СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕТНЕ СПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРОДУЦИРОВАТЬ АКТИВИРОВАННЫЕ МЕТАБОЛИТЫ КИСЛОРОДА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/49 G01N21/76 

Изобретение относится к технике определения способности нейтрофилов продуцировать высокотоксичные для патогенных микроорганизмов активированные метаболиты кислорода, что может быть использовано в различных областях экспериментальной медицины, в частности, для оценки вероятности возможности генерализации инфекции.

Известны способы для оценки образования активированных метаболитов кислорода, продуцируемых нейтрофильными гранулоцитами при фагоцитозе ими микрочастиц индукторов респираторного взрыва (частицы зимозана, гранулы латекса и т. п. ), находящихся в реакционной кювете с полиморфноядерными лейкоцитами. Методы основаны на регистрации усиленной люминолом хемилюминесценции образцов с помощью фотоэлектронного умножителя. При этом полагают, что уровень свечения препаратов находится в прямой зависимости с интенсивностью генерации клетками свободных радикалов, и, следовательно, микробоцидной способностью фагоцитов, обусловленной этим фактором (Мицнефис М.М. и соавт. //Лабораторное дело. 1991, N 10, с.45 46).

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является метод определения способности нейтрофильных гранулоцитов продуцировать активированные метаболиты кислорода, разработанный О.Б.Филюковой и соавт. (Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1987, N 3, с.58 60). Согласно их методу в качестве индукторов респираторного взрыва используют частично инактивированные микроорганизмы, что является более адекватным, так как антигены, локализованные на поверхности бактерий, оказывают существенное влияние на процессы фагоцитоза и включение механизмов кислородозависимого метаболизма нейтрофилов, непосредственно связанного с продукцией клетками свободных радикалов активированных метаболитов кислорода. Кроме того, авторы проводят регистрацию свечения препаратов (светосумма за время инкубации образцов) при соотношении в реакционной кювете микроорганизмов индукторов респираторного взрыва и нейтрофилов 10:1 и 100:1, что, по мнению авторов, позволяет повысить диагностическую ценность метода, хотя с нашей точки зрения трактовка получаемых ими показателей могла бы быть несколько иной.

Вышеописанный способ прототип имеет недостатки: он не предусматривает сопоставительного анализа способности нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода, функционирующих в различных условиях при минимальных и максимальных нагрузках на нейтрофил фагоцитируемыми микроорганизмами, и, следовательно, не определяется специфический метаболический резерв клеток. Кроме того, в процессе выполнения методики не учитывается такой важный параметр, характеризующий свободнорадикальный потенциал нейтрофилов, как максимальная интенсивность свечения препарата на высоте респираторного взрыва показатель, отражающий синхронность процесса наработки клеткой активированных метаболитов кислорода, а также другой показатель время наступления максимальной интенсивности свечения образцов. Последний параметр характеризует состояние опсонизирующей способности плазмы крови, непосредственно влияющей на фагоцитарные свойства нейтрофилов и реакции продукции свободных радикалов, сопряженные с этим процессом.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является устранение существующих недостатков повышение информативности метода за счет получения дополнительных показателей, которые позволяют вычислить свободнорадикальный потенциал нейтрофильных гранулоцитов, что в конечном итоге дает возможность более адекватно оценивать способность нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода.

Поставленная задача решается за счет того, что регистрируют светосумму, максимальную интенсивность и время наступления максимума свечения каждого образца, вычисляют отношение показателей светосуммы свечения образцов при соотношении в реакционной кювете микроб/нейтрофил 100:1 к аналогичному показателю при соотношении 10:1 (K₁), далее таким же путем вычисляют отношение показателей максимальной интенсивности свечения образцов (K₂), определяют сумму показателей времени наступления максимальной интенсивности свечения образцов при соотношении микроб/нейтрофил 100:1 и 10:1 (Т_к), рассчитывают свободнорадикальный потенциал нейтрофилов (СПН) по формуле:

и оценивают способность нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода при СПН, равном 22 53, как нормальную, при СПН, равном 6 21 в пределах нижней границы нормы, а при СПН меньше 6 как недостаточную.

