СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЫ КРОВИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к технике определения в плазме крови активности антиоксидантной системы, оказывающей регуляторное влияние на интенсивность свободнорадикальных процессов, протекающих в крови как в условиях физиологической нормы, так и при многих патологических состояниях (гипоксия, стресс и т.п.), и может быть использовано в различных областях экспериментальной и клинической медицины, а также биологии.

Известны способы определения антиоксидантной активности (АОА) в плазме крови, основанные на оценке степени торможения переокисления липидов эндогенными антиоксидантами образца в какой-либо модельной системе, например в суспензии липосом, мембранах эритроцитов, гомогенатах мозга (Е.Б.Спектр, А. А. Ананенко, Л. Н. Политова. Лабораторное дело, 1984, N 1, с.26 28). Однако применение таких моделей в клинической лабораторной диагностике ограничивается нестабильностью, нестандартностью и труднодоступностью субстрата.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является метод, разработанный Г.И.Клебановым и соавт. (Лабораторное дело, 1988, N 5, с.59 - 62).

Этот способ осуществляют следующим образом: выделяют плазму, приготавливают субстрат окисления в виде суспензии липопротеидов желтка куриного яйца, реакционную смесь с этим субстратом и после проведения инкубации субстрата окисления с окислителями и антиоксидантами осуществляют определение продуктов реакции.

Данный способ менее трудоемок, чем вышеописанные аналоги, однако на его осуществление требуется все же значительное время. Кроме того, существенным недостатком способа продолжает оставаться использующийся в качестве субстрата окисления биологический материал, которому присущи недостатки, свойственные любым видам биосубстратов, а именно суспензию желточных липопротеидов необходимо готовить по специальной технологии, а срок сохранности приготовленного субстрата очень невелик, так как свойства субстрата неконтролируемо изменяются по мере его хранения. Важным является то, что параметры субстрата окисления также варьируют в зависимости от сезона года, характера питания кур, степени обеспеченности пищи витаминами. Наконец, приведенный способ не дает возможности одновременного определения в образце плазмы крови показателей общей, неферментативно- и ферментативнообусловленной АОА, оценка которых имеет важное значение как в практической медицине, так и в научно-экспериментальных исследованиях.

Задача настоящего изобретения сокращение времени, упрощение и повышение доступности способа, а также повышение его информативности.

Поставленная задача решается за счет того, что в качестве субстрата окисления используют парафенилендиамин, а окислителя пероксид водорода, плазму в равных объемах инкубируют в двух параллельных пробах в реакционных смесях, в одной из которых содержится буфер, парафенилендиамин и пероксид водорода, а в другой аналогичные ингредиенты с азидом натрия, пробы термостатируют в стандартных условиях с контрольными образцами, идентичными по составу первой и второй опытным пробам, но без плазмы крови, после чего в каждой из проб и соответствующих контрольных образцах определяют оптическую плотность, по которой находят общую, неферментативнообусловленную и ферментативнообусловленную антиоксидантную активность плазмы крови.

Благодаря использованию в реакционной смеси в качестве субстрата окисления парафенилендиамина стандартного химического реактива, выпускаемого промышленностью, устраняются элементы неопределенности, неизбежно возникающие при применении субстратов биологической природы, так как концентрация парафенилендиамина может точно дозироваться, а степень его окисления пероксидом водорода, лимитируемого плазмой крови за счет ее антиоксидантных свойств, регистрироваться по изменению оптической плотности реакционной смеси.

Антиоксидантная активность плазмы крови по предлагаемому способу характеризуется степенью инактивации окисления парафенилендиамина пероксидом водорода антиоксидантами плазмы. Увеличение антиоксидантной активности плазмы ведет к снижению окислительных свойств пероксида водорода, что сопровождается уменьшением оптической плотности образца. При низкой антиоксидантной активности торможение окислительных свойств пероксида водорода будет меньшим и оптическая плотность реакционной смеси возрастает. Показатель ингибирования окисления парафенилендиамина пероксидом водорода отражает антиоксидантную активность плазмы.

Использование азида натрия, являющегося блокатором ферментов, позволяет выявить долю антиоксидантной активности плазмы, обусловленную ферментными системами, содержащимися в ней. При этом определяемая антиоксидантная активность без азида натрия характеризует общую антиоксидантную активность, а исследуемая АОА в параллельной пробе с азидом натрия - неферментативнообусловленную, так как в этой пробе ферменты ингибируются. Разность между общей и неферментативнообусловленной АОА отражает ферментативнообусловленную АОА плазмы.

Способ осуществляют следующим образом. Для его реализации используют реактивы:
1. Гепарин на физиологическом растворе 500 ед/мл.

2. Ацетатный буфер (0,4 М, pH 5,5).

