СПОСОБ ОЦЕНКИ ХАРАКТЕРА ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКУ РАЗЛИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относиться к биологии и медицине и может быть использовано в токсикологии для оценки характера воздействия на клетки различных ксенобиотиков, в экспериментальной фармакологии при изучении влияния на живые клетки новых лекарственных препаратов, в практической медицине для определения индивидуальной чувствительности и подбора доз назначаемых лекарственных препаратов.

Известно, что действие на организм различных химических веществ в конечном итоге реализуется на клеточном уровне. Существующие способы оценки характера воздействия химических агентов на живые клетки основаны главным образом на исследованиях, проводимых in vitro на культуре клеток, с изучением различных электрофизиологических параметров, подвижности клеток, изменений их формы, отношения к витальным красителям. Эти методы достаточно сложны, трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования, дефицитных реактивов и питательных сред, а интерпретация полученных результатов вызывает затруднения, связанные с особенностями функционирования клеток в культуре.

Основой предлагаемого метода является тот факт, что ядра живых клеток имеют отрицательный электрический заряд и под действием электрического тока смешиваются по направлению к аноду. Если прямоугольный импульс является биполярным и подается на электроды с определенной частотой, то ядра клеток будут совершать маятникообразные движения. Амплитуду смещения, то есть расстояние, на которое перемещаются ядра под действием электрического тока, можно измерить с помощью микрометра (нами использован полуавтоматический телевизионный микрометр). Амплитуда смещения ядра зависит от величины заряда ядерной мембраны, объемного заряда ядра и вязкости цитоплазмы и, следовательно, является интегральным показателем, отражающим функциональное состояние клетки. Изменение амплитуды под влиянием химических веществ есть проявление их биологического эффекта.

Сущность предлагаемого метода оценки действия на живую клетку химических агентов состоит в том, что в неокрашенных мазках буккального эпителия при внутриклеточном электрофорезе измеряют напряжения и частоты до и после добавления исследуемого химического препарата. При увеличении амплитуды по сравнению с контролем констатируют биостимулирующий эффект, при уменьшении - угнетающий.

Способ осуществляется следующим образом. У обследуемого человека легким нажимом шпателя берут соскоб слизистой щеки и полученный материал (клетка) суспензируют в изотоническом растворе хлорида натрия между двумя покровными стеклами. Препарат помещают в ячейку для микроэлектрофореза, представляющую собой предметное стекло с двумя закрепленными электродами в виде пластин из нержавеющей стали шириной 5 мм, толщиной 0,5 мм. Электроды подключают к прибору для микроэлектрофореза, который позволяет регулировать устанавливать частоту и напряжение тестирующего сигнала, подаваемого на ячейку с препаратом. Диапазон изменения напряжения от 0 до 30 B, частоты от 0 до 15 Гц. Ячейка для микроэлектрофореза с препаратом помещается на предметный столик микроскопа. Исследование проводится с помощью полуавтоматического телевизионного микрометра.

С помощью предлагаемого метода проведено исследование влияния мембраноактивного препарата диметилсульфоксида (ДМСО), а также синтетического аналога природного лей-энкефалина даларгина на подвижности ядер буккального эпителия человека.

В результате проведенных 80 исследований по изучению влияний различных концентраций ДМСО на клеточные ядра установлено, что 50-й раствор ДМСО оказывает выраженное угнетающее действие: в 4-х наблюдениях из 5 отмечалась полная остановка движения ядер, в одном амплитуда смещения ядер уменьшалась в 2,5 раза по сравнению с контролем. 10-й ДМСО действует на клетки угнетающие, снижая амплитуду смещения ядер в 2 раза (p < 0,001). 1-й раствор ДМСО оказывает стимулирующий эффект: амплитуда перемещения ядер возрастает на 30-50 (p < 0,05).