Способ осуществляют следующим образом. Образец крови в равных объемах помещают в две реакционные кюветы при соотношении микроорганизмов индукторов респираторного взрыва и нейтрофилов 10:1 и 100:1, регистрируют свечение образцов за период их инкубации и определяют светосумму. Далее с помощью самописца или цифропечатающего устройства определяют максимальную интенсивность свечения каждого образца как высоту пика респираторного взрыва (замеряют высоту пика на хемилюминограмме) и время свечения образцов, для чего на хемилюминограмме замеряют расстояние от начала регистрации свечения до перпендикулярной линии, опущенной с вершины пика на кривой и пересекающей фоновую линию, и вычисляют показатель с учетом скорости движения диаграммной ленты. Проводят сопоставительный анализ величины люминолзависимой хемилюминесценции образцов нейтрофильных гранулоцитов при соотношении в реакционной кювете микроб/нейтрофил 10: 1 и 100:1 (светосумма за период регистрации свечения препаратов) вычисляют коэффициент K₁ как отношение полученного показателя при соотношении в реакционной кювете микроб/нейтрофил 100:1 к аналогичному показателю при 10:1. К₁ позволяет определить функциональные свойства нейтрофилов при максимальной нагрузке, то есть выявить специфический резерв клетки. Если нейтрофил является полноценным и адекватно отвечает генерацией активированных метаболитов кислорода на возросшую нагрузку, то коэффициент K₁ возрастет (у интактных животных он составляет 2,11±0,16). По мере снижения коэффициента K₁, особенно ниже 1,0, способность нейтрофилов продуцировать свободные радикалы в условиях повышенной нагрузки уменьшается.

Аналогичным способом вычисляют коэффициент K₂ как отношение максимумов интенсивности свечения образцов в обеих кюветах. В норме K₂ отражает адекватную способность нейтрофилов синхронно продуцировать активированные метаболиты кислорода на высоте респираторного взрыва (K₂ у интактных животных составляет 2,00±0,15). Снижение коэффициента свидетельствует о нарастающей специфической функциональной неполноценности нейтрофильных гранулоцитов, а увеличение об улучшении этих свойств клеток.

Если обозначить время наступления максимальной интенсивности свечения образцов в обоих вариантах проведения инкубации нейтрофилов (при соотношении в реакционной кювете количества микроорганизмов индукторов респираторного взрыва и нейтрофилов 100:1 и 10:1) через T₁ и T₂, а показатель времени наступления максимума свечения образцов как T_к (комплексный), равный сумме T₁ и T₂ (T_к у интактных животных составляет 9,80±0,84 мин), то целесообразно ввести понятие свободнорадикального потенциала нейтрофилов (СПН), который вычисляют по формуле:

где множитель 100 используется для перевода показателя в число больше единицы. При этом T_к в минутах для данного расчета используется как безразмерная величина.

Возрастание суммы коэффициентов K₁ и K₂ свидетельствует о повышении способности нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода при увеличении нагрузки на клетки возросшим числом микроорганизмов в реакционной кювете, а подъем знаменателя T_к об уменьшении опсонизирующей системы плазмы крови, непосредственно связанной с проявлением специфических функций нейтрофилов, то есть с продукцией свободных радикалов. Укорочение времени наступления максимума свечения образцов отражает повышение опсонизирующей способности плазмы крови, увеличение фагоцитирующих свойств нейтрофильных гранулоцитов, более быстро наступающую активизацию кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.

Свободнорадикальный потенциал нейтрофилов в условиях физиологической нормы находится в пределах 21,8 53,0 (M±1б) при среднем значении показателя 37,4±3,2 (M±м), в интервале 6,2 21,7 в пределах нижней границы нормы ( интервал в диапазоне М 1б и М 2б), ниже 6,2 - оценивается как низкий, при котором способность нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода является недостаточной. Показатели в пределах 53,1 68,6 (в интервале М + 1б и М + 2б) оцениваются как верхняя граница нормы, выше 68,6 как высокие или очень высокие.

