нейтрофилов (5,65 ± 1,24 % р 6,001). Среднее содержание А-гранул в одной клетке составило 2,56 ± 1,69 (р 0,05), Сопоставительный анализ изменений данных показателей в группах обследованных в зависимости от специфических условий их работы выявил достоверное снижение ОВСКБ у лиц группы А (1,27 ±0,03, ,001), а также более высокое содержание у них А-гранул.

Исследования проведенные у лиц, проработавших 2 года, выявили существенные изменения морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови. Так, выявлено достоверное снижение у них содержания КБ по данным СЦК (1,35 ± 0,2 0,01). Хотя и не было обнаружено у них изменений общего количества лейкоцитов в -1 мкл крови (:,86 ± 1,32 р 0,05), все таки абсолютное количество нейтрофилов уменьшалось до 3,62 ±0,91(р 0,01).

Поэтому в отличии от значений СЦК общее внутриклеточное содержание КБ было значительно ниже и составило 1,16 ± 0,35 (р 0,001). У всех обследованных обнаружены были в нейтрофилах А-гранулы, причем их было значительно больше (16,8 ± 6,67) р.

0,001), чем у лиц проработавших на ускорителе 1 год. Среднее содержание А-гранул также было больше и составило 4,85 ± 1,43 (,001). Анализ изменений показателей в группах показал их более выраженные изменения у лиц группы А (см. табл. № 2).

Максимальное угнетение 02- независимой антимикробной системы нейтрофилов нами обнаружено у лиц, проработавших с

источниками ионизирующих излучений 3 года. Так у них обнаружено максимальное снижение СЦК ( 1,29 ± 0,09 р 0,001), абсолютного количества нейтрофилов (3,23 ±

0,95 .001) ОВСКБ ( 1.02 ± 0,35 ) увеличение в периферической крови нейтрофилов, содержащих аномальные гранулы (25,3 ± 7,55 % р 0,001), а также высокое содержание данных гранул в одной клетке

(5,73 ±0,85 ,001). Сравнительное изучение информативности изучаемых показателей выявило более низкое содержание КБ по данным СЦК у лиц группы А по сравнению с таковыми у лиц группы Б (р1 0,01).

При этом в группе А отмечалось более выраженное снижение количества лейкоцитов (4,61 ± 0,4, р 0,05). в том числе и абсолютное количество нейтрофилов (2,48 ±0,73, р,05). Характерным было также существенное

снижение у лиц группы значений показателя ОАСКБ(0,78 ±0,36, рс 0,0.1 по сравнению с аналогичными значениями у лиц группы Б, Процентное содержание гранулоцитов содержащих аномальные гранулы лиц группы

А было также значительно выше (32,5 ± 8,6 р 0,001). Среднее содержание аномальных гранул у этой категории обследованных также повышалось и составляло (6,22 ± 0,95 рк 0,05), Исследования, проведенные у лиц,

проработавших с источниками ИИ от 5 до 7 лет выявило тенденцию к повышению следующих показателей: СЦК (1,35 ± 0,49 р 0,05), количество лейкоцитов (5,57 ± 1,01), нейтрофилов (3,34 ± 0,84 ,01). Однако .

существенных изменений показателей, характеризующих восстановление функционального состояния Оа - независимой антибикробной системы ПМЯЛ (ОВСКБ, количество нейтрофилов в А-грануламигв нейтрофиле) нами не обнаружено.

У данной категории лиц, так же как у лиц предыдущей группы (проработавших 3 года) данные показатели имели значения, присущие для иммунодефицитного состояния

(резкое снижение в нейтрофилах катионных белков на фоне высокого содержания в них аномальных гранул).

Сравнительный анализ результатов исследований у лиц проработавших в разных

условиях облучения показал, что у лиц группы А исследуемые показатели достоверно (р 0,05; рКО.001) отличались от аналогичных у лиц группы Б. Исключением является среднее содержание А-гранул в нейтрофиле (р

0,05). Характерным является при этом тот факт, что процентное количество нейтрофилов с А-гранулами у лиц. группы А почти в 2 раза превышало (р 0,001) их количество у лиц группы Б,

Исследования, проведенные у лиц через 8-10 лет работы с источниками ИИ выявили полное восстановление таких показателей, как СЦК, количество лейкоцитов в 1 мкл крови и абсолютное количество нейтрофилов в 1 мкл крови, У всех обследованных наблюдалась выраженная тенденция к нормализации показателей 02 - независимой антимикробной системы, хотя они при этом их значения достоверно (р 0,001) отличались от аналогичных у лиц контрольной группы.

