Способ определения розеткообразующих клеток в биологических жидкостях Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

00 О) 4

IUD С 05

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинической иммунологии для оценки Т-, В-лимфоцитов и нейтрофилов у больных и здоровых.

Целью изобретения является повьпие- ние точности и сокращение времени определения.

Пример 1. У больного забирают из локтевой вены 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,3 мл раствора гепарина концентрации 200 ед. /мл. В пробирку добавляют 1 мл 3%-но- го раствора желатина в физрастворе, перемешивают, после чего отстаивают при 37 С в течение 25 мин. Верхний лейкоцитарный слой собирают (его объем 2 мл). В пробирку с выделенными таким образом лейкоцитами добавляют среду 199 до объема 10 мл, клетки осаждают центрифугированием при 400 g в течение Ю мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют К осадку добавляют 1 мл дистиллиро- ванной воды, через 15 с добавляют среду 199 до объема 10 мл. Клетки осаждают центрифугированием, надоса- дочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют, добавляют 0,8 мл среды 199.. Концентрация клеток в среде 0,6 10 кл/мл.

В три лунки планшета для иммунологических реакций помещают по 0,05 мл полученной суспензии клеток. После этого в одну лунку добавляют 0,06 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана в среде 199, в другую - по 0,05 мл 1%-ной суспензии эритроцитов мьшш (содержащей 20% эмбриональной телячь ей сыворотки), в третью лунку - 0,05 мл 1%-ной суспензии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием. Планшет плотно закрывают крьшкой с резиновой прокладкой, центрифугируют при 200 g в течение 5 мин, после чего инкубируют при 30 мин. Затем в каждую лунку осторожно добавляют по 0,05 мл 2%-ного раствора глутаро- вого альдегида. Через 5 мин надоса- дочную жидкость стряхивают в раковину, и в каждую лунку добавляют по 0,1 мл дистиллированной воды. Осадок ресуспендируют при помощи автоматического встряхивателя, после чего го товят мазки. Высушенные мазки фикси- нуют в метаноле, окрашивают метиловы зеленым - пиронином и подсчитывают количество Е- и М-розеткообразующих

лимфоцитов и нейтрофилов, Д-розетко- образующих лимфоцитов) и Д-фагоцити- рующих нейтрофилов на 100 соответствующих клеток.

В результате анализа у данного больного оказались следующие данные, %: Е-РОЛ 80; Е-РОН 17; М-РОЛ 22; М-РОН 14; Д-РОЛ 14; Д-фагоцитоза нейтрофилов 90 (РОЛ-розеткообразую- щие лимфоциты, РОН-розеткообразующие нейтрофилы, Е-зритроциты барана, М - эритроциты мьш1и, Д - клетки пекарски дрожжей).

Пример2. У донора забирают 0,3 мл крови из пальца при помощи туберкулинового шприца, смоченного раствором гепарина (концентрации 200 ед /мл). В пробирку, содержащую 0,3 мл крови, для лизиса эритроцитов приливают 9 мл дистиллированной воды, перемешивают в течение 30 с. Затем приливают 1 мл 10-кратного концентрата раствора Хенкса для восстановления осмотического давления, перемешивают клетки осаждают центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку приливают среду 199 до объема 0,3 мл. Полученную суспензию клеток (концентрация клеток 1010 кл/мл) использовали для постановки реакции розетко- образования и фагоцитоза.

0,05 мл полученной суспензии клеток вносят в лунку планшета для иммунологических реакций, куда приливают также 0,025 мл 1%-ной суспензии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, и 0,025 мл 1%-ной суспензии эритроцитов барана. В другую лунку планшета вносят 0,05 мл суспензии полученных клеток, 0,025 мл 1%-ной суспензии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, и 0,025 мл 1%-ной суспензии эритроцитов мьшш (содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки). Центрифугируют при 200 g в течение 5 мин и инкубируют при 4 С в течение ,30 мин. Затем в лунки осторожно добавляют 0,05 мл 20%-ного раствора глутарово- го альдегида, выдерживают в течение 5 мин, Надосадочную жидкость стряхивают в раковину, затем в лунки добавляют по 0,1 мл дистиллированной воды Осадок ресуспендируют и готовят мазки. Высушенные мазки фиксируют в метаноле и окрашивают метиловым зеленым - пиронином. При этом лимфоциты

окрашивались в темно-фиолетовын цвет нейтрофилы - в голубой, клетки пекарских дрожжей - в ярко-малиновый цвет а эритроциты имели бледно-бежевую окраску, что дает возможность одновременного подсчета не менее четырех показателей. В результате проведения реакции одновременно с клетками пекарских дрожжей и эритроцитами бара- на определили следующие данные, %: Е-РОЛ 68; Е-РОН 32; Д-РОЛ 12; Д-фаго- цитоза 85; двойные розетки ЕД-РОЛ 6. Д-фагоцитирующие Е-розеткообразующие нейтрофилы 11. В результате проведе- ния реакции одновременно с клетками пекарских дрожжей и эритроцитами мыши определили, %: М-РОЛ 6; М-РОН 10; Д-РОЛ 12; Д-фагоцитоз 82; двойные розетки МД-РОЛ 2; Д-фагоцитирующие М-розеткообразующие нейтрофилы 3.