Выполнено 20 исследований по изучению действия на клетки буккального эпителия 0,01-го, 0,005-го и 0,0025-го растворов даларгина. Выявлены значительные индивидуальные вариации чувствительности клеточных ядер у обследованных лиц к действию препарата. Одна и та же концентрация веществ могла оказывать стимулирующее, угнетающее действие или не оказывать эффекта на подвижность клеточных ядер у разных людей.

Пример 1. У обследуемого лица М. взяли 2 мазка со слизистой щеки. Один мазок поместили в изотонический раствор хлорида натрия, другой в 1-й ДМСО, приготовленный на физиологическом растворе. В контрольном мазке измерили амплитуду смещения ядра в 5 клетках. Она составила в среднем 2,38±0,21 мкм. Затем определили амплитуду смещения ядра в 5 клетках мазка, подвергавшегося 20-минутному воздействию ДМСО: 3,27±0,30 мкм. Поскольку различия с контролем статически достоверны (p<0,05) можно констатировать, что 1-й раствор ДМСО оказывает стимулирующее влияние на функциональное состояние клеток буккального эпителия.

Пример 2. У обследуемого лица Д. взяли соскоб клеток буккального эпителия и поместили в изотонический раствор хлорида натрия. Другой мазок, приготовленный одновременно с контрольным, -в 50-й раствор ДМСО на 20 мин. Измерили амплитуду перемещения 5 ядер в контрольном мазке: 3,9±0,17 мкм. Средняя амплитуда движения 5 ядер препарате с ДМСО составила 0,93±0,06 мкм (p<0,001). Следовательно, воздействие 50-го ДМСО на клетки носит угнетающий характер.

Пример 3. Взятые у обследуемого лица П. клетки буккального эпителя поместили на 20 мин в 0,005-й раствора даларгина. В одновременно приготовленном контрольном мазке определили амплитуду смещения 5 ядер. Она составила 2,52±0,2 мкм. В мазке с даларгином средняя амплитуда смещения 5 ядер оказалась 4,6±0,56 мкм (p<0,01). Полученные результаты позволяют сделать вывод о стимулирующем характере воздействия даларгина на клетки данного обследуемого лица.

Пример 4. У обследуемого лица А. мазок клеток буккального эпителия приготовили на 0,01-м растворе даларгина. В контрольном мазке измерили амплитуду смещения 5 клеточных ядер: 8,47± 0,79 мкм. После 20-минутного пребывания клеток в растворе даларгина определили амплитуду перемещения 5 ядер. Она составила 6,97±0,71 мкм (p>0,05). Таким образом, воздействие 0,01-го даларгина на клетки данного лица вызывает лишь незначительных эффект.

Предлагаемый способ прост и нетрудоемок, позволяет проводить скрининговый анализ влияния различных химических агентов непосредственно на живую клетку, оценивать индивидуальную чувствительность клеток организма к действию различных химических факторов среды. Преимуществом метода является простота получения материала для исследования, возможность количественной оценки получаемых результатов и их статистической обработки, быстрота проведения исследования, возможность констатации биостимулирующего и угнетающего эффекта вещества.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в токсикологии для оценки характера воздействия на клетку различных ксенобиотиков, в экспериментальной фармакологии при изучении влияния на живые клетки новых лекарственных препаратов, в практической медицине для определения индивидуальной чувствительности и подбора доз назначаемых лекарственных препаратов. Сущность предлагаемого метода оценки действия на живую клетку химических агентов состоит в том, что в неокрашенных мазках буккального эпителия при внутриклеточном электрофорезе измеряют амплитуду смещения клеточных ядер до и после добавления исследуемого химического вещества. При увеличении амплитуды по сравнению с контролем констатируют биостимулирующий эффект, при уменьшении - угнетающий. Способ прост в исполнении, позволяет сократить время исследования.

Способ оценки характера воздействия на клетку различных химических агентов, включающий витальную биомикроскопию клеток буккального эпителия при микроэлектрофорезе, отличающийся тем, что определяют амплитуду смещения клеточных ядер до и после воздействия и при статистически достоверном увеличении ее по сравнению с контролем констатируют биостимулирующий эффект, а при уменьшении угнетающий.