СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПОЛОСТИ РТА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки защитных свойств слюны.

Состояние иммунной защиты в полости рта является одним из ведущих факторов в патогенезе основных стоматологических заболеваний (кариес, болезни пародонта). В настоящее время для оценки иммунного статуса полости рта определяют не только соотношение количества лейкоцитов и эпителиальных клеток в оральном смыве проба Ясиновского [1] но и их физиологическую активность, в частности, адгезивную активность всех клеток, фагоцитарную активность нейтрофилов и так далее [2] Наиболее информативным для оценки клеточного иммунитета полости рта является показатель фагоцитарной активности нейтрофилов.

Важно отметить, что клеточный материал для исследования фагоцитоза в полости рта получают, в основном, путем оральных смывов и саму реакцию фагоцитоза проводят в смывной жидкости. Получение фагоцитов из цельной слюны и постановка реакции в цельной слюне практически невозможны ввиду образования после центрифугирования слюны осадка муцина, склеивающего все клетки в единый конгломерат.

Известен способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов полости рта, взятой нами в качестве прототипа [2] Способ представляет собой микрометод оценки клеточного иммунитета по Лебедеву К. А. Понякиной И. Д. адаптированный к условиям полости рта, и состоит из двух этапов: получение клеточного материала и постановка реакции фагоцитоза.

Клеточный материал получают путем смыва полости рта 5-ю мл раствора Хенкса и осаждения центрифугированием. Осадок промывают этим же раствором и ресуспендируют. После этого клетки вновь осаждают, к осадку добавляют 0,3 мл раствора Хенкса и ресуспендируют. Полученную взвесь клеток используют для постановки реакции фагоцитоза.

К 0,05 мл полученной суспензии клеток добавляют 0,05 мл 0.05%-ной суспензии индикаторных частиц (пекарские дрожжи, стафилококки, латекс). Центрифугируют при 200g в течении 5 минут, инкубируют при 4 12^oC 30 минут. Из осадка делают мазок на предметном стекле, фиксируют, окрашивают и микроскопируют.

В препарате подсчитывают фагоцитарный индекс (ФИ) процент фагоцитирующих нейтрофилов (на 50-100 клеток) при увеличении 40, при правильной настройки света по Келлеру.

Однако, способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов полости рта по описанной методике недостаточно точен. Фагоцитарная активность в оральном смыве при оценке данным способом в 4 раза ниже, чем в крови и в два раза ниже, чем в десневой жидкости (см. таблицу). Снижение фагоцитарной активности ротовых нейтрофилов авторы способа прототипа объясняют меньшей, чем в десневой жидкости, жизнеспособностью ротовых нейтрофилов и тем, что миграция в полость рта является завершающим этапом жизненного цикла нейтрофила.

Но фагоцитоз важнейшая (основная) функция нейтрофила и она сохраняется высокой на протяжении всей жизни клетки [3)] Кроме того, данные самих авторов прототипа [2, с.14] свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий в количестве жизнеспособных нейтрофилов в десневой жидкости и в оральном смыве.

Для повышения точности способа определения фагоцитарной активности в полости рта за счет создания условий проведения реакции фагоцитоза, максимально близких к физиологическим, предлагается проводить последнюю в отцентрифугированной смешанной слюне пациента, лишенной муцина.

Способ осуществляется следующим образом.

После предварительного очищения полости рта от механических примесей, в рот набирают 10 мл раствора Хенкса и интенсивно полощут в течение одной минуты, после чего смывную жидкость возвращают в пробирку. Клетки смыва осаждают центрифугированием при 200g в течение 10 минут. К осадку добавляют 0,3 мл смешанной слюны пациента, полученной после забора смыва и отцентрифугированной при 200g в течение 15 минут. Тщательно ресуспендировав клеточный осадок, смешивают 0,1 мл полученной суспензии лейкоцитов с 0,1 мл 0,05 ной суспензии микробных клеток. Центрифугируют смесь при 200g в течение 5 минут, инкубируют при 37^oC 30 минут. Клетки осадка фиксируют, окрашивают по стандартной методике (азур-эозин Романовского-Гимза) и микроскопируют при световой иммерсии х90.

