СПОСОБ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ СТЕВИИ STEVIA REBAUDIANA L. Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам размножения стевии (Stevia rebaudiana L.) с помощью культуры ткани in vitro, которые могут использоваться для нужд пищевой и медицинской промышленности.

Известен способ микроразмножения стевии. В этом способе микроразмножения стевии производят вычленение экспланта, стерилизацию его, культивирование на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы, витамины, сахарозу, агар и фитогормоны, получают регенеранты, микрочеренкуют их, доращивают, укореняют и пересаживают растения-регенеранты в грунт.

Микроразмножение по этому способу базируется или на увеличении центрального побега и в дальнейшем его черенковании для укоренения, или на образовании каллусной ткани из почек и фрагментов листьев. Однако длительная стерилизация и высокая концентрация стерилизатора в этом способе отрицательно действуют на процессы побегообразования и рост растения. Значительная часть эксплантов способна была лишь к образованию каллуса. Кроме того, в этом способе используют фрагменты листьев, из которых невелика возможность получения растений свободных от вирусов и грибков. Заявленная в этом способе величина 5 мм недостаточна для получения высокого выхода безвирусных растений.

Цель изобретения увеличение коэффициента размножения безвирусных растений и упрощение способа микроразмножения.

Поставленная цель достигается новым способом микроразмножения стевии (Stevia rebaudiana L.), включающим вычленение экспланта, стерилизацию его, культивирование на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей макро- и микроэлементы, витамины, сахарозу, агар и фитогормоны, получение регенерантов, микрочеренкование, доращивание, укоренение и пересадку растений-регенерантов в грунт, причем согласно изобретению в качестве экспланта вычленяют терминальные и/или пазушные почки с низлежащими тканями стебля размером 1 3 мм, стерилизацию проводят 0,1% раствором диоцида в течение 3 мин и 0,1% раствором сулемы в течение 2,5 мин, культивирование осуществляют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей фитогормоны индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,1 0,3 мг/л, бензиладенин (БА) 0,5 2,0 мг/л и гибберелловую кислоту (ГК) 0,5 2,0 мг/л, культивируют эксплант в течение 4 5 недель до образования укоренившихся растений-регенерантов, неукоренившихся регенерантов и каллусной ткани, после чего отделяют растения-регенеранты и высаживают их в грунт, а неукоренившиеся регенеранты микрочеренкуют и переносят для укоренения на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 2,0-6,0 мг/л ИУК и ГК 1,0-2,0 мг/л, а каллусную ткань помещают на исходную питательную среду для дальнейшего культивирования до получения регенерантов.

Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков, то есть оно не известно из уровня техники, значит, соответствует критерию "новизна".

Предлагаемое изобретение имеет изобретательский уровень, так как оно явным образом не следует из уровня техники.

Пример 1. Берут верхушечные и боковые черенки из донорных растений стевии размером 10 15 мм и стерилизуют их при помощи 0,1% диоцида 3 мин и 0,1% сулемы 2,5 мин, и промывают в 3-х порциях стерильной воды. Затем из них вычленяют верхушечные почки с небольшими низлежащими тканями размером 0,2 - 0,3 мм и помещают в среду МС, содержащую тиамин 0,5, пиридоксин 0,5, никотиновую кислоту 1, сахарозу 20000, агар 8000, которая дополнительно содержит фитогормоны ИУК 0,1 мг/л, БА 0,5 мг/л и ГК 0,5 мг/л. Экспланты выдерживают в условиях относительной влажности 70% фотопериоде 16 ч, освещении люминесцентными лампами ЛБ-80 при температуре 25 26^oC. Через 2 недели из эксплантированной почки вырастает побег с каллусной тканью на базальной части (фиг. 1).

Затем через 1 неделю увеличивается каллусная ткань и зарождается большое количество почек и регенерантов (фиг. 2). Через 1 неделю происходит сильный рост регенерантов с корнеобразованием у части из них (приблизительно 20%), пригодных для посадки прямо в грунт (фиг. 3).

