СРЕДСТВО ГУМИНОВОЙ ПРИРОДЫ, УСИЛИВАЮЩЕЕ ФАГОЦИТИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК Российский патент 2025 года по МПК A61K35/10 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, результаты которого могут быть использованы для активации неспецифической резистентности организма и коррекции патологического состояния иммунной системы, связанного с недостаточностью развития Th1-зависимого иммунного ответа при хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваниях.

Иммунитет - представляет собой сложную полиорганную и многокомпонентную систему, направленную на защиту от чужеродных и опасных агентов. Условно выделяют врожденный и приобретенный иммунитет. Врожденный иммунитет (клеточное звено), направленный на незамедлительное распознавание и уничтожение «врага», проявляется посредством активации фагоцитов, секреции цитокинов и медиаторов воспаления. Приобретенный иммунитет (гуморальное звено) формирует специализированные клетки против антигена и только потом ликвидирует его, формируя антигенную память. При этом клетки врожденного иммунитета (дендритные клетки, макрофаги, нейтрофилы, а также эпителиальные клетки), прежде всего за счет способности к фагоцитозу формируют первую согласованную реакцию на проникновение возбудителей в организм, но и через паттерн-распознающие рецепторы (PAMPs) распознают патогены и через трансмембранные белки, известные как Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs) запускают синтез и секрецию цитокинов, которые активируют защитные программы врожденного или адаптивного иммунитета [1, 2, 3, 4].

В настоящее время количество известных средств коррекции нарушений системы иммунитета исчисляется сотнями соединений различной природы. Существуют экзогенные иммуностимуляторы на основе растений, животных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (полисахариды, фосфолипиды мембран, гликопептиды, модифицированные токсины, ДНК и РНК микроорганизмов, вакцины и др.), пептидные эндогенные стимуляторы природного и синтетического происхождения (препараты тимуса, селезенки, костного мозга, интерлейкины и др.), синтетические стимуляторы иммунитета (левамизол, леакадин, тимоген). Однако широко используются лишь несколько десятков иммуностимуляторов и практически все имеют те или иные нежелательные побочные эффекты [5, 6].

В экспериментальной медицине и ветеринарии растет интерес к изучению и использованию гуминовых кислот торфа (ГК), состоящих из высокомолекулярных, темноокрашенных органических метоксисодержащих, гидрокси- и оксокарбоновых кислот, имеющих значительные различия в зависимости от исходных растительных остатков, степени разложения и ботанического вида исходных растительных остатков, а также климатических условий и времени формирования почвенного органического вещества [7]. В научной литературе опубликованы данные об их противоопухолевых, гепатопротекторных, ранозаживляющих свойствах. Многочисленные исследования последних лет за рубежом позволяют считать ГК ценным лекарственным сырьем и в России, начиная с 60-х годов XX века, ГК и их соли с хорошим результатом апробировались на животных, повышая устойчивость организма к условиям среды [8, 9, 10, 11, 12, 13]. Гуминовые вещества способны значительно усиливать фагоцитоз за счет индуцирующего действия фенольных групп этих соединений, влиять на метаболизм белков и углеродов бактерий, катализируя этот процесс и напрямую ускоряя разрушение клеток бактерий и вирусов. Показано, что добавление в пищу 0,5-5% ГК различным сельско-хозяйственным животным (поросятам, курам, рыбам) приводило к увеличению целевых показателей (привес, качество продукции, конверсия корма, стрессоустойчивость), но и оказывало иммуностимулирующее действие, проявляющееся повышением фагоцитарной активности и активацией В-клеточного ответа (увеличение соотношения CD4+: CD8+ лимфоцитов) [14, 15, 16, 17]. В предыдущих исследованиях авторами показано, что ГК, экстрагированные натрий пирофосфатом из торфа различных болот Томской области, не содержат примеси эндотоксина и обладают иммуномодулирующей и противоаллергической активностью [18-22].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуностимулирующих средств природного происхождения, обладающих способностью усиливать фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток и, соответственно, неспецифическую резистентность клеток для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых ГК, выделенных экстракцией натрий пирофосфатом из торфа различных зон олиготрофного болота, обладающих способностью усиливать фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулятора, способного усиливать фагоцитарную активность макрофагальных клеток, водорастворимых ГК, выделенных из торфа олиготрофного болота. Новое свойство водорастворимых ГК, выделенных при экстракции натрий пирофосфатом, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, и описание этого свойства не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Получение образцов ГК. Из трех различных точек олиготрофного болота, расположенного в Бакчарском болотном массиве юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар в Томской области, отбирали образцы торфа согласно ГОСТ 17644-83, которые затем высушивали, измельчали, просеивали через сито (диаметр отверстий 3 мм), обрабатывали 0,1 М раствором натрий пирофосфата в массовом соотношении 1:100 при постоянном перемешивании, в течение 8 ч в реакторе Р-100 отделяли вакуумной фильтрацией (нутч-фильтр) экстракта, который обрабатывали хлороводородной кислотой (рН=1-2), осаждали ГК центрифугированием, отмывали осадок очищенной водой (рН=7), высушивали при комнатной температуре. Полученные образцы ГК были свободны от примеси эндотоксина и отличались друг от друга, во-первых, по виду торфа, во-вторых, месту и глубине отбора, а также степени разложения, зольности, содержанию ГК в образце, и были охарактеризованы по элементному составу и молекулярно-массовому распределению (табл. 1-2).

