СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАННЕГО СКРЫТОГО СИФИЛИСА И ЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ КРОВИ НА СИФИЛИС Российский патент 2000 года по МПК G01N33/571 

Изобретение относится к медицине, а именно к венерологии, и может применяться для дифференциальной диагностики ложноположительных серологических реакций крови на сифилис и раннего скрытого сифилиса.

Сифилис - инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (БТ) и передающееся преимущественно половым путем. В классическом варианте диагноз манифестной формы сифилиса устанавливается на основании клинической картины заболевания, нахождения возбудителя в отделяемом с поверхности сифилидов, положительных результатов серологического исследования крови.

В последние годы в связи с повсеместным ростом заболеваемости сифилисом увеличилось и число его скрытых форм. При этом ранний скрытый сифилис (РСС) стал регистрироваться значительно чаще, чем поздний и неуточненный и составляет до 60-96% всех больных латентной формой заболевания (К.К. Борисенко и соавт., Вестник дерматол. и венерол., 1989, 11, 25-29). По данным E.B. Соколовского (Е.В. Соколовский Серологическая резистентность после лечения сифилиса. Автореф. дисс. на соиск. учен. степ. докт. мед. наук, Санкт-Петербург, 1995), удельный вес РСС вырос с 1991 по 1994 год в 1,2 раза. Частота же регистрации позднего скрытого сифилиса снизилась в 6 раз. Установить диагноз РСС с помощью обычных критериев не представляется возможным, и он базируется почти исключительно на данных серологического обследования. Вместе с тем при разноречивых или слабоположительных результатах серологических тестов, отсутствии данных конфронтации и анамнестических указаний на наличие в недавнем прошлом клинических проявлений инфекции постановка этого диагноза вызывает большие затруднения. Сложной в этих условиях представляется дифференциация РСС с так называемыми ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис (ЛПР), когда специфическая инфекция в организме отсутствует, а серологические реакции дают положительный результат.

ЛПР на сифилис нередко наблюдаются у пациентов с соматическими, инфекционными заболеваниями, диффузными болезнями соединительной ткани, интоксикациями и другими патологическими, а также физиологическими (беременность, менструация, старческий возраст) состояниями. Причины их появления до сих пор остаются дискутабельными.

К настоящему времени известен ряд методов специфической серодиагностики сифилиса, применяемых для уточнения диагноза при манифестных формах сифилиса и в целях дифференциации скрытых форм заболевания и ЛПР (Н.М. Овчинников, В. Н. Беднова, В.В. Делекторский. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем М., 1987, 126-157). Это реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), предусматривающая обнаружение антител-иммобилизинов, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), определяющая количество флюоресцирующих антител и, наконец, предложенный одним из последних иммуноферментный анализ (ИФА), выявляющий антитела к бледной трепонеме, сходные с антителами РИФ. Все перечисленные реакции могут быть отнесены к аналогам данного изобретения, т.к. предполагают иммунологическое исследование крови путем определения специфических противотрепонемных антител. Вместе с тем в последние годы стало известно, что каждая из них может давать ложноположительные результаты (Неспецифические положительные результаты серологических реакций на сифилис, количественные модификации современных серологических реакций. Методические рекомендации, М. , 1980, 20 с.). Кроме того, специфическая серодиагностика сифилиса, основанная на использовании реакций гуморального типа, занимает много времени. Так, постановка РИТ после получения антигена с последующим чтением результатов укладывается в 22-24 часа (меланжерный метод), РИФ - в среднем в 7 часов, ИФА с предварительной сенсибилизацией планшета антигеном - в 20 - 22 часа, без сенсибилизации - в 2 - 3 часа (в зависимости от квалификации персонала).

Таким образом, неясность происхождения ЛПР на сифилис, трудность их дифференциации со скрытыми формами сифилиса вызывает необходимость поиска новых критериев дифференциальной диагностики специфической и неспецифической серопозитивности, включающих иммунологическое исследование крови с иными принципами постановки реакции. Одним из таких критериев может быть реактивность фагоцитов периферической крови, преобладающими среди которых являются нейтрофильные гранулоциты.

Нейтрофилы высокочувствительны к разнообразным нарушениям внутренней среды и давно служат их индикатором (А.Н. Маянский и соавт., Журн. мед. микробиол. , и эпидемиол., 1987, 7, 109-115). Стремление улучшить диагностические тесты, основанные на лейкоцитарных реакциях, привело к разработке многочисленных способов маркировки функционального раздражения нейтрофила. Среди них большое внимание привлекает изучение их респираторного аппарата. Включаясь в процесс фагоцитоза возбудителя, нейтрофильные гранулоциты реализуют его с помощью заложенных в них механизмов биоцидности, связанных с образованием и выделением активированных форм кислорода.

