Способ определения малонового диальдегида в крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/52 

. Изобретение относится к технике определения в биологических системах малонового дйальдегида (МДА) для характеристики происходящих в них процессов перекисного окисления липидов, что может быть использовано в различных областях экспериментальной и клинической медицины, а также биологии.

Целью изобретения является устранение существующих недостатков - повышение информационной значимости способа за счет возможности одновременного и раздельного анализа МДА в пла.зме и эритроцитах, а также определения в них антиоксидантной активности, что в конечном итоге позволит более адекватно оценивать состояние процессов ПОЛ в исследуемых биологических системах.

Поставленная цель достигается за счет того, что содержание МДА определяют в двух параллельных образцах, получаемых ; из одного объекта. При этом процесс подготовки к исследованию одного из параллельных образцов осуществляют в присутствии ингибитора свободнорадикальных реакций (антиоксиданта) - этилендиаминтетрауксус- ной кислоты (ЭДТА), являющейся комплек- соном.и связывающей ионы железа, всегда присутствующих в ничтожных количествах в биологических системах и индуцирующих ПОЛ. Кроме того, этот реагент является антикоагулянтом и предотвращает ее свертывание. Конечная концентрация ЭДТА в образце составляет 0,5-1,5 %. Более низкие концентрации реагента могут оказаться недостаточными для полного связывания эндогенных ионов двухвалентного железа,

00

о

2

инциирующих ПОЛ, а использование более высоких концентраций препарата является избыточным и не ведет к улучшению результатов.

Другой параллельный образец готовят в отсутствии антиоксиданта и перед выполнением реакции МДА с ТБК проводят инкубацию образца с активатором свободнорадикальных реакций (проокси- дантом) - стандартным количеством ионов двухвалентного железа (конечная концент- рация реагента - 0,06 %). Время инкубации подбирают экспериментальным путем, чтобы оно было достаточным для прохождения реакции индукции ПОЛ: При работе с образцами крови наиболее подходящим временем инкубации является 30-45 мин; Оба параллельных образца в каждом очередном исследовании всегда инкубируют в одних и Тех же условиях в течеи/йе выбранногр:стан- дартного времени. / ; - :

По окончании инкубации параллельные образцы готовят для выполнения реакции с ТБК и определяют в каждом из них кйпйче4- ство МДА. МДА, выявленный в параллельном образце, содержащем ингибитор своббдиорадикальных реакций (ЭДТА), обозначают как МДА-1, а содержащем про- оксидант (ионы двухвалентного железа) - как МДА-2. Разницу между МДА$ и МДА-1 обозначают как МДА-3. ;;

МДА-1 - пул МДА, образованный в биологической системе в живом организме на момент получения образца (забора крови), вследствие протекающей в ней процессов перекисногр Окисления лйпидов. Целесообразно считать что пул характеризую интенсивность процессов ПОЛ в данной биологической системе. В связи с этим бозра- стание МДА-1 расценивается как активация ПОЛ, а снижение данного показателя - как уменьшение процесса липопероксидации.

МДА-2 - сумма пулов МДА-1 и МДА-3 (см, ниже). Является промежуточным показателем и используется для расчета МДА-3;

МДА-3 -пул МДА, образованный в биб- лог ческрй Системе при индукции ПОЛ стандартным экзогенным активатором сво- брднорадйкальных реакций. Характеризует состояние антиоксидантной системы (анти- оксидантную емкость) и ее способность йнактйвировать ПОЛ. Если ряд различных образцов подвергнуть воздействию стандартного экзогенного активатора перекис- ного окисления лйпидов, то минимальное количество МДА образуется в том образце, который располагает наиболее мощной ан- тйоксйдантной системой, Напротив, максимальное количество МДА-3 будет в биологической системе, имеющей низкие

антиоксидантные возможности. Таким образом, антиоксидантная активность биологической системы оценивается по величине образовавшегося МДА-3 при индукции ПОЛ

стандартным экзогенным активатором свободнорадикальных реакций. Увеличение МДА-3 в сравниваемой однотипной биологической системе следует расценить как снижение антиоксидатных свойств этой системы, что является фактором, способствующим возрастанию свободнорадикальных процессов. Уменьшение МДА-3 в этих условиях будет свидетельствовать о возрастанйи антиоксидантной емкости

биологической системы, что препятствует распространению ПОЛ. Так как зависимость между выявленным количеством МДА-3 и антиоксидантной активностью си- стемы является обратной, то показатель антйоксидатной активности целесообразно выражать в условных единицах - как величину концентрации МДА-3 с отрицательным знаком, что удобно при графическом изображении динайики этого параметра.

При определении МДА в крови (раздельно в плазме и эритроцитах) способ выполняется следующим образом.

Кровь на исследование забирают в 2 пробирки: 1-я пробирка содержит 0,1 мл фйзйояОгичёского раствора в 10 ед гепарина в качестве антикоагулянта; 2-я пробирка - 0,1 мл 5 % ЭДТА на физиологическом растворе. В обе пробирки помещают по 1,0 мл крови (тотчас после ее получения), смесь тщательно переМёщйвают, не допуская образова- НЙЯ сгустков. На всех этапах подготовки образцов не допускается попадание следовых количеств ЭДТА в пробирку с кровью,

Содержащей гепарин.

Кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин; плазму отделяют от эритроцитов, рйтрйцйтарную Массу однократно промывают в 5мл физиологического раствора и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин.

После осаждения эритроцитов физирлоги- еСкий раствор удаляют с 10-15 % поверхностно расположен йых эритроцитов, Отмытые эритроциту гемолизируют дистиллированной водой в отношении 1 : 5 (0,2 мл

седимёнта эритроцитов + 1,0 мл дистиллированнойi воды). ; : ;

Для исследования МДА-1 готовятобраз- ЦЫ плазмы И эритроцитов, которые были в контакте с ЭДТА: 1-ю пробирку помещают

0,4 Мл плазмы, а во 2-ю - 0,4 мл гемолизата Эритроцитов. В каждую пробирку добавля- ютО,1 млб % ЭДТА(конечная концентрация -1%), Образцы перемешивают и оставляют на 30 мин при 37° С (или термостатирование

проводят при постоянном легком покачивании проб).

Для исследования МДА-2 используют плазму и эритроциты образца крови, в котором в качестве антикоагулята был использо- ван гёпарин: в 1-ю пробирку помещают 0,4 мл плазмы, а во 2-ю - 0,4 мл гемолизата эритроцитов; в обе пробирки добавляют по 0,1 мл свежеприготовленного 0,28 %-ного водного раствора сернокислого железа (конечная концентрация -0,06 %). Смесь перемешивают и термостатируют в течение 30 мин, как описано выше.

По истечении времени инкубации во все пробирки добавляют по 2,5 мл дистиллированной воды.и 1,0 мл 20 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ), Образцы тщательно перемешивают.

К образцам, содержащим ЭДТА и сернокислое железо, готовят контроли, против; которых необходимо колориметрировать соответствующие пробы. Контроль, к образцам крови с ЭДТА: 0,1 мл 5 % ЭДТА + 2,9 мл дистиллированной воды + 1,6 мл 20 %ТХУ + 0,1 мл 0.6 % ТБК. Контроль к образцам крови без ЭДТА: 0,1 мл 0,28 % водного раствора сернокислого железа + 2,9 мл дистиллированной воды +1,6 мл ТХУ + 1,0 мл 0,6% ТБК

Все образцы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. В высокие цилиндрические пробирки помещают по 1,0 мл 0,6 % свежеприготовленной ТБК на дистиллированной воде и приливают надосадочную жидкость после центрифугирования образцов. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 30 мин, посл,е чего быстро охлаждают и производят спектрофотрметрического исследование при длине волны 535 нм; при этом используют соответствующий контрольный раствор, против которого крлори- метрируют образец.

. Расчет количества МДА в образцах плазмы крови производят по формуле:

А

106 5

1,58 -10й -0,4

80,13,

где А - содержание МДА в мкмоль/л) или нмоль/мл)в плазме; 10- коэффициент для пересчета концентрации исследуемого вещества в мкмоль/л; 5 - конечный объем реакционной смеси (мл); 0,4 - объем плазмы, взятый на анализ (мл); 1,56-10 -коэффициент молярной экстинкции ТБК-комплекса (моль см - л); Еоп - оптическая плотность исследуемого раствора по показанию спектрофотометра; 80,13 - пересчетный коэффициент.

Количество МДА в растворах эритроцитов рассчитывают аналогично за тем исключением, что в знаменателе объем седимента эритроцитов составляет 0,066 мл (с учетом разведения седимента эритроцитов водой 1 : 5 и использовали для анализа 0,4 мл гемолизата эритроцитов):

А ЕС

480,80,

где А - содержание МДА в мкмоль/л (или нмоль/мл) седимента эритроцитов, приготовленного при стандартных условиях осаждения клеток.

МДА-3 определяют как разность МДА-2 и МДА-1 (для плазмы и эритроцитов соответственно.

Пример. В плазме и эритроцитах белых крыс исследована интенсивность

процессов ПОЛ и состояние антиоксидат- ной активности этих систем в динамике течения ожоговой болезни (см. табл.). Показано, что интенсивность ПОЛ в плазме крови животных, выявленная по результатам анализа МДА-1, имеет сильную положительную корреляцию с динамикой этого процесса, определенного другим (известным) способом у этих же животных - путем исследования концентрации диеновых

конъюгатов методом спектрофотометрии при 232 нм(,95).