Влияние ГК на фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов оценивали у мышей линии C57BL/6 [23] в возрасте 8-10 недель, полученных из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томский НИМЦ РАН. Все манипуляции (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране животных используемых в научных целях, ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». ГК вводили мышам ежедневно внутрибрюшинной инъекцией в течение 10 дней в 0,1 мл физиологического раствора (ФР) в дозе 1 мг/кг массы тела или препарат сравнения ликопид (ЗАО «Пептек», Россия) - 2 мг/кг.Активность фагоцитов определяли через 24 часа после последнего введения веществ.

Для определения фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышам в брюшную полость вводили 2 мл ледяной суспензии туши (0,05%) в физиологическом растворе (ФР), через 10 мин пятью мл ФР вымывали клетки перитонеального экссудата, дважды отмывали центрифугированием, ресуспендировали в 2 мл ФР, в которых подсчитывали концентрацию ядросодержащих клеток перитонеального экссудата (КПЭ) и процент фагоцитирующих клеток. После чего суспензию центрифугировали, супернатант удаляли, в лизированном дистиллированной водой клеточном осадке с помощью спектрофотометра Titertek Multiskan® MCC (Labsystems, Финляндия) определяли оптическую плотность раствора (длина волны 620 нм), отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами. Результаты выражали в условных единицах, отражающих оптическую плотность лизата, соотнесенную с количеством фагоцитирующих клеток (фагоцитарный индекс - ФИ) [24].

Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови из хвостовой вены мышей отбирали 10 мкл периферической крови, смешивали с 3 мкл раствора гепарина (500 ЕД/мл) и 10 мкл латекса (60-80×10³/мкл), инкубировали 30 мин на шейкере при 37°С, центрифугировали (5-6 мин, 1000 об/мин), удаляли 10 мкл надосадка, из ресуспендированного осадка делали мазок, который фиксировали эозином метиленовым синим по Май-Грюнвальду и окрашивали азур II-эозином. Далее подсчитывали процент нейтрофилов, поглотивших частицы латекса (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ) [23].

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0.

Пример 1.

Курсовое введение ГК, экстрагированных натрий пирофосфатом из торфа олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Икса и Бакчар, приводило к увеличению количества клеток перитонеального экссудата в 4-5,9 раз и числа фагоцитирующих макрофагов в 5,3-8,8 раз, что значительно превышало показатели препарата сравнения - ликопида (табл. 3). Фагоцитарный индекс (ФИ), относительное количество макрофагов, поглотивших тушь, после приема ГК увеличивался в 1,2-1,4 раза и достигал значений ликопида. Количество туши, поглощенной клетками перитонеального экссудата мышей, получавших ГК, также вырастало в 2,3-2,9 раза. Трехкратное снижение фагоцитарного числа (ФЧ) - среднего количества туши, поглощенного одним макрофагом, обусловлено значительным пятикратным ростом числа фагоцитирующих макрофагов.

