СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ГРЕЧИХИ IN VITRO Российский патент 2015 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений и сельскохозяйственной биотехнологии, и может быть использовано в селекции и семеноводстве растений, в частности для ускорения процесса размножения ценных форм, регенерантов и сортов гречихи, а также в исследованиях по генетике и физиологии растений.

Известен способ размножения гречихи in vitro, включающий вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, авторское свидетельство СССР №1704715, МПК⁵ A01H 4/00, 1992 г.).

Недостатком этого способа размножения гречихи in vitro является:

- трудоемкость вычленения недозрелых зародышей;

- сложность отбора зародышей требуемого размера от 0,5 до 3,0 мм для культивирования;

- удлинение процесса размножения растений гречихи in vitro из-за наличия этапа получения первичной каллусной ткани;

Известен также способ размножения гречихи in vitro, в котором в качестве эксплантов используют узлы растений, а культивирование и субкультивирование осуществляют на одной и той же модифицированной питательной среде Гамборга В₅, в которую дополнительно вносят 6-БАП в количестве 5-10 мг/л и 1-2 мг/л (см., например, авторское свидетельство СССР №1658928, МПК⁵ A01H 4/00, 1991 г.).

Недостатком данного способа размножения гречихи in vitro является:

- низкая эффективность получения стерильных растений, так как для стерилизации растительных тканей более сложно подобрать дезинфицирующие средства, чтобы сохранить ткани живыми и способными к регенерации, чем для семян;

- снижение коэффициента размножения после добавления в питательную среду фитогормона 6-БАП, вследствие появления аномальных форм побегов с нехарактерной морфологией, а также раннего цветения микрорастений гречихи.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ размножения гречихи in vitro, включающий вычленение эксплантов в качестве которых используют участки недельных асептических проростков, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, патент на изобретение №2229219, МПК⁷ A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.).

Недостатком известного прототипа является:

- увеличение времени на получение растений гречихи в процессе регенерации из каллуса, так как сначала надо индуцировать образование первичной каллусной ткани;

- снижение частоты регенерации побегов из каллуса по сравнению с прямым органогенезом;

- снижение выхода растений идентичных исходному генотипу при регенерации из каллусной ткани вследствие проявления сомаклональной изменчивости.

Цель изобретения - повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений.

Указанная цель достигается тем, что способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян, отличающийся тем, что семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков, субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа размножения гречихи in vitro являются:

1 «…семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков…», что позволяет:

- значительно упростить процедуру стерилизации семян из-за сокращения времени ее проведения, так как обработку концентрированной серной кислотой проводят однократно в течение 2 минут;

- значительно ускорить снятие плотной околоплодной оболочки и быстрее пассировать плоды на питательные среды за счет того, что после погружения семян гречихи в серную кислоту происходит частичное разрушение (размягчение) околоплодной оболочки;

- снизить затраты на приобретение дорогостоящих фитогормонов за счет получения асептических проростков из семян на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов, так как на этом этапе еще идет выбраковка части инфицированного материала.

2 «…субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде», что позволяет:

- увеличить выход активно растущих микрорастений за счет использования верхней части побега с пазушной почкой;

- увеличить выход пробирочных растений гречихи за три пассажа в 1,9 раз;

- ускорить размножение ценных форм и сортов гречихи;

- максимально снизить появление микрорастений с аномальной морфологией, так как 6-БАП не используется, и получать идентичные исходному генотипу микрорастения с нормальной морфологией;

- повысить эффективность и упростить процесс микроразмножения при культивировании и субкультивировании черенков гречихи за счет применения питательной среды одного состава, которая обеспечивает одновременно рост микрорастений и их укоренение;

- снизить затраты на культивирование микрорастений в условиях in vitro за счет сокращения сроков размножения материала до необходимого объема, ускорить производство семян.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ размножения гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Предлагаемый способ размножения гречихи in vitro осуществляется следующим образом. Зрелые семена гречихи стерилизуют, погружая на две минуты в концентрированную серную кислоту. В таблице 1 представлены результаты эксперимента по эффективности стерилизации семян гречихи хлорсодержащим дезинфицирующим агентом раствором хлорамина Б в сравнении с предлагаемым способом стерилизации концентрированной серной кислотой. Результаты свидетельствуют о существенном повышении эффективности процесса стерилизации семян концентрированной серной кислотой, так как процент освобожденных от инфекции семян составил от 71,0 до 100.

Семена, прошедшие стерилизацию серной кислотой, трижды промывают в течение 5-10 минут стерильной дистиллированной водой, освобождают от перикарпия (плодовой оболочки) и пассируют на питательную среду Мурасиге и Скуга без фитогормонов, содержащую следующие

Таблица 1 Эффективность различных способов стерилизации семян гречихи № п/п Сорт, гибрид 70% раствором этанола и 10% раствором хлорамина Б концентрированной серной кислотой 1 2 1 2 1 Приморская 7 47 38,3 31 71,0 5 Приморская местная 31 13,0 30 100 6 Изумруд x Наташа 36 0 25 76,0 8 Приморская местная 31 13,0 30 100 Примечание: - обработано семян, шт.; 2 - эффективность стерилизации, %.

компоненты (в мг/л): тиамин-НСl - 2,0; пиридоксин-НСl - 1,0; гидролизат казеина - 1000,0; сахароза - 20000; агар микробиологический - 6000 при pH от 5,6 до 6,0. Культивирование проводят в пробирках с ватно-марлевыми пробками до получения асептических проростков в контролируемых условиях: 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения 4-5 тысяч люкс, температура 23±2°C.

