СТИМУЛЯТОР РОСТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/38 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к способам культивирования бактерий.

Известно использование в качестве стимуляторов роста фруктоолигосахаридов [1] изомальтоолигосахаридов [2] циклодекстрина, ациллаактамов [3,4] и т.д.

Недостатками указанных стимуляторов являются сложности синтеза, узкий спектр действия, т.е. проявление стимулирующего эффекта по отношению к узкому спектру микроорганизмов, необходимость введения в культуральную жидкость посторонних веществ.

Прототипом заявляемого изобретения является стимулятор роста микроорганизмов широкого спектра действия, выделяемый ультрафильтрацией водных растворов лизоэнзимного препарата Streptomyces recifensis subsp.lyticus 2435 путем последовательной фильтрации через ультрафильтрационные мембраны УАМ-50, -100, -150, -200 [5]
Недостатком прототипа является невозможность получения высокоактивного препарата в связи с существенными потерями активности в ходе его фракционирования.

Задачей, стоявшей перед авторами, было создание новых стимуляторов роста бактериальных культур, обладающих широким спектром действия и не содержащих чужеродных веществ.

Указанная задача была решена путем выделения стимуляторов роста из культуральной жидкости бактерий (КЖ), получаемой либо в процессе выращивания бактерий, либо после инкубирования их в неблагоприятных для роста условиях (повышенная температура, отсутствие питательных веществ, замораживание-оттаивание и т.д.).

Выделение стимуляторов роста проводили путем пропускания КЖ через ультрафильтрационную мембрану с пределами задержания 3 15 кД. Для этих целей могут использоваться стандартные мембраны УМП-20, ВПУ-15 или диализные мешки 250-7 фирмы "Сигма".

Принципиальным отличием нового технического решения от известных является определение диапазона молекулярных масс веществ, продуцируемых различными видами микроорганизмов и оказывающих на них стимулирующее рост воздействие.

Применение мембран с большим или меньшим пределом задержания уменьшает положительный эффект.

В результате удалось получить препараты, обладающие широким спектром действия. В отличие от известных по литературным источникам [6, 7] препаратов заявляемые препараты оказывают стимулирующее рост действие на все изученные авторами бактерии, включая штамм-продуцент, микроорганизмы того же вида, что и штамм-продуцент (Е. coli K-12), бактерии, относящиеся к одной трибе со штаммом-продуцентом (Salmonella), к одному семейству (Serratia) и неродственные микроорганизмы (Bifidobacterium).

Заявляемые стимуляторы позволяют сократить время культивирования означенных микроорганизмов в 2 10 раз.

Появление у препаратов новых свойств, т.е. широкого спектра стимулирующего действия, соответствует критерию изобретения "изобретательский уровень".

Заявленная совокупность признаков изобретения в литературе не описана, что подтверждает критерий новизны.

Свойство "промышленная применимость" иллюстрируется примерами.

Пример 1. Получение стимулятора из E. coli M-17.

Клетки E. coli M-17 выращивают на среде М-9 [8] до конца логарифмической фазы роста, осаждают центрифугированием, промывают стерильной дистиллированной водой и ресуспендируют в ней до конечной концентрации 50 млрд./мл. Суспензию выдерживают в течение 5 сут при комнатной температуре. Клетки осаждают центрифугированием, а надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации на мембране УМП-20 (полисульфонамид) и лиофильно высушивают. В результате получают сухой препарат стимулятора роста.

Пример 2. Получение стимулятора из бифидобактерий.

Клетки Bifidobacterium adolescentis MC-42 выращивают на кукурузно-лактозной среде с добавлением 0,15%-ного агара при 37^oC, а затем инкубируют в той же среде в течение 12 часов при 37^oC.

После окончания инкубации клетки осаждают центрифугированием, а культуральную жидкость фильтруют на мембране УМП-20 и лиофильно высушивают. В результате получают сухой препарат стимулятора роста.

Пример 3. Действие стимулятора, полученного из E. coli M-17, на рост микроорганизмов.

Для выращивания E. coli M-17, E. coli K-12 и Salmonella enteritidis используют среду М-9 [8] с концентрацией глюкозы 0,125 г/л и добавкой аминопептидного бульона (8 мл на 1 л среды). Температура выращивания - +37^oC. Клетки Serratia marcescens выращивали на мясо-пептонном бульоне (МПБ) при температуре 32^oC. Среда для бифидобактерий описана в примере 2.

В питательные среды добавляли соответствующую дозу стимулятора роста, полученного по примеру 1. В контрольные культуры вместо стимулятора вносили равный объем дистиллированной воды. Остановку роста осуществляли путем помещения пробирок в ледяную воду на 10 мин. Прирост биомассы оценивали по данным высевов на агаризованные среды (МПА) или по стандартной методике высевов в агаровые столбики (для бифидобактерий).

Начальная концентрация клеток E. coli M-17 составляла 10⁴ кл/мл, E. coli K-12 10⁴ кл/мл, S.enteritidis 10⁴ кл/мл, Bifidobacterium adolescentis 10⁴ кл/мл.

Результаты воздействия стимулятора приведены в таблице 1.

Пример 4. Влияние стимулятора, полученного из Bifidobacterium adolescentis MC-42.

В питательные среды, приготовленные для E. coli согласно примеру 3, для B. adolescentis согласно примеру 2, добавляли дозу стимулятора, полученного из B. adolescentis по примеру 2. В контрольную пробирку вносили равный объем дистиллированной воды. Остановку роста и оценку прироста биомассы проводили так же, как в примере 3.

Результаты действия стимулятора приведены в таблице 2.

Источники информации
1. Япония, заявка N 59-53834.

2. США, патент N 4782045.

3. Япония, заявка N 63-71171.

4. Япония, заявка N 58-30032.

5. Биотехнология, N 4, 1992, с.26 29.

6. А.с. СССР N 1638156.

7. А.с. СССР N 491691.

8. Сборник методик по генетике микроорганизмов, под ред. Р.Клауса, У. Хейса. М. Медицина, 1970п

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: стимулятор роста бактериальной культуры выделяют из культуральной жидкости, получаемой либо в процессе выращивания бактерий, либо дополнительно при их инкубации в неблагоприятных для роста условиях путем пропускания культуральной жидкости через ультрафильтрационную мембрану с пределами задержания от 3 до 15 кД. 2 табл.

Стимулятор роста бактериальной культуры, представляющий собой фракцию ультрафильтрата компонентов микробного происхождения, прошедшую через ультрафильтрационную мембрану, отличающийся тем, что он представляет собой фракцию ультрафильтрата компонентов культуральной жидкости бактерий, прошедшую через ультрафильтрационную мембрану с пределом задержания 3 15 кД.