Способ микроклонального размножения гибридов осины Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться при воспроизводстве лесных древесных растений в лесном и сельском хозяйстве.

Цель изобретения - повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения.

Способ состоит в том, что в качестве исходных эксплантатов используют меристемы верхушечных и пазушных почек неразмножающихся черенкованием гибридов осины с тополем, инициацию почек и формирование конгломерата микропобегов проводят на основной питательной среде Мурасиге-Скуга с добавками 15-30 мг/л сульфата аденина, 0,15-0,25 мг/л 6-БАП, 0,05-0,15 мг/л ИУК (среда 1) с последующим разделением, субкультивирование и удлинение побегов проводят- на основной среде с добавками Q,05-0,2 мг/л 6-БАП, 0,01 о,03 мг/л ПУК при отсутствии аденина и инозита (среда 2) с последующим укоренением растений на основной среде с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей, содержащей 0,3-0,6 мг/л ИНК (среда 3). Культуры вырашивают при освещении люминесцентными лампами (5000 лк) на 16-часовом светопериоде при 25° С 5 70% относи-

тельной влажности воздуха. Укорененные растения - регенеранты высаживают в почву в теплицу с последующей высадкой в открытый грунт.

Способ осуществляют следующим образом. Молодые неодревесневшие побеги длиной 3-5 см обмывают в слабом мыльном растворе, затем промывают водопроводной водой. Растительный материал стерилизуют сначала в течение 1 мин в 70%-ном спирте и 20 мин в 10%-ном растворе хлорамина с последуСД

00

(«я.

J

ющей 3-кратной промывкой дистиллированной водой. В стерильных условиях (в ламинаре) отделяют почки от побегов и выделяют зону меристемы верхупгеч - ной или пазушной почки. Исходный эксплантат помещают на проавтоклави- рованную питательную среду 1 в пробирки. Среда 1 для роста почек содержит кроме основной среды Мурасиге- Скуга 15-30 мг/л сульфата аденина, 0,15-0,25 мг/л 6-БАП и 0,05-0,015 мг/л ЙУК. На этой среде в течение 4-5 недель происходит набухание, раскрытие И .рост почек с последующим образова нием конгломерата коротких побегов с 2-3 небольшими листьями (до 20-50 побегов). Образовавшийся конгломерат побегов разделяют под микроскопом на отдельные побеги и помещают на среду 2, на которой происходит рост побегов в длину и закладка пазушных почек. Эта среда кроме основной питательной среды содержит 0,05 -. 0,20 мг/л 6-БАП и 0,01-0,03 мг/л НУК при отсутствии аденина и инозита. На среде 2 наблюдается развитие многочисленных пазушных побегов. Так, на каждом первоначальном побеге образуется 2-3 побега в пазухах листьев., При перенесении побегов, возникающих из пазушных почек, на свежую среду 2 наблюдается повторение процесса активации роста пазушных почек (т.е. мультипликация). Процесс мультиплика- ции можно повторять многократно, достигая таким образом максимального выхода числа побегов из одного эксплантата. Таким образом, процесс дифференциации и роста растений состав- ляет 6-9 недель. Побеги гибридов, достигшие 3-4 см в длину, пересаживают на питательную средзг 3 для укоренения Эта среда состоит из минеральных солей по Мурасиге-Скуга, концент- рация которых уменьшена вдвое, никотиновой кислоты-0,1 мг/л, пиридокси-х на-НС1 0,1 мг/л, тиамина - НС1 1,0 мг/л и ИМК 0,3-0,6 мг/л. Концентрация сахарозы 2%. На этой среде по- беги формируют корни через 7-10 дней. По достижении корнями 3-5 см в длину растения пересаживают в почву. Растения, укоренившиеся в сосуде, легко

