Способ получения аутоактиватора роста для культивирования ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1991 года по МПК C12N1/00 C12N1/38 C12N1/00 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения стимулирующих добавок к питательным средам при выращивании микроорганизмов.

Цель изобретения - повышение биологической активности ауторегулятора роста и упрощение способа.

Предлагаемый способ заключается в том. что для получения ауторегулятора роста в виде бесклеточного микробного фильтрата клетки Escherichia coli M-17 инкубируют в дистиллированной воде при комнатной температуре в течение 5-9 сут. Основным активатором роста является низкомолекулярное (около 500 у.ед) соединение, отличающееся по хроматографическим

свойствам от аминокислот и нуклеотидов, не используемое бактериями в качестве питательного субстрата и обладающее, по всей видимости, чисто регуляторными функциями.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки бактерий Escherichia coli M-17 отделяют центрифугированием от питательной среды, ресуспендируют в равном объеме 0,9%-ного раствора NaCI, осаждают и вновь ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 20 млрд/мл, выдерживают в защищенном от света месте в течение 5-9 сут при комнатной температуре. Затем отделяют клетки Е. coli M-17 ценО

СО 00

ел о

трифугированием. Надосадочную жидкость стерилизуют фильтрованием (фильтр Millipore; 0,22 мкм).

Биологическую активность препарата определяют культивированием бактерий Е. col M-17 в синтетической глюкозомине- ральной среде с добавкой аутоактиватора.

Пример, Культивирование бактерий Е. coll M-17 проводят в стандартной безбелковой минимальной синтетической среде М- 9 при 37°С во флаконах с постоянным перемешиванием среды. Засевная доза составляет 25 млн/мл. В намеченные сроки культуру фильтруют через бактериальные свечи К-5 с размером пор 0,9 мкм под отрицательным давлением 80-150 мм. Для оценки активирующего действия в фильтрат, содержащий аутоактиватор, засевают отмытую бульонную культуру Е. coli M-17 в дозе 15 млн/мл. Для контроля производят посев аналогичной дозы клеток бактерий в свежую синтетическую среду М-9,

Зависимость активирования от срока развития исходной культуры (по известному способу) представлена ниже.

Индекс стимуляции - частное от деления концентрации микробов в опытной пробе на концентрацию их в контроле, количественные показатели соответствуют активности препарата в известном способе.

П р и м е р 2. Отмытые от культуральной жидкости клетки Е. coli M-17, выращенные до конца логарифмической фазы, помещают в 200 мл дистиллированной воды в концентрации 20 млрд/мл. Выдерживают в защищенном от света месте при комнатной температуре 9 сут. Отделяют бактериальные клетки центрифугированием (3000 об./мин, 30 мин) на отечественной центрифуге К-70. Надосадочную жидкость с аутоактиватором фильтруют (фильтр Millipore, 0,22 мкм).

Для проверки активирующего действия 1 мл фильтрата с аутоактиватором, разбавленного в 125 раз, смешивают с 1 мл глюко- зоминеральной среды, содержащей все необходимые для роста компоненты в удвоенных концентрациях и клетки Е. colt

М-17(2 108кл/мл).

Состав глюкозоминеральной среды, г/л: глюкоза 6,0; NaaHP04 2,0; КНаР04 (водный) 2,0; цитрат аммония 9,0; NaCI 10; NaaCOa 3,0; MgSO4 (водный) 0,4; никотиновая кислота 0,01.

В контрольную пробирку вместо аутоактиватора вносят равный объем дистиллированной воды. Культивирование проводят 5 ч при 37°С. Остановку роста осуществляют

путем помещения пробирок в ледяную баню на 10 мин. Прирост биомассы оценивают спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 460 нм. Индекс стимулирования (ИС) вычисляют так

же, как в известном способе.

Динамика изменения ИС разбавленного в 125 раз аутоактиватора, полученного по предлагаемому способу, в процессе выдерживания представлена в таблице.

Таким образом, активность полученного препарата почти в 60 раз выше, чем препарата, полученного по известному способу, Отсутствие в фильтратах с аутоактиватором компонентов питательной среды

облегчает их лиофильную сушку. Полученные сухие препараты обладают повышенной удельной активностью и улучшенными физико-химическими свойствами (сыпучесть, низкая гигроскопичность). Облегчается возможность дальнейшей очистки аутоактиватора,

Формула изобретения

Способ получения аутоактиватора роста для культивирования Escherichia coli M- 17, предусматривающий инкубирование клеток в жидкой среде с последующими отделением культуральной жидкости и ее стерилизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения биологической а ктивно- сти продукта и упрощения способа, в качестве жидкой среды для инкубирования используют дистиллированную воду, а инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 5-9 сут.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения стимулирующих добавок к питательным средам при выращивании микроорганизмов. С целью повышения биологической активности ауторегулятора роста и упрощения способа клетки Escherichia coll M-17 инкубируют в дистиллированной воде при комнатной температуре в течение 5-9 сут. Для получения аутоактиватора используют суспензию клеток с концентрацией до 20 млрд/мл. Активность полученного препарата почти в 60 раз превышает активность известного препарата. Отсутствие в фильтратах с аутоактиватором компонентов питательной среды облегчает их лиофильную сушку. Сухие препараты обладают повышенной удельной активностью и улучшенными физико-химическими свойствами (сыпучесть, низкая гигроскопичность), Облегчается возможность дальнейшей очистки препарата. 1 табл.