Изобретение относится к технике определения в сыворотке крови интенсивности свободнорадикальных процессов, что может быть использовано в различных областях экспериментальной и практической медицины для оценки тяжести некоторых заболеваний и контроля эффективности проводимого лечения.
Известен способ определения уровня свободнорадикальных реакций в сыворотке крови путем регистрации спонтанной хемилюминесценции препарата с помощью фотоэлектронного умножителя (Журавлев А.И. Журавлева А.И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и ее значение в комплексной диагностике. М. Медицина, 1975, с. 126).
Однако метод имеет недостатки, заключающиеся в том, что при регистрации сверхслабого свечения с помощью фотоэлектронного умножителя получают несопоставимые между собой результаты за счет использования хемилюминометров различной конструкции, в которых замеряемые результаты представляются в различных единицах. Кроме того, при оценке интенсивности свободнорадикальных реакций в сыворотке крови не учитывается антиоксидантный резерв анализируемой системы, от уровня которого может зависеть свободнорадикальный потенциал образца.
Целью изобретения является повышение информативности параметра за счет выполнения дополнительного анализа антиоксидантного резерва сыворотки крови и достижение сопоставляемости результатов, полученных с помощью различных типов приборов.
Способ осуществляют следующим образом.
Сыворотку крови анализируют в двух параллельных пробах. В первой пробе регистрируют интенсивность хемилюминесценции образца с помощью фотоэлектронного умножителя. Полученные данные в абсолютных единицах интенсивности свечения препарата относят к аналогичному показателю (среднеарифметическая величина), найденному заранее у здоровых (интактных) биообъектов того же вида. Полученный относительный показатель (K1) характеризует меру отличия интенсивности сверхслабого свечения сыворотки крови у обследуемого объекта по отношению к норме. Во второй пробе сыворотки того же биообъекта определяют активность церулоплазмина, за счет которого обеспечивается основная доля антиоксидантного резерва сыворотки крови. Результаты определения активности церулоплазмина также выражают через относительную величину (отношение активности фермента в абсолютных единицах у данного биообъекта к аналогичному параметру (усредненная величина) у интактных биообъектов (K2. Соотношение между собой относительных величин K1 и K2 характеризует свободнорадикальный потенциал анализируемой биологической системы (K3), который определяют по формуле:
K3=K1/K2,
где
K1, K2 и K3 как описано выше.
Основанием для возможности расчета K3 как K1/K2 явились результаты корреляционного анализа связи между интенсивностью хемилюминесценции образцов сыворотки (K1) и активностью церулоплазмина (K2) в эксперименте на белых крысах. Было обнаружено, что зависимость между этими признаками имеет обратный характер. Корреляционный анализ усредненных величин K1 и K2 у 3-х групп животных (интактные животные, крысы, получившие высокую и низкую дозу патогенных микроорганизмов) показал, что эта зависимость проявилась при r -0,894. Возрастание активности церулоплазмина в сыворотке крови сопровождается ослаблением в ней свободнорадикальных реакций. Напротив, снижение активности церулоплазмина - усилением процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ).
У здоровых животных как относительный показатель интенсивности свободнорадикальных реакций сыворотки крови (K1), так и активности церулоплазмина (K2) приближаются к единице. Крысы, подвергнутые экспериментальному воздействию, имеет варьирующие показатели в зависимости от индивидуальной реакции животных на введение одинаковой и разной дозы патогенных микроорганизмов. При значении коэффициента K3 близким к единице можно полагать, что анализируемая система по исследуемым параметрам в достаточной мере сбалансирована. Значение коэффициента K3 выше единицы свидетельствует о преобладании в сыворотке свободнорадикальных реакций, которые в той или иной степени не компенсируются антиоксидантным механизмом. Величина K3 ниже единицы отражает увеличение антиоксидантного резерва сыворотки крови. При снижении коэффициента антиоксидантный резерв сыворотки возрастает, а свободнорадикальный потенциал падает.
Вышеизложенное иллюстрируется примером. В эксперименте белым крысам индуцировали инфекционный процесс различной степени тяжести путем введения животным под кожу взвеси суточной культуры синегнойной палочки в дозе 0,25•109 микробных тел (1 серия опытов) или 1,0•109 микробных тел (II серия). Микроорганизмы в соответствующей дозе вводили крысам 3 дня подряд, при этом суммарная доза заражения животных в I серии опытов составила 0,75•109, а во II 3,0•109 микробных тел, то есть, как однократная, так и суммарная доза заражения во II серии экспериментов была в 4 раза выше, чем в I. Через 3 сут с начала инфицирования животных выводили из эксперимента. Из крови отделяли сыворотку, в которой определяли интенсивность спонтанной хемилюнесценции с помощью хемилюминометра ХЛМ1Ц-01, а также активность церулоплазмина по методу Ревина. Полученные результаты были подвергнуты статистическому анализу.
