СТИМУЛЯТОР РОСТА КЛЕТОК БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 C12N1/38 C12R1/19 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к способам культивирования бактерий, а именно к стимуляторам роста бактериальных культур.

Известно использование в качестве стимуляторов роста производных карбоматов (фруктоолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, циклодекстрина, ациллактамов и т.д.) (А.С. СССР №1746663, 1994, кл С 07 С 271/58; акц. заявка Японии №59-53834, 1984, кл. C 12 N 1/05; патент США №4782045, 1989, кл. C 12 N 1/00; акц. заявка Японии №63-71171, 1988, кл. C 12 N 1/00).

Недостатками указанных стимуляторов являются сложности синтеза, узкий спектр действия, т.е. проявление стимулирующего эффекта по отношению к узкому спектру микроорганизмов, необходимость введения в культуральную жидкость посторонних веществ.

Известен природный стимулятор роста микроорганизмов широкого спектра действия, получаемый путем последовательной ультрафильтрации водных растворов лизоэнзимного препарата Streptomyces recifensis subsp. lyticus 2435 через ультрафильтрационные мембраны УАМ-50, -100, -150, -200 (Бабенко Ю.С. и др. Биотехнология, №4, 1992, с.26-29).

Недостатком стимулятора является невозможность получения высокоактивного препарата в связи с существенными потерями активности в ходе его фракционирования.

Прототипом заявляемого изобретения является разработанный авторами стимулятор клеток Escherichia coli (E.coli), получаемый из клеток микроорганизмов, помещенных в дистиллированную воду на 5-9 суток (патент РФ №1638156, 1991, кл. C 12 N 1/00//1/38).

Недостатком стимулятора являлись нестандартность и неопределенность состава, что не позволяло получить достаточно стабильные результаты при промышленном производстве.

Задачей, стоявшей перед авторами, было создание нового стимулятора роста E. coli, не содержащего чужеродных веществ для микроорганизмов и имеющего воспроизводимый состав.

Указанная задача была решена использованием в качестве биостимулятора композиции, содержащей смесь водорастворимых солей органических кислот при следующем соотношении их анионов в смеси (мол.%):

ацетат–анион 14-48

лактат–анион 6-29

сукцинат-анион 12-59

глутамат–анион 0,1-21

В качестве катионов, содержащих водорастворимые соли, используют, как правило, металлы 1 или 2 групп Периодической системы Д.И. Менделеева или аммоний.

Стимулятор, как правило, используют в концентрации от 0.5 до 10 мас.% от массы культуральной жидкости.

Биостимулятор может быть получен как путем смешения индивидуальных химических веществ, так и с использованием природных или искусственных смесей. В последнем случае он вводится в культуральную жидкость как часть более сложных рецептур.

Промышленная применимость биостимулятора иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Для выращивания клеток Е.coli М-17 использовали среду М-9 с концентрацией глюкозы 0,5 г/л. В питательную среду добавляли различные композиции заявленного биостимулятора в виде смеси натриевых солей в количестве 5% от общей массы сухих компонентов среды. Каждую из солей растворяли в дистиллированной воде, стерилизовали кипячением и вносили в среду культивирования до требуемых концентраций. Молярные соотношения солей в композициях указаны в таблице 1.

Культивирование проводили на термостатированной качалке при 37°С, контролируя рост по оптической плотности D⁴⁶⁰. Результаты действия биостимулятора определяли по относительному приросту биомассы через 5 часов культивирования. Для этого рассчитывали изменение D⁴⁶⁰ через 5 часов роста в опытной (с добавлением биостимулятора) культуре и делили на изменение оптической плотности в контрольной культуре. Результаты действия биостимуляторов приведены в таблице 1.

ПРИМЕР 2. В культуру E.coli вводили в концентрации 5.0% биостимуляторов, полученных по примеру 1, и биостимулятор в составе смесей, выделенных из культуральной жидкости (экзометаболитов) по одной из нижеследующих технологий:

1 способ. Клетки Е.coli М-17 выращивали в ферментере Microferm (New Brunswick) на среде М-9 до стационарной фазы (3·10¹⁰ клеток/мл). Экзометаболиты выделяли путем последовательного фильтрования (фильтры “Владипор” с пределом задержания 10-15 кДа) и лиофильного высушивания полученной культуральной жидкости. Анализ состава экзометаболитов проводили методами ¹Н-ЯМР-спектроскопии и аминокислотного анализа AccQ-Tag Method. При необходимости в полученную смесь (экзометаболит 1) добавляют химические добавки до получения состава, приведенного в таблице 2.

2 способ. Клетки, выращенные до стационарной фазы, как описано выше, после отделения культуральной жидкости суспендировали в дистиллированной воде в концентрации 5·10¹⁰ клеток/мл и инкубировали в ней в течение 5-7 суток при 20°С. Экзометаболиты выделяли и идентифицировали так же, как и в первом способе. При необходимости в полученную смесь (экзометаболит 2) добавляют химические добавки до получения состава, приведенного в таблице 2.

Результаты действия биостимуляторов на рост E.coli М-17 и E.coli К-12 приведены в таблицах 3 и 4 соответственно.

Пример 3. Влияние биостимулятора на рост Е.coli М-17 в смешанной культуре

E.coli M-17 выращивали вместе с Salmonella enteritidis. Для выращивания использовали среду М-9 с концентрацией глюкозы 0,25 г/л и добавкой аминопептида (4,8 мл на 1 л среды). Начальная концентрация клеток в среде составляла 6,3·10⁵ кл/мл. Из них 61% были клетки E.coli. В питательную среду добавляли композиции, полученные в примере 2, в количестве 5 мкл раствора на 1 мл среды. Соответственно, концентрации солей в среде получились в 4 раза меньше показанных в таблице 2.

Культивирование проводили в стационарных условиях при 37°С в течение 4 часов. Остановку роста осуществляли путем помещения пробирок в ледяную воду на 10 мин. Прирост биомассы оценивали по данным высевов на среду Эндо (табл.5).

Полученные результаты свидетельствуют, что новая композиция обладает стимулирующим воздействием на клетки E.coli и может быть использована как для культивирования биомассы микроорганизмов, так и для уменьшения доли патогенных микроорганизмов в различных средах.

Изобретение относится к области прикладной микробиологии, а именно к стимуляторам роста бактериальных культур. Стимулятор роста клеток бактерий Escherichia coli представляет собой смесь водорастворимых солей органических кислот при следующем соотношении их анионов в смеси (мол.%): ацетат-анион 14-48; лактат-анион 6-29; сукцинат-анион 12-59; глутамат-анион 0,1-21. В качестве катионов солей могут быть использованы металлы 1 или 2 групп Периодической системы Д.И. Менделеева или аммоний. Стимулятор обладает эффективным воздействием на клетки Е.coli и имеет стандартизированный состав. 2 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Стимулятор роста бактерий Escherichia coli, содержащий водорастворимые соли органических кислот, отличающийся тем, что содержание анионов органических кислот в смеси составляет, мол.%:

Ацетат-анион 14-48

Лактат-анион 6-29

Сукцинат-анион 12-59

Глутамат-анион 0,1-21