Выявлено, что антиоксидантная активность в плазме крови обожженных крыс в процессе течения ожоговой болезни по данным определения МДА-3 имеет колебательный характер, а величины МДА-3, характеризующие этот параметр, имеют отрицательную корреляционную зависимость средней степени (г - 0,57) с показателями,

полученными при исследовании образцов методом ЭПР-спектроскопии (отношение ЭПР-сигналов церулоплазмина и трансфер- рина сыворотки крови у тех же крыс). То есть, максимальные значения МДА-3, обнаруженные по предложенному,способу, соответствуют минимальным значениям отношения ЭПР-сигналов церулоплазмина к трансферрину. Таким образом, вышеизложенное позволяет заключаить, что возрастание концентрации МДА-3 соответствует снижению антиоксидантной активности исследуемой системы. Вероятно, более низкий уровень коэффициента корреляции, найденного для МДА-3, по сравнению с таковым для МДА-1, можно объяснить тем, что если концентрация МДА-3 отражает состояние общей антиоксидантной активности исследуемой системы, то отношение ЭПР - сигналов церулоплазмин/трансферрин только лишь часть антиоксидантного механизма, хотя и имеющего наиболее важное значение в сыворотке крови(т. е. систему церулоплазмин-трансферрин).

Сильная положительная корреляция (г .+ 0,76) показана для МДА-1 эритроцитов в сопоставлении с другим методом определения продуктов ПОЛ и характеризующим активность этого процесса - регистрацией конечных продуктов ПОЛ (шиффовых оснований) с помощью спектрофлуор иметра (см.

табл.).

МДА-3 в эритроцитах имеет среднюю отрицательную корреляцию (г - 0,46) с активностью фермента, обеспечивающего в этих клетках наряду с другими энзимами антиоксидантный эффект, что также доказывает обратную зависимость между концентрацией в эритроцитах МДА-3 и антиоксидантной активностью системы за счет супе роксиддисмутазы (СОД): возрастание МДА-3 наблюдается при падении СОД, а его снижение - при подъеме активности этого фермента. Так как СОД является лишь частью антиоксидантной системы, связанной с инактивацией ПОЛ в эритроцитах, то, по-видимому, так же, как и в плазме, что объясняет средний уровень корреляции показателей, выявленный при анализе материала, полученного на одних и тех же животных.

Таким образом, рассмотренный пример свидетельствует о достижении положительного эффекта при применении предложенного метода определения МДА для характеристики в крови интенсивности процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы.

Способ может быть полезен и использован как в области практической (диагностика глубины и тяжести патологических процессов, сопровождающихся интенсификацией процессов перекисного окисления липидов), так и экспериментальной медицины и биологии, например, при исследовании и оценке фармакологических эффектов лекарственных препаратов-антиоксидантов,

различных физических факторов воздействия на организм, а также в токсикологии, радиобиологии и онкологии.

Формула изобретения

Способ определения малонового диаль- дегида в крови, включающий отбор крови, разделение плазмы и эритроцитов, добавление к исследуемой пробе раствора сернокислого железа в конечной концентрации 0,06 % и тибарбитуровой кислоты, нагревание смеси с последующим спектрофотомет- рическим определением окрашенного

продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения информативности за счет возможности одновременного анализа интенсивности перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитах, а также

характеристики состояния антиоксидантной активности этих систем, отбор крови производят в двух параллельных пробах, в первой в качестве антикоагулянта используют этилендиаминтетрауксусную кислоту, а

во второй - гепарин, затем разделяют плазму и эритроциты, проводят гемолиз эритроцитов, в первую пробу плазмы и гемолизата эритроцитов добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту до конечной концентрации 0,5-1,5 %, во вторую пробу плазмы и гемолизата эритроцитов - сернокислое железо, пробы термоститируют, осаждают белок, после чего в образцах плазмы и гемолизата эритроцитов, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту, определяют малоновый диальдегид, нарастание которого свидетельствует о возрастании интенсивности процессов перекисного окисления липидбв, а также разность

оптической плотности второй и первой пробы соответственно в плазме и гемолизате эритроцитов и рассчитывают концентрацию малонового диальдегида, причем ее увеличение свидетельствует о снижении, а уменьшение - о возрастании антиоксидантной активности системы.

. Усредненные показатели для характеристики интенсивности ПОЛ и антиоксидантной активности в плазме и эритроцитах белых крыс в динамике течения ожоговой болезни, полученные по предлагаемому способу и в сравнении .с другими известными методами определения : этих параметров

Использование: медицина, способы определения в биологических системах малонового дйальдегида (МДА). Цель изобретения - повышение информативности способа за счет возможности одновременного анализа интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме и эритроцитов, а также характеристики состояния антиоксидантной активности. Сущность изобретения: определяют МДА раздельно в двух образцах одного объекта, причем в ОДНО.М из них - после инкубации образца с ингибитором свободнорадиаль- ных реакций, например, ЭДТА-МДА-1, а в другом при активации перекисного окисления, например, ионами двухвалентного железа - МДА-2, -рассчитывают МДА-3, как (МДА-2)-(МДА-1) эндогенного активатора перекисного окисления липидов МДА- 1/МДА-3 и интегрального индекса интенсивности перекисного окисления липидов, представляющего собой (МДА-1) (МДА-3) (МДА-1/МДА-3), по которому судят либо о возрастании, либо об уменьшении перекисного окисления липидов в биологической системе. 1 табл, (Л С

1 МДА-1 (интенсивПримечание: в скобках указано количество исследованных животных