Из числа известных методов регистрации кислородзависимого метаболизма нейтрофилов наиболее чувствительным является люминолзависимый хемилюминесцентный метод (А. Н. Маянский. В кн.: Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. Горький. 1989, 5-15). Он основан на регистрации квантов света, возникающих в процессе свободно-радикального окисления вследствие образования активных форм кислорода, с помощью фотоэлектронных устройств. Энергия, приводящая к электронному возбуждению и излучению света, выделяется в процессе быстрого распада тетраоксида - одного из нестойких промежуточных продуктов свободно-радикального окисления насыщенных жирных кислот. Основными излучателями - эмиттерами хемилюминесценции являются кетоны в триплетном состоянии и синглетный кислород.

Спонтанная хемилюминесценция (ХЛ) клеток наблюдается без их стимуляции и отражает исходное состояние метаболических процессов (Ю. А. Владимиров Сверхслабое свечение при биохимических реакциях М., 1966. 102 с, А.И. Журавлев, А.И. Журавлева Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике M., 1975, 128 с). Оно связано, по-видимому, в первую очередь с образованием липидных свободных радикалов в ходе реакций перекисного окисления липидов в биологических мембранах (Ю.А. Владимиров, А.И. Арганов. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах М., 1972, 252 с).

В ходе реактивной или индуцированной ХЛ лежит мобилизация кислорода, его прямое или опосредованное вовлечение в образование высокореактогенных молекул. При этом в зависимости от задач исследователя в систему с изучаемой реактивной ХЛ могут быть введены различные типы индукторов. Результаты индуцированной ХЛ нейтрофилов свидетельствуют об их готовности к индикации дестабилизирующих воздействий (А.В. Резайкина и соавт., 1997, Вести. дерматол. и венерол. 1997, 2, 39-41), к числу которых при сифилисе может быть отнесена бледная трепонема - возбудитель инфекции.

Недавно проведенные исследования (А.В. Резайкина и соавт., 1997) показали, что биохемилюминесцентный (БХЛ) метод может быть использован для оценки реактивности нетрофилов у больных сифилисом. Авторами обнаружено достоверное (p<0,05) возрастание показателей спонтанной БХЛ у больных манифестным, в особенности вторичным свежим сифилисом наряду с отсутствием изменений индуцированной БХЛ. В качестве индуктора был применен опсонизированный зимозан (03). Сведений о состоянии БХЛ фагоцитов периферической крови при раннем скрытом сифилисе и у лиц с ЛПР на сифилис в литературе не обнаружено.

Целью данного изобретения является повышение точности и упрощения способа дифференциальной диагностики ЛПР и РСС, сокращение времени исследования.

Указанная цель достигается тем, что в периферической крови пациента, взятой из пальца, определяется активность фагоцитирующих клеток крови методом люминолзависимой БХЛ с использованием специфического (живая взвесь бледной трепонемы, 1-я проба) и неспецифического (опсонизированный зимозан, 2-я проба) индукторов фагоцитоза и при значении соотношения уровней светосуммы БХЛ в 1-й пробе ко 2-й (индекс специфического изменения БХЛ) более 1,1 диагностируется ранний скрытый сифилис, а при значении менее 1,1 - ложноположительный результат серологических реакций на сифилис.

В качестве прототипа был выбран метод, наиболее часто используемый для дифференциации РСС и ЛПР на сифилис, являющийся "золотым стандартом" специфической серодиагностики сифилиса - РИФ абс. В сравнении с прототипом предлагаемый способ позволяет повысить точность дифференциальной диагностики ЛПР на 15%, упростить ход исследования и сократить его время с 7 до 1,5-2 часов.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирки, содержащие 4,95 мл раствора Хенкса, набирают 0,05 мл крови из пальца (разведение 1: 100) с гепарином (10 ЕД/мл). Люминол готовят из расчета 17,8 мг на 100 мл физиологического раствора с добавлением 1,5 мл 1н. КОН.

В качестве неспецифического индуктора БХЛ используют зимозан, опсониэированный пулом сывороток доноров.

В качестве специфического индуктора БХЛ применяется живая взвесь БТ, полученных из яичка кролика при раннем сифилитическом орхите (7-9 суток после заражения), используемая для постановки РИТ и РИФ (Н.М. Овчинников и соавт, В кн.: Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем, М, 1987, с. 146-148). Взвесь разводится стерильным физ. раствором до концентрации 15-25 особей в поле зрения. Указанное количество ВТ выбрано нами на основании данных литературы: известно, что чувствительность реакций, в частности РИТ и РИП, снижается при увеличении количества возбудителя (Н.М. Овчинников и соавт., 1987), а также опытным путем: установлено, что данная концентрация спирохет является оптимальной и не подавляет хемилюминесцентный ответ фагоцитов. Нами выявлена также возможность использования в реакции не только полученных в день постановки БТ, но и предварительно замороженных и помещенных в пробирки возбудителей.