В таблице приведены усредненные значения коэффициентов K3 интактных и инфицированных культурой синегнойной палочки белых крыс. Значение K3 у интактных животных составляет 0,978 и близко к единице. Аналогичный показатель у крыс, получавших меньшую дозу патогенных микроорганизмов, оказался несколько ниже по сравнению с исходными данными (-9,0%). Полученная величина свидетельствует о некотором увеличении антиоксидантного резерва, обусловленного большей активностью церулоплазмина в сыворотке крови по сравнению с интактными животными. Усредненный K3 у животных, которым вводили высокую дозу культуры синегнойной палочки, отражает явный сдвиг оксидантно-антиоксидантных реакций в сторону существенного повышения свободнорадикальных процессов, истощающих резерв антиоксидантного механизма.
В качестве примера результаты, полученные при исследовании рассмотренных выше параметров в условиях наших экспериментов, могут быть представлены и интерпретированы следующим образом.
У одной из крыс после введения низкой дозы патогенных микроорганизмов (I серия опытов) K1 составляет 1,180, что свидетельствует о незначительном повышении интенсивности свободнорадикальных реакций в сыворотке крови в условиях опыта по сравнению с таковыми у контрольных животных. Коэффициент K2 оказался равным 1,189. Это характеризует активность церулоплазмина у данного животного также на уровне несколько выше нормы. Соотношение K1 и K2(K3) составило 0,992 (1,180/1,189). Можно полагать, что оксидантно-антиоксидантная системы сыворотки крови у этой крысы сбалансирована. Уровень процессов перекисного окисления липидов и активность церулоплазмина находится в пределах нормы.
Другой пример иллюстрирует существенный сдвиг оксидантно-антиоксидантного соотношения по данным расчета K3 в сторону преобладания в сыворотке крови свободнорадикальных процессов у крысы, которой вводили высокую дозу патогенных микроорганизмов (II серия экспериментов): 3,220/1,058 (3,043), где значения коэффициентов K1, K2 и K3 записаны как K1/K2(K3). Видно, что резкое возрастание процессов ПОЛ в сыворотке крови протекает на фоне незначительного повышения активности церулоплазмина. Вероятно, антиоксидантной гомеостатический механизм оказался неадекватным интенсивности прооксидантов, запускающих цепную реакцию свободнорадикального окисления.
Помимо повышения информационной значимости метода, предлагаемый способ оценки соотношения интенсивности свободнорадикальных процессов в сыворотке крови и антиоксидантного резерва в этой системе посредством расчета и представления получаемых данных в виде безразмерных (относительных) величин позволяет использовать для выполнения анализов любую аналитическую аппаратуру, предназначенную для этих целей. Существенным преимуществом такой методики является стандартизация получаемых данных, их сопоставимость между собой вне зависимости от того, в каких единицах получена первичная информация. В конечном итоге это позволяет сравнивать результаты, получаемые в различных учреждениях, что может быть широко использовано не только в экспериментальной, но и практической медицине.
Использование: медицина, для оценки способности плазмы крови продуцировать свободные радикалы. Сущность: берут пробы крови, определяют интенсивность хемилюминесценции в опытной и контрольной пробах, вычисляют коэффициент K1 как отношение интенсивности хемилюминесценции в опытной пробе к контрольной, параллельно определяют активность церулоплазмина, вычисляют коэффициент K2 как отношение активности церулоплазмина в опытной пробе к контрольной, вычисляют значение коэффициента K по формуле:
K3=K1/K2,
и при значении K3 меньше 1 оценивают способность плазмы крови продуцировать свободные радикалы как пониженную, равном 1 - как нормальную, выше 1 - как повышенную. Способ позволяет стандартизировать результаты, полученные в различных учреждениях. 1 табл.
Способ оценки способности плазмы крови продуцировать свободные радикалы, заключающийся в том, что берут пробы крови, определяют интенсивность хемилюминесценции в опытной и контрольной пробах, вычисляют коэффициент К1 как отношение интенсивности хемилюминесценции в опытной пробе к контрольной, параллельно определяют активность церулоплазмина, вычисляют коэффициент К2 как отношение активности церулоплазмина в опытной пробе к контрольной, вычисляют значение коэффициента К3 по формуле
К3 К1/К2,
и при значении К3 < 1 оценивают способность плазмы крови продуцировать свободные радикалы как пониженную, при К3 1 как нормальную, К3 > 1 как повышенную.