. ПримерЗ. У больного получают смыв из зева путем ополаскивания горла 10 мл среды 199 (предварительно полость рта очищали для удаления загрязнения). Клетки смыва из зева осаждают центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Добавляют среду 199 до объема 10 мл, клетки вновь осаждают центрифугированием в том же режиме, надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему среду 199 до объема 0,2 мл. Концентрация клеток составила 8-10 кл/мл. С полученными клетками ставили реакцию розетко- образования с эритроцитами барана, иьппи и клетками пекарских дрожжей так как описано в примере 1. В результате анализа получили следующие данные, %: уровень Е-РОН 30; Е-РО эпителиальных клеток 81; М-РОН 12; М-РО эпителиальных клеток 61; Д-РОН 35; Д-фагоцитоз нейтрофилов 8; Д-РО эпителиальных клеток 75.

ПримерА. У больного получают смыв из бронхов путем лаважа бронхиального дерева, который осуществляют во время фибробронхоскопии. Клетки осаждают центрифугированием при 200 g в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Добавляют среду 199 до объема 10 ип, клетки вновь осаждают центрифугированием в том же режиме, надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 0,5 мл среды 199, конг15 0

5 0 .,,

S

5

0

g

центрация клеток 7 10 кл./мл. С полученными клетками ставили реакцию Е-, М- и Д-розеткообразования так, как описано в примере 1.

В результате анализа получили следующие данные, %: Е-РОЛ 62; Е-РОН 26; М-РОЛ 12; М-РОН 7; Д-РОЛ 12; Д-РОН 42; Д-фагоцитоз нейтрофилов 18; Е-РО альвеолярных макрофагов 38; М-РО альвеолярных макрофагов 45; Д-фагоцитоз альвеолярных макрофагов 36.

Предлагаемый способ обладает более высокой точностью по сравнению с известным. Для определения точности способа ставили три параллельные пробы из одной крови и определяли максимальное различие показателей среди этих проб. Данные показывают, что различия результатов при постановке трех параллельных проб по предлагаемому способу были достоверно (PLO,05) и существенно (в 1,5-2,4 раза) ниже, чем по известному, что свидетельствует о более высокой точнсТсти предлагаемого способа.

Осуществление предлагаемого способа занимает значительно меньше времени, чем осуществление известного, так как исключаются операции раскапывания эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугирования при от глутарового альдегида, все операции по подготовке и центрифугированию (уравновешивание и расстановка пробирок), существенно (не менее, чем в 2 раза) сокращаются операции по раскапыванию клеток, индикаторных частиц, глутарового альдегида и дистиллированной воды. В целом суммарное количество операций сокращается с 13 (известный) до 9 (предлагаемьп способ). Поэтому для анализа 50 клеточных суспензий на Е-, М- и Д-розет- кообразование требуется по предлагаемому способу 82 мин, в то время как по известному 150 мин, т.е. в 1,8 раз меньше. Для анализа 100 клеточных суспензий по предлагаемому способу требуется 100 мин, по известному 210 мин, т.е. меньше в 2,1 раза («ем больше количество анализов, тем больше экономия времени по предлагаемому способу).

Предлагаемый способ является более экономичным, чем известный, поскольку исключает использование пробирок (3 пробирки на один анализ крови на Е- М- и Д-РО), штативов, требу51364986

ет меньшего количества центрифуг, среды 199 (в два раза), дистиллированной воды (не менее, чем в 100 раз).

5 Формула изобретения

Т, Способ определения розеткооб- разукяцих клеток в биологических жидкостях, включающий выделение клеток, ю смепшвание с индикаторными частицами, центрифугирование, инкубацию, обработку глутаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и подсчетом розеткообразующих клеток, о т- 15 личающийся тем, что, с це6

лью повьшения точности и сокращения времени определения, исследуемые клетки в концентрации 6-10 млн кл./мл вносят в лунки планшета, добавляют равньй объем 1%-ной суспензии индикаторных частиц, герметично закрывают во время центрифугирования и инкубации, а обработку осадка клеток ведут равным объемом 2%-ного глутарового альд(5гида.

2„ Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве индикаторных частиц используют эритроциты мьоии, или эритроциты барана, или клетки пекарских дрожжей.

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, предназначено для оценки Т-, В-лим- фоцитов у больных и здоровых. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени определения. Для этого из пробы крови выделяют клетки