переносят пересадку в нестерильную почву и акклиматизацию к внешним условиям. Приживаемость растений составляет 85-90%.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Материалом -для размножения служат высокогетерозисные гибриды осины с тополем P.tretmila хР. alba, P.alba x P.Bolleana. Верхушечные и пазушные почки берут с деревьев, возраст 26-32 г. из нескольких, гибридных комбинацийs осина 23 х тополь белый 12, осина 29 х тополь белый 95, тополь белый х тополь Болле 8. Ветки с деревьев, взятые в феврале- марте, ставят в сосуды с водой для индукции развития верхушечных почек. Молодые неодревесневшие побеги длиной 3-5 см отрезают, обмывают в слабом мыльном растворе, затем промывают водопроводной водой. Растительный материал стерилизуют сначала в течение 1 мин в- 70%-ном спирте и 20 мин в 10%-ном растворе хлорамина, затем трехкратно отмывают стерилизованной дистиллированной водой. После этого в стерильных условиях (шкаф с ламинарным течениемвоздуха УОБВ) отделяют почки от побегов, удаляют у них покровные чешуи. Исходный эксплантат состоит из зоны меристемы верхушечной или пазушной почки длиной 2,0-3,0 мм, Пробирки со средой 1 (табл.1) с добавками БАП 0,2 мг/л и ИУК 0,1 мг/л (оптимальные концентрации) автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, воду - при 1,5 атм в течение 1 ч. Эксплантаты помещают на питательную среду 1 в биологические пробирки (21x200 мл), которые закрывают стерильными марлевыми пробками. Пробирки помещают на светоплощадку при освещении люминесцентными лампами (5000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25°С и 70%-ной относительной влажности воздуха. В течение 4-5 недель на среде 1 происходит набухание, раскрытие и рост почек с последующим формированием конгломерата коротких побегов с 2-3 листочками (до 20-50 побегов). Под микроскопом (в ламинаре) разделяют конгломерат коротких побегов на отдельные побеги и помещают на среду 2 (табл.1) с добавками БАП 0,1 мг/л и НУК 0,02 мг/л (оптимальные концентрации) , на .которой происходит рост побегов в длину и закладка пазушных почек в течение 2-4 недель, На этом этапе наблюдается развитие многочисленных пазушных Побегов. Проводят 2- кратную мультипликацию побегов, воз10

20

25

пикающих из пазушных почек, т.е. на каждом первоначальном побеге образуется 2-3 побега в пазухах листьев. При перенесении этих побегов, возникающих из пазушных почек, на свежую питательную среду 2 наблюдается повторение процесса активации роста пазушных почек, которые в свою очередь дают новые побеги для новой пересадки. Продолжительность дифференциации и роста побегов занимает 6-9 недель в зависимости от клона. Побеги гибридов, достигшие 3-4 см в длину, пересаживают на питательную среду 3 с до- 15 бавкой ИМК 0,5 мг/л (оптимальная концентрация) (табл.1) для укоренения. Процент укоренения составляет 84-90% в зависимости от клона. На этой среде побеги формируют корни через 7- 10 дней. По достижении корнями длины 3-5 см растения пересаживают в почву.

Перенос растений осуществляют следующим образом. Растения со сформировавшимися корнями осторожно вынимают из агара, тщательно отделяют прилипший агар, обмывают в воде и непосредственно переносят в почву с песком (1:1). Растения обильно поливают. Приживаемость растений составляет 85-90%. Наблюдается нормальный рост и развитие этих растений.

П р и м е р 2. Ветки с деревьев, взятые в феврале-марте, ставят в со- суды с водой для индукции развития верхушечных почек. С молодых зеленых побегов отделяют почки и культивируют их на среде 1 с различными концентрациями гормональных веществ.

В табл.2-4 представлены предельные значения и оптимальные концентрации БАП и ИУК соответственно.

П р и м е р 3. Растительный материал тот же, что и в примере 1 и 2. осле культивирования на среде 1 поученные множественные микропобеги отделяют и субкультивируют индивидуально на среде 2 с различными концентрациями БАП и НУК с целью удлинения. Экспериментально определяют редельные значения и оптимальные онцентрации БАП и НУК соответстенно.

Результаты представлены в табл.5 6.

П р и м е р 4. После культивирова- ия на средах 1 и 2 выросшие микропоеги пересаживают на среду 3 для сти- уляции образования корней с различ-

30

35

40

45

50

ее

5

5

0

ными концентрациями ItMK. Экспериментально определяют предельные значения и оптимальные концентрации ИМК.

Результаты приведены в табл.7. / В культуру вводят растения нескольких гибридных комбинаций. Данные по сравнительно эффективности регенерации, роста и укоренения побегов t приведены в табл.8.

Преимуществами предполагаемого способа являются: возможность промышленного использования в лесном хозяйстве ценных высокогетерозисных гибридов осины с тополем, которые ранее не могли быть использованы в производстве вследствие невозможности их размножения черенкование ; возможность массового получения посадочного материала с сохранением генотипа от элитных деревьев; регулирование скорости микроразмножения в зависимости от производственных условий; возможность многократной мультипликации, высокий процент укореняемостн и выживаемости растений (85-90%); сокращение сроков дифференциации и роста растений до 6-9 недель; подготовка укоренившихся растений в условиях теплицы к началу весенней вегетации в открытом грунте; возможность выращивания посадочного материала независимо от времени года.