Пример. 2.

Курсовое введение мышам ГК, экстрагированных натрий пирофосфатом из торфа олиготрофного болота, повышало ФИ - поглощение частиц латекса нейтрофилами периферической крови, в 1,7 (ГК-1 и ГК-3) и в 2,2 раза (ГК-2). При этом показатели ГК-2 не отличались от значений препарата сравнения ликопида, а ГК-1 и ГК-были ниже в 1,6 раза (табл. 4).

Прием ГК-1 и ГК-3 приводил к увеличению ФЧ - среднее число частиц латекса, поглощенного одним нейтрофилом, в 1,9-2,7 раза, что превышало показатели ликопида в 2,4 и 1,7 раза, соответственно. ФЧ после инъекций ГК-2 не изменялось, что компенсировалось увеличением числа нейтрофилов, поглотивших частицы латекса.

Таким образом, экспериментально установлено, что гуминовые кислоты, выделенные натрий пирофосфатом из торфа олиготрофного болота, способны усиливать неспецифическую резистентность макрофагов еще до взаимодействия с другими иммунокомпетентными клетками за счет активации их фагоцитирующих свойств, увеличивая, как число фагоцитов, так и интенсивность поглощения частиц. Выявленное усиление показателей фагоцитоза в перитонеальных макрофагах и нейтрофилах периферической крови способствует, прежде всего, формированию первичной реакции на проникновение возбудителей в организм, что в дальнейшем посредством паттерн-распознающих рецепторов и Toll-подобных рецепторов приводит к усилению распознания патогенов активации секреции цитокинов, которые запускают защитные программы врожденного или адаптивного иммунитета. Полученные данные можно использовать для разработки малотоксичных средств растительного происхождения, усиливающих иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах, хронических и онкологических заболеваниях.

Список литературы

1. Хаитов P.M. Руководство по клинической иммунологии: Диагностика заболеваний иммунной системы // Издательство: ГЭОТАР-Медиа, 2009, 256 стр.

2. Kumar Н., Kawai Т., Akira S. Pathogen recognition by the innate immune system, (англ.) // International Reviews Of Immunology. - 2011. - February (vol. 30, no. 1). - P. 16-34. - doi:10.3109/08830185.2010.529976. - PMID 2123532332

3. Литвицкий П.Ф., Синельникова Т.Г. Врожденный иммунитет: механизмы реализации и патологические синдромы. Часть 3 / Вопросы современной педиатрии / Т. 8, №3, с. 54-66. 2009.

4. Gene Mayer. Immunology - Chapter One: Innate (non-specific) Immunity. Microbiology and Immunology On-Line Textbook. USC School of Medicine (2006).

5. Энциклопедия лекарств «РЛС». https://www.rlsnet.ru

6. Мирошник О.А., Редькин Ю.В. Иммуномодуляторы в России // Справочник. 2-е издание, исправленное, дополненное. Омск: Изд-во ГП «Омская областная типография». - 2006. 432 с.

7. Кухаренко Т.А. Об определении понятия и классификации гуминовых кислот // Химия твердого топлива. - 1979. - №5. - С. 3-11.

8. Гуминовые кислоты торфа и препараты на их основе / И.И. Лиштван [и др.] // Природопользование. - 2004. - Вып. 10. - С. 114-119.

9. Полуянова И.Е. Биологическая активность гуминовых веществ, получаемых из торфа, и возможности их использования в лечебной практике // Международные обзоры: клиническая практика и здоровье. 2017. №4 с. 114-122..

10. Бузлама А.В., Чернов Ю.Н. Анализ фармакологических свойств, механизмов действия и перспектив применения гуминовых веществ в медицине // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - Т. 73, - №9. - С. 43-48.

11. Белоусов М.В., Ахмеджанов Р.Р., Зыкова М.В., Гурьев А.М., Юсубов М.С.Исследование гепатозащитных свойств нативных гуминовых кислот низинного торфа Томской области // Хим.-фарм. журн. - 2014. Т. 48, №4. С. 28-31.

12. Vetvicka V., Garcia-Mina J.M., Yvin J.С.Prophylactic effects of humic acid-glucan combination against experimental liver injury // Journal of Intercultural Ethnopharmacology. - 2015. -V. 4. - Is. 3. - P. - 249-255.

13. Vetvicka V., Vashishta A., Fuentes M., Baigorri R., Garcia-Mina J.M., Yvin J.C. The relative abundance of oxygen alkyl-related groups in aliphatic domains is involved in the main pharmacological-pleiotropic effects of humic acids. // J. Med. Food. 2013. V. 16. Is. 7. P. 625-632. doi: 10.1089/jmf.2012.0212. PMID: 23875902; PMCID: PMC3719442

14. Mudroňová D., Karaffová V., Pešulová Т., Koščová J., Cingel'ová Maruščáková I., Bartkovský M., Marcinčáková D., Ševčíková Z., Marcinčák S. The effect of humic substances on gut microbiota and immune response of broilers // Food and Agricultural Immunology. 2020. V. 31. Is. 1. P. 137-149. doi.org/10.1080/09540105.2019.1707780

15. Mudroňová D., Karaffová V., Semjon В., Nad' P., Koščová J., Bartkovský M., Makiš A., Bujňák L., Nagy J., Mojžišová J., Marcinčák S. Effects of Dietary Supplementation of Humic Substances on Production Parameters, Immune Status and Gut Microbiota of Laying Hens. // Agriculture. 2021. V. 11. P. 744. https://doi.org/10.3390/agriculture11080744

16. Bujňák L., Hreško Šamudovská A., Mudroňová D., Nad' P., Marcinčák S., Maskal'ová I., Harčárová M., Karaffová V., Bartkovský M. The Effect of Dietary Humic Substances on Cellular Immunity and Blood Characteristics in Piglets. // Agriculture. 2023, V. 13, P. 636. https://doi.org/10.3390/agriculture13030636

17. Lieke Т., Steinberg C.E.W., Pan В., Perminova I.V., Meinelt Т., Knopf K., Kloas W. Phenol-rich fulvic acid as a water additive enhances growth, reduces stress, and stimulates the immune system of fish in aquaculture. // Sci Rep.2021 Jan 8; 11(1):174. doi: 10.1038/s41598-020-80449-0. PMID: 33420170; PMCID: PMC7794407.

18. Патент (RU) на изобретение №2610446 (опубликовано 13.02.2017, Бюл. №5). Средство, повышающее продукцию оксида азота макрофагами in vitro, на основе гуминовых кислот из торфа болот томской области и способ его получения. Заявка №2015131867 Зыкова М.В., Данилец М.Г., Кривощеков С.В., Трофимова Е.С., Лигачёва А.А., Шерстобоев Е.Ю., Юсубов М.С., Белоусов М.В. Приоритет изобретения 30.07.2015. Зарегистрировано 13.02.2017.

19. Патент (RU) на изобретение №2662094 Средство гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью (опубл. 23.07.2018, Бюл. №21), заявка №2017129063. Данилец М.Г., Зыкова М.В., Трофимова Е.С., Лигачева А.А., Шерстобоев Е.Ю., Данилец А.В., Белоусов М.В., Юсубов, Жукова К.С., Кривощеков С.В., Логвинова Л.А. Приоритет изобретения 14.08.2017. Зарегистрировано 23.07.2018.

20. Патент (RU) на изобретение №2716504 Средство, гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью (опубл. 12.03.2020, Бюл. №8) Трофимова Е.С., Зыкова М.В., Данилец М.Г., Лигачева А.А., Шерстобоев Е.Ю., Белоусов М.В., Юсубов М.С., Жукова К.М., Кривощеков С.В., Логвинова Л.А., Братишко К.А. Заявка №2019118330, приоритет изобретения 13.06.2019, зарегистрировано 12.03.2020.