Вышеизложенное поясняется примером. В эксперименте белым крысам индуцирован инфекционный процесс различной степени тяжести путем введения животным под кожу взвеси свежеприготовленной культуры синегнойной палочки в однократной дозе 0,25•10⁹ микробных тел (1 серия опытов) и 1,0•10⁹ микробных тел (II серия). Микроорганизмы в соответствующей дозе вводили крысам три дня подряд, при этом суммарная доза заражения животных в I серии опытов составила 0,75•10⁹, а во II 3,0•10⁹ микробных тел, то есть, как однократная, так и суммарная доза заражения во II серии экспериментов была в 4 раза выше, чем в 1.

У животных до заражения и ежедневно в процессе наблюдения за ними после инфицирования забирали кровь на исследование. Функциональную активность нейтрофилов, обусловленную генерацией клетками свободных радикалов, определяли с помощью хемилюминесцентного метода, позволяющего регистрировать интенсивность свечения образцов, возникающего при окислении люминола активированными метаболитами кислорода. Для стимуляции респираторного взрыва использовали предварительно неопсонизированную и частично термоинактивированную культуру эпидермального стафилококка штамм 600.

В пробирку, содержащую 100 мкл раствора Хенкса без фенолового красного с 2 ед гепарина, помещали 100 мкл цельной крови, перемешивали и содержимое переносили в реакционную кювету, в которую добавляли 500 мкл аналогичного раствора Хенкса, 10 мкл люминола в концентрации 10^-3M. Реакцию запускали путем добавления 50мкл взвеси микроорганизмов (эпидермальный стафилококк), содержащей 10⁸ микробных тел в 1 мл. При этом соотношение между количеством микроорганизмов и числом нейтрофильных лейкоцитов в пробе находилось приблизительно в пределах 10:1.

Параллельно проводили исследование интенсивности респираторного взрыва при соотношении в реакционной кювете количества микроорганизмов и нейтрофильных гранулоцитов 100:1. С этой целью в кювете смешивали кровь с раствором Хенкса, приготовленную как описано выше, добавляли 50мкл раствора Хенкса, 10мкл раствора люминола и 500мкл той же взвеси микроорганизмов.

Регистрацию люминолзависимой хемилюминесценции образцов проводили на хемилюминометре ХЛМ1Ц-01 (г.Киев). С помощью счетчика фотонов замеряли светосумму за 30 мин инкубации препаратов при температуре 37^oC, динамику хемилюминесцентного ответа полиморфноядерных лейкоцитов регистрировали самописцем КСП-4, рассчитывали максимальную интенсивность свечения препаратов и время наступления максимума свечения, а также коэффициенты K₁, K₂ и комплексный показатель T_к как описано выше. На основании полученных значений параметров вычисляли свободнорадикальный потенциал нейтрофилов. Результаты исследования подвергнуты статистическому анализу с применением t-критерия Стьюдента.

Анализ свободнорадикального потенциала нейтрофильных гранулоцитов у животных I и II серии экспериментов показал, что этот параметр у опытных животных отличается как от интактных белых крыс, так и между собой в зависимости от дозы заражения и в различные сроки с начала эксперимента (см. таблицу и чертеж). Видно, что кривая усредненного значения параметра в условиях более тяжелого инфекционного процесса (II серия опытов) располагается ниже аналогичной кривой у животных I серии опытов.

У животных в I серии экспериментов значения показателя не выходили за пределы М 2б уровня интактных животных в 36 случаях наблюдения (ежедневная регистрация показателя в течение 3-х дней у 12 животных), то есть, не были ниже 6 единиц. Крысы этой серии опытов не погибали в течение 3-х суток с начала их инфицирования. У животных II серии опытов с более тяжелым инфекционным процессом в 7 случаях из 24 через 1 и 2 суток от начала заражения крыс (ежедневная регистрация показателя в течение 2-х дней у 12 животных) показатель свободнорадикального потенциала был ниже 6 единиц. При этом почти в половине случаев животные, у которых накануне было зафиксировано падение анализируемого параметра ниже 6 единиц, на следующий день погибли. В частности, у погибших животных накануне были следующие значения свободнорадикального потенциала: 1,9; 2,7; 4,5. Эти значения показателя на рисунке изображены точками.