Оставшиеся регенеранты черенкуют и пересаживают в среду МС (фиг. 4) с содержанием фитогормонов, мг/л: ИУК 2, ГК 1. Через 2 недели побеги укореняются и готовы к высадке в грунт (фиг. 5). Этот процесс можно повторять неоднократно (5 6 раз), используя жизнеспособность каллусной ткани, образовавшейся после первой имплантации почек (фиг. 6). Через 2 недели после пересадки этой каллусной ткани на свежую среду зарождаются новые почки и регенеранты (фиг. 7).

Результаты примера 1 приведены в табл. 1, 2.

Пример 2. Берут верхушечные и боковые черенки из донорных растений стевии размером 10 15 мм и стерилизуют их при помощи 0,1% диоцида 3 мин и 0,1% сулемы 2,5 мин, и промывают в 3-х порциях стерильной воды. Затем из них вычленяют верхушечные почки с небольшими низлежащими тканями размером 0,2 - 0,3 мм и помещают в среду МС, содержащую тиамин 0,5, пиридоксин 0,5, никотиновую кислоту 1, сахарозу 20000, агар 8000, которая дополнительно содержит фитогормоны ИУК 0,5 мг/л, БА 1,0 мг/л и ГК 2,0 мг/л. Экспланты выдерживают в условиях относительной влажности 70% фотопериоде 16 ч, освещении люминесцентными лампами ЛБ-80 при температуре 25-26^oC. Через 2 недели из эксплантированной почки вырастает побег с каллусной тканью на базальной части (фиг. 1).

Затем через 1 неделю увеличивается каллусная ткань и зарождается большое количество почек и регенерантов (фиг. 2). Через 1 неделю происходит сильный рост регенерантов с корнеобразованием у части из них (приблизительно 20%), пригодных для посадки сразу в грунт (фиг. 3).

Оставшиеся регенеранты черенкуют и пересаживают в среду МС (фиг. 4) с содержанием фитогормонов мг/л: ИУК 4, ГК 1,5. Через 2 недели побеги укореняются и готовы к высадке в грунт (фиг. 5). Этот процесс можно повторять неоднократно (5 6 раз), используя жизнеспособность каллусной ткани, образовавшейся после первой имплантации почек (фиг. 5). Через 2 недели после пересадки этой каллусной ткани на свежую среду зарождаются новые почки и регенеранты (фиг. 7).

Результаты примера 2 приведены в табл. 1, 2.

Пример 3. Берут верхушечные и боковые черенки из донорных растений стевии размером 10 15 мм и стерилизуют их при помощи 0,1% диоцида 3 мин и 0,1% сулемы 2,5 мин, и промывают в 3-х порциях стерильной воды. Затем из них вычленяют верхушечные почки с небольшими низлежащими тканями размером 0,2 - 0,3 мм и помещают в среду МС, содержащую тиамин 0,5, пиридоксин 0,5, никотиновую кислоту 1, сахарозу 20000, агар 8000, которая дополнительно содержит фитогормоны ИУК 2,0 мг/л, БА 2,0 мг/л и ГК 2,0 мг/л. Экспланты выдерживают в условиях относительной влажности 70% фотопериоде 16 ч, освещении люминесцентными лампами ЛБ-80 при температуре 25 26^oC. Через 2 недели из эксплантированной почки вырастает побег с каллусной тканью на базальной части (фиг. 1).

Затем через 1 неделю увеличивается каллусная ткань и зарождается большое количество почек и регенерантов (фиг. 2). Через 1 неделю происходит сильный рост регенерантов с корнеобразованием у части из них (приблизительно 20%), пригодных для посадки сразу в грунт (фиг. 3).

Оставшиеся регенеранты черенкуют и пересаживают в среду МС (фиг. 4) с содержанием фитогормонов мг/л: ИУК 5, ГК 2. Через 2 недели побеги укореняются и готовы к высадке в грунт (фиг. 5). Этот процесс можно повторять неоднократно (5 6 раз), используя жизнеспособность каллусной ткани, образовавшейся после первой имплантации почек (фиг. 5). Через 2 недели после пересадки этой каллусной ткани на свежую среду зарождаются новые почки и регенеранты (фиг. 7).