При изучении реактивности фагоцитов используют следующие комбинации проб: 1 мл крови в разведении 1:100, 0,1 мл люминола и 0,1 мл раствора Хенкса - контроль; 1 мл крови в разведении 1:100, 0,1 мл люминола и 0,1 мл индуктора (03 или взвесь БТ) - опыт.

Пробы с люминолом выдерживают в термостате при 37^oC в течение 15 мин, после чего к ним на 5 мин добавляется соответствующий индуктор (опыт) или раствор Хенкса (контроль).

Хемилюминесцентный ответ фагоцитов регистрируют в течение 60 мин с 10-минутными интервалами. БХЛ каждой пробы измеряется в течение 30 с и записывается как светосумма свечения за 30 с; подсчитывается среднее значение БХЛ по результатам 7-ми измерений. Полученные данные переводятся в число импульсов за 1 мин измерения (умножаются на 2). Для удобства расчетов последняя величина уменьшена в 10 000 раз.

Учет результатов реакции проводится путем вычисления средней величины результатов всех 7-ми измерений за 60 мин (спонтанная БХЛ, имп/мин) и подсчета индекса специфического изменения БХЛ (ИСИ бхл), который рассчитывается следующим образом:

С помощью предлагаемого способа в сифилидологическом отделении Нижегородского НИКВИ обследовано 16 больных ранним скрытым сифилисом и 26 лиц с ложноположительными серологическими реакциями на сифилис. Диагноз устанавливался на основании общепринятых анамнестических, клинических и серологических критериев. Контролем служили данные измерения БХЛ у 10 здоровых лиц.

Проведенные исследования выявили, что средний уровень ИСИ бхл у больных РCС достоверно превышал соответствующие значения у лиц с ЛПР (p< 0,001, табл. 1).

Колебания показателя (М±1 σ) в группах здоровых, лиц с ЛПР и больных с РСС составили соответственно 0,44 - 0,88; 0,46 -1,08; 1,14 - 5,06.

В связи с тем, что различия в значении изучаемого показателя между здоровыми и лицами с ЛПР были недостоверны (р>0,05), а данные клинического и серологического наблюдения в динамике позволили установить этим пациентам ЛПР, за отрицательный результат теста было принято считать его значения ниже 1,1, что соответствовало верхней границе показателя у лиц с ЛПР. Посколько значение 1,1 практически (после округления цифры) совпадало с нижней границей колебания ИСИбхл у больных РСС, данный результат (1,1) предложено считать сомнительным и при его выпадении исследование повторить.

Специфичность предлагаемого теста при обследовании здоровых (число отрицательных результатов) составила 90% чувствительность у больных РСС (число положительных результатов) - 81,3%.

Сравнительный анализ предлагаемого способа и известного (РИФабс) представлен в табл. 2.

Как видно из данной таблицы, предлагаемый способ дифференциальной диагностики позволяет достигнуть положительного эффекта, который выражается в том, что точность дифференциальной диагностики ЛПР возрастает с 73% при использовании известного способа до 88% при использовании предлагаемого.

Пример 1.

Больная Ж., 21 года, история болезни N 1426, не замужем, имеет случайные половые связи, выявлена при мед. осмотре. Объективно: кожные покровы, половые органы, слизистые оболочки, перианальная область от специфических высыпаний свободны. Патологии внутренних органов не выявлено. Результаты серологического исследования крови: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1: 40, с трепонемным антигеном 4+, (титр 1:160, микрореакция 4+, титр 1:16, РИТ - 24%, РИФабс и РИФ 200 по 4+, ИСИбхл 2,3 (>1,1). Больной установлен диагноз сифилиса раннего скрытого серопозитивного.

У данной пациентки с классической серологической картиной скрытого сифилиса имеет место типичное для данного заболевания изменение ИСИбхл.

Пример 2.

Больной P. , 76 лет консультирован амбулаторно, (N 566), женат, посторонних половых связей не имеет. Клинических данных за сифилис нет. Выявлена соматическая патология: хронический холецистит, хронический гастрит, хронический панкреатит, облитерируюший эндартериит, гипертоническая болезнь, аденома предстательной железы. Данные серологического обследования: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1:5, КСР с трепонемным антигеном отрицательная, микрореакция 4+, титр 1: 4, РИТ 16%, РИФабс и РИФ 200 - отрицательные. Значение показателя ИСИбхл 0,9 (<1,1). Больному установлен диагноз: ложноположительные серологические реакции крови.