Анализ показателей у лиц групп А и Б показал, что по сравнению с контрольным уровнем максимальное изменение большинства показателей сохранялось у обследованных из группы А. У данной категории лиц полностью восстанавливался лишь один показатель - количество лейкоцитов 1 мкл крови. В тоже время у лиц из группы Б данный показатель их не только восстанавливался, но и достоверно повышался (6,49 ±1,23. .05).

У лиц группы Б было обнаружено полное восстановление следующих показате-. лей: СЦК КБ, абсолютное количество нейтрофилов в 1 мкл крови, ОБСКБ. Однако процентное содержание нейтрофилов, содержащих А-гранулы, хотя и значительно снижалось, оставалось при этом высоким (6,1 ±2,23 % ,001). Среднее содержание А-гранул в одном нейтрофиле у лиц группы Б также резко снижалось и составило 1,91 ± 0,96 (р 0,01). Различная исследуемых показателей у лиц группы А и Б были достоверными (р 0,05, р 0в001) за исключением количества лейкоцитов в 1 мкл периферической крови.

Таким образом выявленные нами изменения морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови являются результатом ответной реакции гранулопоэза на длительное воздействие малых доз ионизирующих излучений. Реакция затрагивает разные структуры клетки: лизосомы и ядро. Выявленные сдвиги в функционировании Оа - независимой антимикробной системе нейтрофилов указывают на наличие некоторого иммунодефицита у лиц, подвергающихся длительному воздействию ионизирующей радиации в малых дозах (в пределах допустимых). Этот дефицит в основном проявляется в уменьшении катионных белков в нейтрофилах и появлении А-гранул - как результат нарушения гранулпоэза. Ведущими факторами в изменении показателей неспецифической резистенстнрсти персонала подвергающегося .профессиональному облучению ионизирующей радиации в малых дозах, являются стаж и годовая доза облучения.

С целью упрощения диагностики иммунодепрессивного влияния на организм молодых людей малых доз смешанной радиации, мы разработали табл. fxfe 3, по которой оценка интегральной степени иммунодепрессии выполняется в степенях.

Для этого в начале проводится оценка уровня изменений каждого показателя с учётом стажа работы. Суммирование степеней изменений предлагаемых показателей позволяет в интегральной форме оценить уровень

иммунодепрессии. Как видно из данных табл. № 3 максимальный уровень угнетения функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов наблюдается через 3 года работы с источниками ионизирующих изучений, при этом у лиц группы А диагносци- рована III степень, а у лиц группы Б - II степень иммунодепрессии.

Полученные данные показывают, что предлагаемый способ в отличии от ранее

предложенного (Соколов В.В., Грибова И.А. и др. 1980), обладает рядом преимуществ:

1)он менее трудоемкий и более простой, в исполнении;

2) позволяет в более короткий срок (3040 минут) диагносцировать иммунодефицитное состояние у лиц, работающих в

условиях длительного воздействия малых

доз ионизируюющих изучений;

3) более доступный, может использо- ваться в условиях медсанчасти, поликлиник, госпиталей;

4) не требует дополнительного оборудования и высокоспециализированных специалистов;

5) позволяет быстро выявлять среди персонала, обслуживающего источника ионизирующих излучений группы риска, часто болеющих инфекционными заболеваниями;

6) позволяет более эффективно проводить диспансерно-динамическое наблюдение за персоналом , обслуживающим источники ионизирующих излучений.