3. Парафенилендиамин (водный раствор) 0,5%
4. Пероксид водорода 0,5%
5. Азид натрия (водный раствор) 0,5%
Кровь на исследование в количестве 3,0 мл забирают в пробирку, содержащую 0,3 мл раствора гепарина, и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Полученную плазму используют для выполнения анализа. Готовят следующие образцы (пробы).

Проба 1 (опыт 1).

Используют для определения общей АОА.

1. Ацетатный буфер 4,0 мл
2. Парафенилендиамин 0,5 мл
3. Пероксид водорода 0,05 мл
4. Плазма 0,2 мл
5. Азид натрия 0,5 мл
Примечание: азид натрия добавляют в реакционную смесь после инкубации пробы и тотчас спектрофотометрируют.

Проба 2 (опыт 2).

Используют для определения неферментативнообусловленной АОА.

1. Ацетатный буфер 4,0 мл
2. Парафенилендиамин 0,5 мл
3. Пероксид водорода 0,05 мл
4. Азид натрия 0,5 мл
5. Плазма 0,2 мл
Примечание: азид натрия помещают в реакционную смесь перед внесением плазмы, затем добавляют плазму и образец инкубируют.

Проба 3 (контроль к пробе 1).

Используют для определения интенсивности окисления парафенилендиамина пероксидом водорода при отсутствии в реакционной смеси антиоксидантов (плазмы).

1. Ацетатный буфер 4,0 мл
2. Парафенилендиамин 0,5 мл
3. Пероксид водорода 0,05 мл
4. Азид натрия 0,5 мл
5. Плазма 0,2 мл
Примечание: азид натрия и затем плазму вносят в реакционную смесь после проведения инкубации пробы и тотчас спектрофотометрируют.

Проба 4 (контроль к пробе 2).

Используют для определения интенсивности окисления парафенилендиамина пероксидом водорода в присутствии азида натрия без антиоксидантов (плазмы).

1. Ацетатный буфер 4,0
2. Парафенилендиамин 0,5 мл
3. Пероксид водорода 0,05 мл
4. Азид натрия 0,5 мл
5. Плазма 0,2 мл
Примечание: плазму помещают в реакционную смесь после инкубации пробы и тотчас спектрофотометрируют.

Проба 5 (поправка на плазменные окислители парафенилендиамина).

Показатель оптической плотности пробы 5 вычитают из показателя пробы 2 (опыт 1).

1. Ацетатный буфер 4,0 мл
2. Парафенилендиамин 0,5 мл
3. Плазма 0,2 мл
4. Азид натрия 0,5 мл
Примечание: азид натрия добавляют в реакционную смесь после инкубации пробы и тотчас спектрофотометрируют.

Проба 6 (нулевая проба).

Используют в качестве образца, против которого спектрофотометрируют пробы 1 5.

1. Ацетатный буфер 4,0
2. Парафенилендиамин 0,5 мл
3. Азид натрия 0,5 мл
4. Плазма 0,2 мл
Примечание: азид натрия добавляют в реакционную смесь перед внесением плазмы, затем добавляют плазму и пробу инкубируют.

Все пробы инкубируют в течение 20 мин при 37^oC. При этом необходимо обратить особое внимание на то, что в пробе 1 азид натрия добавляют в реакционную смесь только после инкубации пробы. За счет этого достигается идентичность всех проб по азиду натрия, но последний в пробе 1 не изменяет оптическую плотность образца после завершения инкубации.

Следует учесть, что в пробу 2 азид натрия помещают в реакционную смесь перед внесением плазмы, чтобы предотвратить окисление парафенилендиамина ферментами-антиоксидантами плазмы, например, церулоплазмином, затем добавляют плазму, после чего проводят инкубацию образца.

В пробу 3 плазму вносят в реакционную смесь с целью обеспечения идентичности всех образцов по плазме. Однако для предотвращения влияния антиоксидантов плазмы неферментативной природы на интенсивность окисления парафенилендиамина пероксидом водорода плазму вносят после инкубации пробы и образец тотчас спектрофотометрируют. С аналогичной целью и так же плазму вносят в пробу 4.

В показатель оптической плотности образца 1 вносят поправку на оптическую плотность, обусловленную окислением парафенилендиамина, катализируемым ферментами антиоксидантами плазмы (из оптической плотности пробы 1 вычитают оптическую плотность пробы 5).

После инкубации в пробы 1, 3 и 5 добавляют азид натрия, как описано выше, а в пробы 3 и 4 плазму крови, реакционные смеси перемешивают и с помощью спектрофотометра определяют оптическую плотность каждой из проб (1 5) при длине волны 530 нм. Образцы спектрофотометрируют против нулевой пробы (6).

АОА плазмы рассчитывают по формуле:

Способ определения АОА плазмы крови иллюстрируется следующими примерами.