Характер висцеральной патологии гистоморфологические изменения легких, почек, печени, сердца, выражающейся в сочетанном развитии в этих органах дисциркуляторных, дистрофических и воспалительных процессов с образованием в конечном итоге картин острого гнойного очагового воспаления, является морфологическим подтверждением сепсиса (септикопиемическая форма), развившегося у погибших животных. Выявленная корреляция низких значений свободнорадикального потенциала нейтрофильных гранулоцитов и гистоморфологических проявлений сепсиса, а также гибель животных свидетельствует об адекватности предлагаемого метода для характеристики функционального состояния анализируемых клеток и прогностических целей.

При использовании способа оценки специфической функции нейтрофилов только по результатам регистрации светосуммы свечения образцов за период инкубации препаратов (способ-прототип) суждение об их способности продуцировать активированные метаболиты кислорода оказалось крайне затруднительным. В условиях нормы светосумма при регистрации интенсивности свечения образцов в течение 30 мин в пересчете на 1000 нейтрофилов варьирует в достаточно широких пределах: при соотношении в реакционной кювете микроб/нейтрофил 10:1 показатели находились в интервале 109 2793, а при соотношении 100:1 96 - 5860 имп./30 мин•1мкл крови•1000 нейтрофилов.

У экспериментальных животных как в 1, так и во II серии опытов не выявлена зависимость, при которой бы снижение показателя светосуммы свечения образцов сопровождалось гибелью животных (расчеты произведены по способу-прототипу). Так, например, в 1 серии экспериментов, где гибель крыс не наблюдалась, в различные сроки с начала опытов зафиксированы низкие значения показателя (светосумма за 30 мин инкубации в пересчете на 1000 нейтрофилов)
116, 118, 103, 163, 168 и т.д. как при создании в реакционной кювете соотношения микроб/нейтрофил 10: 1, так и 100:1. В то же время абсолютные показатели интенсивности свечения за 30 мин инкубации и на 1000 нейтрофильных гранулоцитов при соотношении в реакционной кювете количества микроорганизмов и нейтрофилов 10:1 и 100:1 во II серии экспериментов у животных накануне их гибели были 14757 и 4344, 3109 и 1767, 1714 и 688 соответственно. Видно, что эти показатели как абсолютные величины не имеют прогностического значения и малоэффективны для оценки свободнорадикального потенциала клетки.

Таким образом, вышеизложенное иллюстрирует, что предложенный способ оценки свободнорадикального потенциала нейтрофильных гранулоцитов позволяет более адекватно оценивать этот параметр фагоцитирующих клеток крови и высказывать суждение прогностического характера в связи с генерализацией инфекции и возможной гибелью животных.

Кроме того, метод позволяет исключить необходимость подсчета абсолютного содержания нейтрофилов, что используется в способе-прототипе, так как в предложенном методе рассчитывают коэффициенты в виде отношений параметров, где фактор количества нейтрофилов не имеет значения (при пересчете показателя с учетом числа нейтрофилов в 1мкл крови получают коэффициент, аналогичный таковому без пересчета параметра на число нейтрофилов). Это существенно упрощает методику и исключает необходимость привлечения к исследованию специалистов, владеющих техникой подсчета лейкоцитов.

Другим преимуществом предложенного метода по сравнению со способом-прототипом является исключение этапа изолирования из цельной крови и приготовления взвеси нейтрофилов достаточно трудоемкой процедуры, требующей дополнительного времени, а также исключение предварительной преопсонизации сывороткой донора культуры микроорганизмов, использующихся для индукции респираторного взрыва. В методике, предложенной нами, опсонизация микроорганизмов индукторов респираторного взрыва осуществляется непосредственно в реакционной кювете опсонинами плазмы крови того же биообъекта, нейтрофилы которого исследуются, и индивидуальные опсонизирующие свойства плазмы биообъекта непосредственно влияют на состояние гуморально-клеточной фагоцитирующей системы организма и этот фактор учитывается при расчете свободнорадикального потенциала нейтрофильных гранулоцитов. Такое выполнение метода с нашей точки зрения является более правильным, адекватным и специфичным. Это достигается за счет того, что в реакционную кювету помещают цельную кровь животного, содержащую как нейтрофилы, так и плазму, опсонины которой сорбируются на поверхности внесенных в кювету микроорганизмов.