50

Формула изобретения

Способ определения иммунодефицит- ного состояния у лиц, подвергающихся воздействию малых доз ионизирующей радиации путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет раннего выявления иммунодефицитного состояния, определяют цитохимически общее внутриклеточное содержание катионных

белков в нейтрофильных гранулоцитах 1 мкл крови, количество нейтрофильных грануло- цитов, содержащих аномальные гранулы, среднее содержание аномальных гранул в одном нейтрофиле и при снижении первого

показателя на 25 % и более, увеличении второго показателя в 4 раза и более и третьего в 2 раза и более относительно нормы определяют иммунодифицитное состояние.

Таблица 1

Использование: в области медицины, а именно в иммунологии и радиационной гигиене и может применяться для донозологической диагностики иммунодепрессивного. влияния смешанной внешней ионизирующей радиации в малых дозах на организм человека. Сущность изобретения: осуществляют забор крови из пальца, приготавливают мазок, окрашивают его простым зеленым и азуром А и определяют в окрашенном мазке содержание катионных белков в нейтро- филах 1 мкл крови, количество нейтрофильных гранулоцитов, содержащих аномальные гранулы, и среднее содержание аномальных гранул в одном нейтрофиле и при снижении первого показателя на 25 % и более и увеличении второго показателя в 4 раза и более и третьего в 2 раза и более относительно нормы определяют иммуноде- фицитное состояние. Способ позволяет повысить точность способа за счет раннего выявления иммунодефицитного состояния, (Л С

Динамика гематологических и цнтохинических показателей по ланимм пкт у ра 5отников, обслуживающих ЯЭХ

па л 70

1,57+0,09

Примечание. - достоверность различий с контрольной группрй р 0,05; -.достоверность различия с контрольной группой р 0,01;

- достоверность различия с контрольной группой р 0,001

: Таб лица2

Динамика гематологических и цитохимических показателей .по данным ЛКТ у лиц, обслуживающих.ЯЗУ с учетом (характера работы

1 год1,36+0,11 1,,08

и - 30Р, 0,05

Z года1,,22 1,,1Э

п - 26Р, 0,05

3 года1,, 1,3410,07

п. 2k, 0,01

5-7 лет1,28+.0,15 l.sVo.O

ч - 24Р, 0,05

8-ю лет 1,, 1,,08

п - 19Р+ 0,05

Контрольная

группа1,,03

п - 70.

1,2710,,5650,03

Р, 0,001 0,89+0,.ЗВ

Р, 0,001 0,,,2ltO,35

Р, 0,01 0,SMO,.2U0.35

Р, 0,01 1,06iO,,,02

Р 0,05 1,57+0,09

и в. - достоверность различий с контрольной группой Р 0,05;

- достоверность различий с контрольной группой Р 0,01;

- достоверность различий с контрольной группой Р 0,001; Р - достоверность различий между группами А и Б

4,2+0,16 1,57iO,09 О

.Э 7,1111,,8МО,61| ft,Ii6iO,69

Р« 0,,05

5,08г1,1б 6,331,,,86 ,,99

Р 0,05Р,«.0,001

Р, .0,05 -R,0,05

11,9211,01 i ,02i1,,,78 3,8641,13

Р, 0,05Р, 0,01

5,,82 M9S1.,4710,83 i,334M

Р, f 0,05Р,0,05

5,87 0,17

Ii,2 0,16

9,,И3,,2 4,0211,78 1,4511,67

Я, 0,001Р,0,001 21,,99 11,6t5,38 5,8Н1,32 . 3,89i1,6

Р, « 0,01Р4 0,01 32,,6 19,,91 6,22+0,95 5,,8

Р, t 0,001Р,0,05 21,6±7,49 14,,91 541,28 3,,29

Р, 0,001Р,)0,05 11,5i4,55 6.U2,23 3,4511,06 1,9НО,95

Р, 0,001Р( 0,01

Оценка степени иммунодепрессии у лиц молодого возраста вызываемой малыми дозами смешанной радиации

Среднее содержание А-гранул в 1 нейтро- филе

Интегральная степень иммунодепрессии

Примечание: ( ) - увеличение (уменьшение) значений показателя; Н - нормальное значение;

1,11,111 -степени иммунодепрессии; А и Б - персонал, имеющий ионозирующую нагрузку, соответственно 3-5 БЭР-в год и 2-3 БЭР в год

f 1 4t43 Hz Жз и Жз I 1

in

и

ii

и