Результаты примера 3 приведены в табл. 1, 2.

Эффект комплекса фитогормонов, входящих в состав основной среды МС для микроразмножения стевии, показан в табл. 1.

Концентрация и соотношение фитогормонов, внесенных в основную среду МС для укоренения растений-регенерантов, даны в табл. 2.

Из результатов табл. 1, 2 следует, что заявляемый способ микроразмножения стевии позволяет в течение 4 6 недель получить из одного экспланта до 250 растений-регенерантов, т.е. коэффициент размножения 1:250, а из одного растения в среднем до 10000, включая растения-регенеранты, как укоренившиеся после первого культивирования, так и нуждающиеся в последующем укоренении. Оставшийся каллус обладает способностью регенерировать новые растения при пассировании до 5 6 раз.

Упрощение заявляемого способа заключается в использовании более мягкой стерилизации, после которой нет необходимости в снятии отрицательного действия стерилизующих веществ, заключающееся в пересадке эксплантов на свежую среду каждые 12 15 дней.

Неоднократное использование каллусной ткани значительно упрощает и ускоряет способ, так как стерилизация и вычленение меристемных почек очень трудоемка.

Использование эксплантов размером 1 3 мм позволяет увеличить выход безвирусного посадочного материала.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: микроразмножение стевии осуществляют путем вычленения в качества экспланта терминальных и/или пазушных почек с нижележащими тканями стебля размером 1 - 3 мм, стерилизации 0,1% раствором диоцида в течение 3 мин и 0,1% раствором сулемы в течение 2,5 мин, культивирования в течение 4 - 5 недель на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей фитогормоны, индолилуксусную кислоту 0,1 - 0,3 мг/л, бензиладенин 0,5 - 2,0 мг/л, гибберелловую кислоту 0,5 - 2,0 мг/л до образования укоренившихся растений-регенерантов, неукоренившихся регенерантов и каллусной ткани, после чего укоренившиеся растения пересаживают в грунт, а неукоренившиеся регенеранты микрочеренкуют и переносят для укоренения на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 2,0 - 6,0 мг/л индолилуксусной кислоты и 1,0 - 2,0 мг/л гибберелловой кислоты. Каллусную ткань помещают на исходную питательную среду для дальнейшего культивирования до получения регенерантов. 2 табл., 7 ил.

Способ микроразмножения стевии Stevia rebaudiana L. включающий вычленение экспланта, стерилизацию его, культивирование на питательной среде Мурасиге Скуга, содержащей макро- и микроэлементы, витамины, сахарозу, агар и фитогормоны, получение регенерантов, микрочеренкование, доращивание, укоренение и пересадку растений-регенерантов в грунт, отличающийся тем, что в качестве экспланта вычленяют терминальные и/или пазушные почки с низлежащими тканями стебля размером 1 3 мм, стерилизацию проводят 0,1%-ным раствором диоцида в течение 3 мин и 0,1%-ным раствором сулемы в течение 2,5 мин, культивирование осуществляют на питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей фитогормоны ИУК 0,1 0,3 мг/л, бензиладенин 0,5 2,0 мг/л и гибберелловую кислоту 0,5 2,0 мг/л, культивируют экспланты в течение 4 5 недель до образования укоренившихся pacтений-регенерантов, неукоренившихся регенерантов и каллусной ткани, после чего отделяют растения-регенеранты и высаживают их в грунт, а неукоренившиеся регенеранты микрочеренкуют и переносят для укоренения на питательную среду Мурасиге Скуга, содержащую 2 6 мг/л индолилуксусной кислоты и гибберелловую кислоту 1 2 мг/л, а каллусную ткань помещают на исходную питательную среду для дальнейшего культивирования до получения регенерантов.