21. Патент (RU) на изобретение №2750098 Средство гуминовой природы, обладающее противоаллергической активностью (Опубликовано 22.06.2021, Бюл. №18) Трофимова Е.С., Зыкова М.В., Данилец М.Г., Лигачёва А.А., Шерстобоев Е.Ю., Белоусов М.В., Жукова К.М., Скогорева Л.С., Кривощеков С.В., Логвинова Л.А., Братишко К.А., Цупко А.В., Михалев Д.А. Приоритет изобретения 16.03.2020, Заявка №2020110972, зарегистрировано 22.06.2021.

22. Патент (RU) на изобретение №2726504 Средство гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующей активностью (Опубликовано: 12.03.2020 Бюл. №8) Трофимова Е.С., Зыкова М.В., Данилец М.Г., Лигачева А.А., Шерстобоев Е.Ю, Белоусов М.В., Юсубов М.С., Жукова К.М., Кривощеков С.В., Логвинова Л.А., Братишко К.А. Приоритет изобретения: 13.06.2019. Заявка: 2019118330, 13.06.2019

23. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 4.1. - М.: Гриф и К. 2013. - С. 51-63.

24. Коваленко Л.П., Федосеева В.Н., Дурнев А.Д., Иванова А.С., Мастернак Т.Б., Миронов А.Н., Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Жоголева И.Б., Верстакова О.Л., Радченко Л.У. Методические рекомендации по оценке аллергизирующих свойств лекарственных средств // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / отв. ред. А.Н. Миронов. Москва, 2013. С. 51-63.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, результаты которого могут быть использованы для активации фагоцитоза клеток и усиления неспецифической резистентности макрофагов еще до взаимодействия с другими иммунокомпетентными клетками организма при коррекции патологического состояния иммунной системы, связанного с недостаточностью развития Th1-зависимого иммунного ответа при хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваниях. Предлагается применение водорастворимых гуминовых кислот из торфа олиготрофного болота, полученных путем предварительного высушивания, измельчения, просеивания через сито сырья, дальнейшей обработки 0,1 М раствором натрий пирофосфата в массовом соотношении 1:100 при постоянном перемешивании, в течение 8 ч, отделения на вакуумном нутч-фильтре, растворения полученного экстракта хлороводородной кислотой рН=1-2, осаждения центрифугированием, отмывания осадка очищенной водой рН=7 и высушивания при комнатной температуре, со среднемассовой молекулярной массой 39698,0 Да, среднечисленной молекулярной массой 7737,8 Да, медианой 17526,4 Да и полидисперсностью 5,1; со среднемассовой молекулярной массой 22783,9 Да, среднечисленной молекулярной массой 6110,2 Да, медианой 11798,9 Да и полидисперсностью 3,7; и со среднемассовой молекулярной массой 18755,3 Да, среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, медианой 9558,3 Да и полидисперсностью 3,9 в качестве средства, усиливающего фагоцитирующую активность клеток. Вышеописанное применение расширяет арсенал нетоксичных иммуностимулирующих средств природного происхождения, обладающих выраженной способностью усиливать фагоцитирующие свойства макрофагов и нейтрофилов, увеличивая как число фагоцитов, так и интенсивность поглощения частиц. 4 табл., 2 пр.

Применение водорастворимых гуминовых кислот из торфа олиготрофного болота, полученных путем предварительного высушивания, измельчения, просеивания через сито сырья, дальнейшей обработки 0,1 М раствором натрий пирофосфата в массовом соотношении 1:100 при постоянном перемешивании, в течение 8 ч, отделения на вакуумном нутч-фильтре, растворения полученного экстракта хлороводородной кислотой рН=1-2, осаждения центрифугированием, отмывания осадка очищенной водой рН=7 и высушивания при комнатной температуре, со среднемассовой молекулярной массой 39698,0 Да, среднечисленной молекулярной массой 7737,8 Да, медианой 17526,4 Да и полидисперсностью 5,1; со среднемассовой молекулярной массой 22783,9 Да, среднечисленной молекулярной массой 6110,2 Да, медианой 11798,9 Да и полидисперсностью 3,7; и со среднемассовой молекулярной массой 18755,3 Да, среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, медианой 9558,3 Да и полидисперсностью 3,9 в качестве средства, усиливающего фагоцитирующую активность клеток.