Изучена АОА плазмы крови у практически здоровых людей (контроль) и пациентов, получивших термическую травму (ожоги средней тяжести, тяжелые и крайне тяжелые ожоги). Кровь у пострадавших от ожогов изучали в период токсемии. Результаты анализа АОА плазмы крови представлены в табл. 1.

Видно, что общая АОА плазмы крови у пациентов с термической травмой снижается более чем в 2 раза по сравнению с практически здоровыми людьми. При этом неферментативнообусловленная АОА падает более интенсивно в 5 раз по сравнению с контролем, в то время как ферментативнообусловленная лишь на 27,5% от уровня нормы. Различия всех анализируемых показателей АОА у здоровых людей и пациентов с ожогами оказались статистически значимыми.

Ниже приведены 2 примера (табл. 2) изменения АОА плазмы крови при добавлении к ней синтетического антиоксиданта дибунола (конечная концентрация препарата составляет 0,25 мг/мл реакционной смеси). Плазма получена из крови больных с термической травмой.

Примеры, приведенные выше, свидетельствуют об адекватности предлагаемого метода: способ позволяет регистрировать изменения АОА плазмы крови, например, наблюдаемые в условиях патологии (табл. 1), а также в модельных системах при индукции этих изменений экзогенными факторами (табл. 2), что в конечном итоге доказывает его достаточную чувствительность и информативность.

При реализации разработанного способа достигается запланированный положительный эффект: способ отличается простотой и доступностью для широкого использования не только в НИИ медико-биологического профиля, но и в клинико-диагностических лабораториях лечебных учреждений, а возможность одновременного получения данных о состоянии общей АОА, ферментативно- и неферментативнообусловленной АОА плазмы крови расширяет диагностическую значимость метода, что позволяет более адекватно проводить коррекцию АОА крови фармакологическими препаратами у тяжелых больных.

Важным отличием предлагаемого метода от способа-прототипа является быстрота его выполнения. Для его реализации требуется около 50 мин, в то время как способа-прототипа 120 130 мин.

Предлагаемая методика может быть использована в области практической и экспериментальной медицины (диагностика тяжести патологических процессов, контроль эффективности проводимых лечебных мероприятий), а также в биологии при изучении воздействия на организм различных неблагоприятных факторов внешней среды, испытании новых лекарственных препаратов-антиоксидантов и т.п.

Способ может быть использован в различных областях экспериментальной и клинической медицины, а также биологии. Получают плазму, приготавливают реакционную смесь с субстратом окисления, в качестве которого используют парафенилендиамин. Плазму инкубируют в равных объемах в двух параллельных пробах в реакционных смесях, в одной из которых содержится буфер, парафенилендиамин и пероксид водорода, в другой - аналогичные ингредиенты с азидом натрия. Пробы термостатируют в стандартных условиях с контрольными образцами, идентичными по составу первой и второй опытным пробам, но без плазмы крови. Определяют оптическую плотность. Отношение разности оптических плотностей первой контрольной пробы и первого опытного образца с учетом поправки к оптической плотности первой контрольной пробы характеризует общую антиоксидантную активность плазмы крови. Отношение разностей оптических плотностей второй контрольной пробы и второго опытного образца к оптической плотности второй контрольной пробы характеризует неферментативнообусловленную антиоксидантную активность. Разность между общей антиоксидантной активностью и неферментативнообусловленной активностью - ферментативнообусловленную антиоксидантную активность плазмы крови. Способ позволяет сократить время, упростить и повысить его информативность. 2 табл.

Способ определения антиоксидантной активности плазмы крови, включающий получение плазмы, приготовление реакционной смеси с субстратом окисления, инкубацию плазмы в реакционной смеси и спектрофотометрическое определение продуктов реакции, отличающийся тем, что в качестве субстрата окисления используют парафенилендиамин, а окислителя пероксид водорода, плазму в равных объемах инкубируют в двух параллельных пробах в реакционных смесях, в одной из которых содержится буфер, парафенилендиамин и пероксид водорода, а другой аналогичные ингредиенты с азидом натрия, пробы термостатируют в стандартных условиях с контрольными образцами, идентичными по составу с первой и второй опытными пробами, но без плазмы крови, после чего в каждой из проб и соответствующих контрольных образцах определяют оптическую плотность, при этом отношение разности оптических плотностей первой контрольной пробы и первого опытного образца с учетом поправки, обусловленной окислением парафенилендиамина испытуемой плазмой без добавления окислителя, к оптической плотности первой контрольной пробы характеризует общую антиоксидантную активность плазмы крови, отношение разностей оптических плотностей второй контрольной пробы и второго опытного образца к оптической плотности второй контрольной пробы характеризует неферментативнообусловленную антиоксидантную активность, а разность между антиоксидантной активностью и неферментативнообусловленной активностью ферментативнообусловленную антиоксидантную активность плазмы крови.