Существенным преимуществом предложенного метода перед известными является сопоставимость получаемых результатов оценки свободнорадикального потенциала нейтрофилов при использовании для этих целей различной аппаратуры, содержащей фотоэлектронный умножитель, так как для расчета показателя используются не абсолютные значения параметров, которые различаются в зависимости от типа прибора и его конструктивных особенностей, а относительные величины. При этом время наступления максимума свечения образцов является одинаковым при применении различных марок хемилюминометров и этот параметр не зависит от метода его измерения. Следовательно, независимость получаемых результатов от вида использованной аппаратуры для регистрации люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов позволяет в перспективе унифицировать способ и сравнивать результаты исследователей, работающих в различных научных учреждениях и использующих разнообразные приборы.

Предлагаемое техническое решение может использоваться в экспериментальной медицине для оценки способности нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода при изучении гуморально-клеточной системы инактивации патогенных микроорганизмов как в условиях моделирования инфекционного процесса, так и при различной другой патологии, когда вероятность возникновения инфекционного осложнения и генерализации инфекции возможна, например, при ожоговой болезни, а также контроле эффективности лечения этих патологических состояний, апробировании новых лекарственных препаратов и т. п.

Использование: медицина, для определения в эксперименте способности нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода. Сущность: берут пробы крови, инкубируют нейтрофилы в двух параллельных образцах в растворе для поддержания их жизнедеятельности с микроорганизмами-индукторами респираторного взрыва в соотношении 1:100 и 1:10 в присутствии люминола, регистрируют хемилюминесценцию, при этом регистрируют светосумму, максимальную интенсивность и время наступления максимума свечения каждого образца, вычисляют отношение показателя светосуммы свечения образца при соотношении в реакционной кювете нейтрофил/микроб 1:100 к аналогичному показателю при соотношении 1:10 (К₁), таким же путем вычисляют отношение показателей максимальной интенсивности свечения образцов (К₂), определяют сумму показателей времени наступления максимальной интенсивности свечения образцов при соотношении нейтрофил/микроб 1:100 и 1:10 (T_к), рассчитывают свободнорадикальный потенциал нейтрофилов (СПН) по формуле:

и при СПН, равном 22 - 53, оценивают способность нейтрофилов продуцировать активные метаболиты кислорода как нормальную, при СПН, равном 21 - 6 - в пределах нижней границы нормы, а при СПН меньше 6 - как недостаточную. Способ информативен, прост, требует минимальных материальных затрат. 1 табл., 1 ил.

Способ определения в эксперименте способности нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода, включающий забор пробы крови, инкубацию нейтрофилов в двух параллельных образцах в растворе для поддержания их жизнедеятельности с микроорганизмамииндукторами респираторного взрыва в соотношении 1:100 и 1:10 в присутствии люминола, регистрацию хемилюминесценции, отличающийся тем, что регистрируют светосумму, максимальную интенсивность и время наступления максимума свечения каждого образца, вычисляют отношение показателя светосуммы свечения образца при соотношении в реакционной кювете нейтрофил/микроб 1:100 к аналогичному показателю при соотношении 1:10 (К₁), таким же путем вычисляют отношение показателей максимальной интенсивности свечения образцов (К₂), определяют сумму показателей времени наступления максимальной интенсивности свечения образцов при соотношении нейтрофил/микроб 1: 100 и 1:10 (Т_к), рассчитывают свободнорадикальный потенциал нейтрофилов (СПН) по формуле

и при СПН 22 53 оценивают способность нейтрофилов продуцировать активированные метаболиты кислорода как нормальную, при СПН 21 6 в пределах нижней границы нормы, а при СПН < 6 как недостаточную.