В мазке подсчитывают фагоцитарный индекс (ФИ) фагоцитирующих нейтрофилов на 100 клеток и фагоцитарное число (ФЧ) среднее число микробов, поглощенных одним нейтрофилом.

Фагоцитарная активность ротовых нейтрофилов оценена предлагаемым способом у 50 здоровых доноров с санированной полостью рта (см. таблицу).

Крайне низкая фагоцитарная активность ротовых нейтрофилов в прототипе связана с постановкой реакции фагоцитоза в нефизиологической для клеток среде смывной жидкости (раствор Хенкса). Как известно, для осуществления начальных стадий фагоцитоза (опсонизация, хемотаксис, адгезия) необходимо наличие в реакционной среде особых гуморальных факторов опсонинов (опсонировать "делать съедобным"). Такими опсонинами, определяющими фагоцитарную активность нейтрофилов, являются иммуноглобулины, компоненты комплемента, лизоцим и некоторые другие. Постановка реакции фагоцитоза в отцентрифугированной слюне, содержащей все необходимые факторы, отражает истинную фагоцитарную активность ротовых нейтрофилов.

Как видно из таблицы, фагоцитарная активность нейтрофилов орального смыва по предлагаемому способу достоверно выше, чем в прототипе и практически не отличается от активности клеток десневой жидкости, что подтверждает физиологичность нашего способа и позволяет отказаться от трудоемкого микрометода анализа фагоцитарной активности в десневой жидкости.

Пример конкретного выполнения.

У пациента Б. 30 лет, получили оральный смыв 10-ю мл раствора Хенкса в течение одной минуты, отцентрифугировали при 200g десять минут, слили надосадочную жидкость. Пациент в это время собирал в другую пробирку свою слюну (5 минут). К клеточному осадку смыва добавили 0,3 мл надосадочной жидкости из пробирки со слюной, предварительно отцентрифугированной при 200 g в течение 15 минут. Тщательно ресуспендировав осадок, забрали 0,1 мл полученной суспензии лейкоцитов и добавили 0,1 мл 0.05%-ной суспензии пекарских дрожжей. Центрифугировали смесь при 200g в течение пяти минут, инкубировали при 37^oC в термостате 30 минут. Затем сделали мазок на предметном стекле, зафиксировали метанолом (5 минут), окрасили азур-эозином (15 минут). При микроскопии мазка (увеличение 90) были подсчитаны ФИ и ФЧ.

У пациента Б. ФИ оказался равным 29% ФЧ 2.6
Источники информации
1. Быкова И. А. Кирюхина С. А. Чумаченко В. А. "Оценка функциональной активности нейтрофилов при патологии тканей пародонта: Методические рекомендации", Москва, 1984.

2. Робустова Т. Г. Лебедев К. А. Максимовский Ю. М. "Иммунный статус в полости рта: Методические рекомендации", Москва, 1990.

3. Полянцев В. А. "Нормальная физиология (учебное пособие). -М. Медицина, 1989.

Изобретение относится к медицине, а именно, к иммунологии и может быть использовано для оценки защитных свойств слюны. Сущность изобретения заключается в том, что с целью создания условий для реакции фагоцитоза, максимально близких к физиологическим, смещение нейтрофилов орального смыва и микробных клеток осуществляется в отцентрифугированной смешанной слюне пациента, лишенной муцина. Предлагаемый способ повышает точность определения уровня фагоцитарной активности в полости рта. 1 табл.

Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов полости рта, включающий получение нейтрофилов путем орального смыва, постановку реакции фагоцитоза с последующим подсчетом процента фагоцитирующих нейтрофилов, отличающийся тем, что постановку реакции фагоцитоза осуществляют в клеточном материале орального смыва, в который предварительно вносят надосадочную жидкость, полученную в результате центрифугирования слюны при 200 g в течение 15 мин.