У данного пациента с типичной клинико-серологической картиной, свидетельствующей о ложной позитивности серологических реакций (обширная внутренняя патология, пожилой возраст, отсутствие "полового" анамнеза, невысокие титры КСР с кардиолипиновым антигеном и микрореакции, отрицательные КСР с трепонемным антигеном, РИТ и РИФ) значения ИСИбхл соответствуют выявленным у подобных пациентов, что подтвердило клинический диагноз.

Пример 3.

Больной А. , 23 года, история болезни N 1094, холост, выявлен при мед. осмотре. Половая жизнь с разными (случайными) половыми партнершами. Объективных клинических данных за сифилис не обнаружено. Данные серологического обследования: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1:20, с трепонемным антигеном 4+, титр 1:40, микрореакция 4+, титр 1:16, РИТ 26%, РИФ абс и РИФ 200 по 2+, ИСИбхл 2,6 (>1,1). Осуществлялась дифференциальная диагностика между ранним скрытым сифилисом и ложноположительными серологическими реакциями на сифилис (РИТ сомнительная, РИФ - слабоположительные). ИСИбхл положительный (2,6, т.е.> 1,1), что дало возможность поставить диагноз раннего скрытого сифилиса и назначить адекватное лечение.

Пример 4.

Пациентка Л., 29 лет, замужем, амбулаторный N 565. Обратилась в связи с колебаниями серологических реакций крови, которую регистрируются у нее периодически (в том числе во время беременности) с 1987 года. Половая жизнь только с мужем, сопутствующее заболевание: варикозная болезнь. При осмотре объективных данных за сифилис не выявлено. Данные серологического обследования: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1:5, с трепоноемным 4+, титр 1: 4, РИТ 32%, РИФабс 2+, РИФ 200 отрицательная. ИСИбхл 0,2 (< 1,1). В связи с сомнительными данными серологического обследования (слабоположительные РИТ и РИФабс) проводилась дифференциальная диагностика с ранним скрытым сифилисом. Результат ИСИбхл оказался отрицательным, что позволило установить у пациентки ложную позитивность серологических реакций крови.

Таким образом, учитывая достаточно высокую для реакций клеточного типа чувствительность (81,3%) и специфичность (90%) предлагаемого способа, его информативность (число положительных результатов ИСИбхл в группе лиц со скрытым сифилисом более чем в 6 раз превышало число аналогичных показателей у пациентов с ЛПР), быстроту постановки (1,5 часа от момента взятия крови), малую травматичность (кровь берется из пальца), а также повышение точности диагностики ЛПР на 15% в сравнении с прототипом, можно рекомендовать его использование для дифференциальной диагностики истинной и ложной серопозитивности у пациентов с РСС и ЛПР. Способ может быть дополнением к имеющимся методам исследования в трудных случаях.

Изобретение относится к медицине, а именно к венерологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики ложноположительных серологических реакций крови на сифилис и раннего скрытого сифилиса. У пациента берут кровь из пальца с гепарином (10 ЕД/мл), разводят в растворе Хенкса 1:100 и определяют активность фагоцитирующих клеток крови методом люминолзависимой биохемилюминесценции. Анализ проводят с применением специфического индуктора, в качестве которого используют живую взвесь бледной трепонемы (1-я проба), и неспецифического индуктора, в качестве которого используют опсонизированный зимозан (2-я проба). При значении соотношения уровней биохемилюминесценции в 1-й пробе ко 2-й более 1,1 диагностируют ранний скрытый сифилис. При значении соотношения ниже 1.1 диагностируют ложноположительный результат серологических реакций на сифилис. Способ позволяет повысить точность диагностики ложноположительных серологических реакций на сифилис на 15% и сократить время исследования на 5-6 ч. 2 табл.

Способ дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса ложноположительных серологических реакций крови на сифилис, включающий иммунологическое исследование крови, отличающийся тем, что определяют активность фагоцитирующих клеток крови методом люминолзависимой биохемилюминесценции с использованием специфического (живая взвесь бледной трепонемы, 1-я проба) и неспецифического (опсонизированный зимозан, 2-я проба) индукторов фагоцитоза и при значении соотношения уровней светосуммы биохемилюминесценции в 1-й пробе ко 2-й (индекс специфического изменения биохемилюминесценции) более 1,1 диагностируют ранний скрытый сифилис, а при значении менее 1,1 - ложноположительный результат серологических реакций на сифилис.