Формула изобретения

Способ микроклонального размножения гибридов осины, включающий культивирование меристем пазушных почек на модифицированной среде Мурасиге- Скуга, содержащей , KN03 . 2Н20, MgS(V7II70, КЬЬГО,,, Ка4ЭДТАх 2Н20, FeS04-7H O, НЭВ03 , Мп80ф-411 0, 2п804 7НгО, KI, NazMo04-2U20, CuS04 , CaCl г 6H,jO, сахарозу, никотиновую кислоту, пиридоксин НС1, тиамин НС1 и воду до получения растений- регенерантов с последующей высадкой их в открытый грунт, отличаюЩ и и с я тем, что, с целью повышения выхода размножаемых растений и ускорения процесса размножения, культивирование осуществляют в три этапа, при этом.на первом этапе - инициации

и формирования конгломерата побегов - в питательную среду добавляют инозит, сульфат аденина, 6-бензиламинопурин, индолилуксусную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мг/л:

NH4N03 KN03

СаС1г 2Н20 MgS04 7НгО KH2P04 На1ЭДТА 2Н20 FeSo4 711 0 Н3ВОЭ

MnSOlfl 4Н70 ZnSO 4 -7НгО

1650 1900

440

370

170

37,3

27,8 6,2

22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 30000

100

KI

NaMo04-21ljO CuSOf-5H20 . СоС1а 6Н70

Сахароза

Инозит

Никотиновая

кислота 0,5

Пиридоксин НС1 0,1

Тиамин НС10,1

Сульфат аденина 15-30

6-Бензиламинопурин0,15-0,25

Индолилук сусная

кислота 0,05-0,15

ВодаДо 1 л

а втором этапе г субкультивирования удлинения побегов - в питательную реду добавляют 6-бензиламинопурин, афтилуксусную кислоту, при следующем оотношении компонентов, мг/л:

1650 1900

NH4N03

КЖ)Ъ

СаС1г-2НгО

MgS04-7II20

КНгР04

Na TA-2H20

FeS04-7HaO

Н3В03

MnSCV 4H20

ZnS04-7HtO

KI

NaMo04 2H10

CuS04 5НгО

Сахароза

Никотиновая

кислота

Пиридоксин НС1

Тиамин НС1

6-Бензиламинопурин

Нафтилуксусная

кислота

Вода

440

370

170

37,3

27,8 6,2

22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 30000

0,5.

0,.1

0,1

0,05-0,20

0,01-0,03 До 1 л

а третьем этапе укоренение растеий - в питательную среду добавляют

индолилмасляную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мг/л:

5

0

5

NH4N03

KN08

СаС12.21ЦО

MgS047Н20

КН2Р04

NaiЭДTA2H20

FeS047Н20

НЭВ03

MnS04 4H20

ZnS04-7НгО

TCI

NaMo04 2НаО

CuS04 5H20

CoCl -6H20

Сахароза

Никотиновая

кислота

Пиридоксин НС1

Тиамин НС1

Индолилмасляная

кислота

825

950

220

185 85

18,65 13,9

3,1 11,15

4,3 0,415 0,125 0,0125 0,0125 20000

0,1 0,1 0,1

0,3-0,6 Таблица 1

50

91581741

.Продолжение табл.1

10

Таблица

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться при воспроизводстве лесных древесных растений. Целью изобретения является повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что в культуру вводят меристемы пазушных почек и культивирование осуществляют в три этапа на модифицированной различными фитогормонными добавками питательной среде Мурасиге-Скуга. 8 табл.

Состав основной Среда - Концентрация ИУК, Эффективность рос- среды Мурасиге-Скуга,-iг мг/л та почек %

мг/л1235 1

0 055д

Нафтилуксусная х0,1080

кислота (НУК) - - Qj01 -°, 1563

0,63fo

ИндолилмаслянаяТаблицаЗ

кислота (ИМК) - - 0,3- ----.. -.

0,6КонцентрацияБАЛ, Средняя длина , мг/лпобегов, см

Т а блиц а 2. о,053,7

Т - 0,104,2

Концентрация БАЛ, Эффективность роста 0,202,9

(мг/л)почек, %

20 Таблицаб 0,1564

О 2080Концентрация ИУК,I Средняя длина

О 2571мг/лпобегов, см

.. 1-1 I-IL -ЩЧ1-. -- ±г - -- ПТ-IIU IT- Mil Г1I -Г1II

- 250,013,4

0,02 4,1 ТаблицаЗ0,03 2,7

r i Таблица Концентрация суль- Эффективность-

фата аденина, мг/л|роста почек, % Концентрация IttlK, (Эффективность кормг/л необразования, % 1565

20820,375

30690,590

350,684

iТ а б л и ц а 8

ГибридыЭффективность Эффектна- Эффективность

роста нзоли- ность по- укоренения, ропянных по- Оегообра-X

чек, Xзованяя,

Z

Осина 23 х тополь белый 12

дерево 1)809190

Осина 79 х тополь белый 9569 7885 Тополь белый х х тополь Бол- ле 8 74 6884

Примечание. Эффективность роста изолированных почек - количество почек, введенных в культуру, выраженное в % от исходного количества, эффективность побегообразования - количество побегов, выросших в культуре тканей, выраженной в 15 от исходного количества; эффективность укоренения - количество укоренившихся растений, обладающих высокой приживаемостью в почве н хорошим ростом побегов и- корней, выраженное в Z от исходного количества.