При появлении из зоны семядольного узла асептического проростка растущего побега, отделяют его верхнюю часть (примерно длиной 10-20 мм) и помещают на питательную среду, включающую следующие компоненты (в мг/л):

Аммоний азотнокислый (NH₄NO₃) - 1650

Калий азотнокислый (KNO₃) - 1900

Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄) - 170

Магний сернокислый семиводный (MgSO₄×7H₂O) - 370

Кальций хлористый двухводный (CaCl₂×2H₂O) - 440

Железо сернокислое семиводное (FeSO₄×7H₂O) - 27,8

Трилон Б (Na₂ЭДТА×2H₂O) - 37,3

Борная кислота (H₃BO₃) - 6,2

Марганец сернокислый четырехводный (MnSO₄×4H₂O) - 22,3

Кобальт хлористый шестиводный (CoCl₂×6H₂O) - 0,025

Медь сернокислая пятиводная (CuSO₄×5H₂O) - от 9,2 до 23,0

Цинк сернокислый семиводный (ZnSO₄×7H₂O) - 8,6

Натрий молибденовокислый двухводный (NaMoO₄×2H₂O) - 0,25

Калий йодистый (KI) - 0,83

Тиамин-HCl - 2,0

Пиридоксин-HCl - 1,0

Гидролизат казеина - 1000,0

ИУК (индолил-3-уксусная кислота) - 0,5

ИМК (3-индолилмасляная кислота) - 0,2

Сахароза - 20000

Агар микробиологический - 6000

при pH от 5,6-6,0.

В таблице 2 приведены результаты испытания пяти вариантов питательных сред, среди которых среда Барсукова Е.Н. использована как наиболее близкий прототип (патент на изобретение №2229219, МПК⁷ A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.).

Таблица 2 Коэффициент размножения микроклонов гречихи на питательных средах различного состава Вариант среды Среднее количество микрорастений, шт. Выход растений за три пассажа, шт. I пассаж* II пассаж III пассаж Среднее за три пассажа Bohanec В., 6-БАП 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л 1,2 2,6 1,9 1,9 6,86 Суворова Г.Н., 6-БАП 2,25 мг/л, ИУК 0,2 мг/л 1,1 1,5 0,4 1,0 1,0 Барсукова Е.Н., ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л 2,0 2,8 2,8 2,5 15,63 БТМ₁, ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л, 23,0 мг/л CuSO₄×5H₂O 2,6 3,3 3,4 3,1 29,79 БТМ₂ ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л; 69,0 мг/л CuSO₄×5H₂O 1,1 1,3 0 0,8 0,51 Среднее по опыту 1,6 2,3 1,7 1,9 6,86 Примечание - * пассаж составляет 25-30 дней

Максимальное количество растений за три пассажа получено 29,79 штук при культивирования на среде БТМ₁, содержащей наряду с фитогормонами ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л дополнительно 23,0 мг/л CuSO₄×5H₂O.

Оптимальное для микроразмножения гречихи в условиях in vitro содержание в питательной среде сернокислой меди установлено экспериментально и приведено в таблице 3.

Таблица 3 Коэффициент размножения микроклонов гречихи на питательных средах с различным содержанием сернокислой меди № п/п Вариант среды (содержание сернокислой меди, мг/л) Количество микрорастений, шт. Выход растений
за три пассажа, шт. I пассаж* II пассаж III пассаж среднее за три пассажа 1 контроль 0,025 1,8±0,13 2,4±0,16 2,3±0,30 2,1±0,12 9,3 2 4,625 1,8±0,13 2,6±0,33 2,6±0,33 2,3±0,17 12,2 3 9,225 2,3±0,15 2,7±0,30 2,8±0,29 2,6±0,14 17,6 4 13,825 2,3±0,21 2,7±0,26 2,8±0,20 2,6±0,13 17,6 5 18,425 1,6±0,22 3,0±0,21 3,2±0,20 2,6±0,17 17,6 6 23,025 2,0±0,14 2,6±0,16 2,9±0,23 2,5±0,12 15,6 7 27,625 1,5±0,16 2,7±0,21 2,5±0,16 2,2±0,13 10,6 8 32,225 1,5±0,16 2,3±0,23 1,8±0,35 1,8±0,15 5,8 9 36,825 1,6±0,49 2,1±0,23 1,8±0,20 1,8±0,19 5,8 10 41,425 1,0±0,13 2,1±0,23 1,9±0,17 1,6±0,13 4,1 11 46,025 1,25±0,16 1,8±0,20 1,7±0,33 1,6±0,14 4,1   HCP₀₅       0,4 5,4 Примечание: *пассаж составляет 25-30 дней

В качестве контроля использовали среду Барсукова Е.Н., ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л (патент на изобретение №2229219, МПК⁷ A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.) со стандартным для минеральной основы по Мурасиге и Скугу содержанием меди сернокислой пятиводной - 0,025 мг/л. Добавление в питательную среду сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л статистически достоверно увеличило выход растений гречихи за три пассажа от 15,6 до 17,6 шт., что в 1,7-1,9 раза больше, чем на контрольной среде (табл.3).

Полученные микрорастения делят на черенки с пазушной почкой, культивируют, субкультивируют и укореняют на питательной среде одного состава, который приведен выше, с содержанием меди сернокислой пятиводной от 9,2 до 23,0 мг/л.

Условия культивирования асептических проростков, черенков и микрорастений аналогичны. Для получения семян укорененные растения гречихи из пробирок высаживают в почву.

Применение предлагаемого изобретения позволит повысить эффективность процесса размножения гречихи в условиях in vitro, значительно упростить и ускорить его, снизить затраты и существенно увеличить выход пробирочных растений.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян. Семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов. Субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений. 3 табл.

Способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян, отличающийся тем, что семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков, субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде.