СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ НА ПЛОТНЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕДАХ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 C12N11/14 

Изобретение касается способа ферментации на плотных культуральных средах, предусматривающего обработку материала на основе силиката источником питательных веществ, добавление одного или более видов микробов и поддержание полученной таким образом смеси в условиях, оптимальных для развития микробов.

Способ такого типа известен, например, из патента США N 4327181, кл. МКИ C 12 N 11/14 (опубл. 1982). В качестве плотного носителя биомассы в известном способе служит такой силикатный материал, как вермикулит.

Культивирование микроорганизмов на плотных культуральных средах является традиционной методикой, в частности, в пищевой промышленности, например, при производстве сыров типа "рокфор" и восточных продуктов типа koji. Эту методику долго использовали, не вникая в ее микробиологические и ферментативные особенности.

В последние годы появилось понимание того, что в биотехнологии процессы ферментации на плотных культуральных средах (ФПС) являются технологией, заслуживающей внимания наряду с глубинной ферментацией, которую используют чаще всего.

Во многих случаях ФСП является единственно возможной ферментацией при производстве некоторых видов продуктов ввиду физиологии роста микроорганизмов. Часто ФПС является также более экономичным процессом, чем глубинная ферментация, так как требования к асептике не так строги. Процесс с использованием ФПС более прост, а стоимость последующей обработки продукта ниже вследствие меньшего содержания в нем влаги.

Пригодность методики ФПС главным образом зависит от свойств культуральной среды: питательных веществ, способности удерживать воду и структуры среды. Обычно для ФПС используют среды, являющиеся сложными материалами, которые служат одновременно как источники питательных веществ, связыватели воды и носители. Примеры таких материалов включают зерно, мякину, рубленную солому, опилки, торф и компост (например, патент США N 4748021, патент Финляндии N 69390). Иногда к таким средствам добавляют компоненты, улучшающие структуру среды, такие как гипс или известь.

Промышленное использование культуральных сред, перечисленных выше, основано отчасти на их низких ценах и доступности. При разработке новых биотехнологических продуктов, таких как микробный посевной материал, первостепенную важность имеет то, чтобы свойства конечного продукта точно соответствовали желаемым. Например, если биомассу, содержащую целлюлозу, использовать в качестве среды для ФПС, то практически почти невозможно получить из нее посевной материал в виде сухого порошка, применимого для покрытия семян или для распыления.

Упомянутый выше патент США N 4327181, использующий в качестве носителя вермикулит, представляет собой усовершенствование способов, использующих целлюлозные носители, но все же не устраняет всех проблем. Дело в том, что при составлении рецептур препаратов, содержащих живые микроорганизмы, эти микроорганизмы должны быть представлены в легко применимой форме, обычно в виде жидких концентратов или порошков, чтобы использовать их путем распыления. Материал-носитель должен не только обеспечивать распыление препарата, но и служить разбавителем. Он также должен защищать микроорганизмы, и с этой целью в препарат обычно вводят, например, агенты, защищающие от УФ, или антиокислители. Материал-носитель должен иметь значительную поверхность, хорошую буферную емкость и уровень pH в нужном диапазоне. Вермикулит не очень подходит в качестве носителя, поскольку это природный материал, который очень изменчив, кроме того, в нем могут присутствовать компоненты, подавляющие рост микробов. Другие аналогичные материалы, такие как каолинит, монтмориллонит и проч. также не обеспечивают стабильных свойств получаемого препарата.

Поэтому существует потребность для промышленного производства микробных препаратов в применении при культивировании или при составлении рецептов недорогих и однородных по качеству материалов-носителей, обеспечивающих желаемые полезные свойства культуральной среды и конечного продукта.

Некоторые из важных требований, предъявляемых к культуральным средам для ФПС в промышленности, приводятся ниже.

Структура культуральной среды должна быть пористой, предпочтительно, гранулированной, чтобы микробы имели максимальную поверхность для роста на единицу объема среды. Гранулированные структуры обеспечивают достаточное поступление кислорода к микробам.

Содержание влаги должной быть достаточно высоким, чтобы обеспечить рост микробов в среде, однако количество свободной воды в среде должно быть как можно меньшим, чтобы вода не закрывала пути поступления кислорода. Высокое содержание воды также будет приводить к увеличению затрат на сушку и разделение при последующей обработке.

Питательные вещества должны присутствовать для экономичности процесса точно в тех количествах, которые требуются для того, чтобы микробы росли и/или производили желаемый компонент с желаемой скоростью
Последующая обработка. Культуральная среда должна быть легкой в обращении как при введении в ферментер, так и при извлечении из него. В случае изготовления посевного материала также необходимо, чтобы среда легко высушивалась, причем микробы или их споры должны перенести высушивание. После сушки также часто приходится измельчать продукт в порошок, такое измельчение должно быть мягким, чтобы микробы чрезмерно не пострадали.

Рецептура. Предпочтительно, чтобы среда содержала компоненты, которые бы придавали продукту особые свойства (прилипание к семенам растений, неслеживаемость, суспендируемость).

Стоимость культуральной среды должна быть невысокой, чтобы цена конечного продукта оставалась приемлемой для потребителя.

Настоящее изобретение решает эти задачи тем, что в предлагаемом способе ферментации на плотных культуральный средах, предусматривающем обработку материала на основе силиката источником питательных веществ, добавление одного или более видов микробов и поддержание полученной таким образом смеси в условиях, оптимальных для развития микробов, в качестве материала на основе силиката используют гидрофильный, по существу, свободный от катионов и пористый кремнезем. Используемый по изобретению кремнезем получают посредством вымывания катионов из силикатных материалов. Кремнеземная структура превосходно применима в качестве материала-носителя для ФПС и для микробных препаратов, содержащих живые микроорганизмы. Благодаря своим поверхностным свойствам кремнеземная структура состоит из гидрофильных частиц со значительной поверхностью. Их пористый каркас состоит, в основном, из микро- и мезопористых структур с естественной способностью удерживать влагу, адсорбированную на их поверхности. Влага находится, в основном, в порах, поэтому пространство между частицами остается сухим.

Кремнеземную структуру желаемого типа получают из силикатного минерала путем вымывания катионов кислотой. В таких силикатных структурах пространства, оставляемые катионами, заполняются атомами водорода и поверхность становится гидрофильной.

Любые дефекты решетки минералов способствуют проникновению кислоты и выщелачиванию катионов. В примере 1 такой дефект имеет место вследствие того, что атомы железа частично являются двухвалентными, а другая их часть - трехвалентными. Когда двухвалентные атомы железа окисляются до трехвалентных в процессе кислотного выщелачивания, то ионный радиус атомов железа уменьшается, и в решетке образуется больше пространства, в котором кислота получает доступ к катионной структуре для выщелачивания катионов без ущерба для основной структуры силиката. Почти во всех природных силикатах имеются дефекты решетки, с помощью которых силикаты выщелачиваются с образованием вышеупомянутых кремнеземных структур.

При производстве кремнезема, используемого по изобретению, исходным сырьем служат частицы таких силикатов, как флогопит, биотит, вермикулит, бентонит или каолинит. Предпочтительно использовались осадочные силикаты, в частности, флогопит или биотит, но можно также использовать и синтетическую слюду.

При обработке силикатных частиц кислотой для удаления катионов, имеющихся в силикате, используемая кислота представляет собой водный раствор, содержащий 0,7 70 мас. кислоты, предпочтительно 4-65 мас. Соответствующий диапазон pH в этом случае может составлять 0 7. Температурный диапазон обработки предпочтительно составляет 0 100^oC при атмосферном давлении. Некоторыми подходящими кислотами являются H₂SO₄, HCl, HNO₃, HF, HBr, HI, HCLO₃, HBrO₃, HClO₄, HPO₄, а также лимонная, салициловая, винная, щавелевая кислоты или смеси указанных кислот. Наиболее предпочтительными кислотами являются серная, азотная и соляная кислоты.

Кислотную обработку можно проводить при необходимости в присутствии окислительных или восстановительных добавок. Примеры окислительных добавок включают HNO₃, H₂O₂, MnO(-)4

,CrO(2-)7,ClO(-)4 ClO₃, O₂, персульфаты, Cl₂, Br₂. Примеры восстановительных добавок включают Sn(II), Fe(II), S203^(-), Cu(I), альдегиды, кетоны, H₂PO(-)4 сульфиты, фосфиты, V(II) и V(III). Количество используемой окислительной или восстановительной добавки зависит от степени ее воздействия на растворимость катионов, которую желательно получить. Обычно добавляемые количества составляют 0 20 мас. от массы исходного материала.

Плотность полученного кремнезема в результате кислотного выщелачивания снижается приблизительно на 30 50% по сравнению с плотностью исходного силиката. Таким образом, продукт по изобретению будет значительно легче по массе, чем известные аналогичные материалы не выщелоченные.

Предпочтительный диапазон размеров частиц кремнезема, используемого по изобретению, варьирует в зависимости от применения. Обычно этот размер составляет 1 2000 мкм, наиболее предпочтительно 10 900 мкм. Площадь специфической поверхности находится в пределах диапазона приблизительно 10 - 1000 м²/г, что позволяет использовать такой кремнезем для применений, требующих наличие значительной специфической поверхности.

Таким образом, продукт по изобретению является кремнеземной структурой с клеточным посевным материалом на ее поверхности. В качестве посевного материала могут служить, например, грибки, бактерии, растительные клетки или клетки животных. Клеточный материал может либо выращиваться на поверхности кремнеземной структуры посредством ФПС, либо может смешиваться с кремнеземом уже после выращивания, в этом случае клеточный (микробный) материал выращивают отдельно посредством метода глубинной ферментации.

В качестве источника питательных веществ в ФПС пригоден любой источник питательных веществ, растворимый или нерастворимый, например хитин. После культивирования в статическом колоночном реакторе или после смешанной ферментации на плотной среде, а также, возможно, после высушивания продукт готов к употреблению. Предшествующая и последующая обработка продукта (измельчение, стерилизация) очень проста, поскольку основные свойства кремнеземной структуры сохраняются в процессе обработке.

Благодаря гранулярности среды площадь поверхности для культивирования микроорганизмов велика, и даже в больших реакторах не возникает помех поступлению кислорода к микроорганизмам. Извлечение среды по окончании ферментации из реактора также не представляет трудности, в том числе и в случае, когда оно должно производиться в асептических условиях.

Высушивание среды, когда это необходимо, вместе с содержащимися в ней микробами и/или их спорами после культивирования также не представляет трудностей. Пористая структура кремнезема защитит микроорганизмы и, поскольку кремнеземный носитель уже измельчен в мелкий порошок, мягкое измельчение продукта после культивирования не повредит микроорганизмам. Полученный таким образом продукт является превосходным порошковым средством для покрытия семян или растений.

Благодаря своим свойствам, кремнеземная структура является одновременно эффективным защищающим и несущим материалом для микроорганизмов. Кроме того, она предотвращает продукт от слеживания.

Ниже изобретение поясняется более подробно на неограничивающих примерах.

Пример 1. Изготовление кремнеземной структуры из флогопита.

а) Исходные материалы:
700 г флогопита с размером частиц 0,01 1500 мкм,
2,5 л воды,
2065,36 г 96%-ной H₂SO₄,
331,33 г H₂O₂.

Из частиц флогопита, воды и серной кислоты приготавливают суспензию, которую нагревают до 95^oC, после чего на ее поверхность подают H₂O₂ в течение приблизительно 5 ч при постоянном перемешивании. Общее время выщелачивания составляет 7 ч, из которых примерно один час (до подачи перекиси водорода) состоит только из смешивания и нагревания. Затем маточную жидкость фильтруют и фильтрат (кремнеземную структуру) промывают несколько раз, ресуспендируя его между промывками, для очистки от кислот и катионных остатков.

б) Исходные материалы:
700 г флогопита с размером частиц 0,01 1500 мкм,
2,5 л воды,
750 г 100%-ной азотной кислоты.

Выщелачивание осуществляют как выше, за исключением того, что окислитель здесь не нужен, поскольку азотная кислота сама обеспечивает окислительный эффект.

Пример 2.

По примеру 1, но вместо флогопита используют анортизит.

Пример 3.

Исходные материалы:
600 г серпентинита,
3 л ионообменной воды,
1770,31 г 96%-ной H₂SO₄,
161,82 г HNO₃.

Температура выщелачивания составляет 95 97^oC, а длительность 7 ч. Температуру повышают до 95^oC, после чего на поверхность суспензии медленно подают азотную кислоту в течение 5 ч. После окончания подачи смесь перемешивают в течение 2 ч перед фильтрованием. Маточную жидкость фильтруют, фильтрат ресуспендируют в 1%-ном растворе серной кислоты и оставляют на 1-3 дня. Фильтрат ресуспендируют и промывают пятикратно ионообменной водой. pH конечного фильтрата составляет 4,1.

Пример 4.

По предшествующему примеру, но используют вермикулит или волланстонит.

Пример 5. Культивирование фунгицидного грибка в плотной кремнеземной среде 1 г тонко измельченного хитина смешивают с 9 г солевого раствора, имеющего следующий состав: 1 г/л KH₂PO₄ и 0,2 г/л MgSO₄•7H₂O.

Смесь стерилизуют 20 мин при 120^oC, охлаждают и засевают 1 мл суспензии спор фунгицидного грибка Trichoderma sp. полученный путем соскабливания спор с PDA-чашек в стерильную дистиллированную воду.

Хитиновую тестообразную массу, засеянную Trichoderma sp. смешивают с 6 г мелко измельченной силикатной структуры, приготовленной, как описано в примере 1, из флогопита. Таким образом получают гранулированную культуральную среду. Эту среду культивируют при комнатной температуре (20^oC) в течение 7 дней, после этого среда по всей поверхности покрывается мицелием и спорами.

Среду, распределенную тонким слоем в чашках Петри, сушат в течение одного дня при комнатной температуре. Высушенный продукт истирают в ступке в порошок. Концентрация спор в продукте составляет 2,4•10⁹ спор на грамм.

Концентрация спор в препарате Gliocladium sp. приготовленном аналогичным образом, составляет 4,8•10⁸ спор на грамм.

Пример 6.

Фунгицидный актиномицет Streptomyces griseoviridis выращивают в плотной культуральной среде следующего состава, г:
Двуокись кремния 10,0
Конденсированное крахмальное сусло 3,6
Доломитовая известь 2,0
Вода 13,4
(Использованное крахмальное сусло является продуктом фирмы Oy Alko Ab, Rajamaki с содержанием сухих веществ около 36%).

Среду автоклавируют и инокулируют 1 мл суспензии актиномицетных спор. Культуру выращивают при 28^oC в течение 7 дней. Полностью выращенную среду сушат при комнатной температуре. Концентрация спор в продукте составляет 3•10⁹ спор на грамм.

Пример 7.

На той же среде, что и актиномицет, культивируют Phlemia gigantea - грибок, предназначенный для борьбы с Fomes annosum. Через 11 дней культивирования среду сушат при комнатной температуре. Концентрация спор в продукте составляет 2,5•10⁷ спор на грамм.

Пример 8.

Культивирование инсектицидного грибка в плотной силикатной среде.

1 г мелко измельченного хитина смешивают с 9 г солевого раствора, содержащего 1 г/л KH₂PO₄•3H₂O и 0,2 г/л MgSO₄•7H₂O.

Смесь стерилизуют в течение 20 мин при 120^oC, охлаждают и засевают 1 мл суспензии спор инсектицидного грибка Beuveria bassiana, полученной соскабливанием спор с PDA-чашек в стерильную дистиллированную воду.

Смешивание с силикатным носителем, культивирование и сушку осуществляют, как в случае с триходермой по примеру 5. Концентрация спор в продукте составляет 3,4•10⁸ спор на грамм.

Концентрация спор в препарате инсектицидного грибка Metarrhizium anisopliae, выращенного аналогичным образом, составляет 1,5•10⁸спор на грамм.

Пример 9.

Приготовление фунгицидного актиномицетного препарата на основе кремнезема.

Актиномицет вида Streptomyces griseoviridis выращивают в культуральной среде с 10 г/л сывороточного белка, выросший мицелий отделяют центрифугированием. 5,1 г отделенного и высушенного клеточного материала смешивают с 9,0 г сахарозы и 15,0 г тонкоизмельченного кремнезема, приготовленного по примеру 1. Смесь лиофилизируют и измельчают. Жизнеспособность микроорганизмов в высушенном продукте составляет 5,9•10⁷ колоний на грамм продукта. После 6 недель хранения при 28^oC жизнеспособность составила 1,4•10⁷ колоний на грамм продукта.

Пример 10.

Приготовление фунгицидного препарата Bacillus на основе кремнезема. Bacillus pumilus культивируют в среде, имеющей следующий состав, г/л:
Глюкоза 4
Дрожжевой экстракт 4
Солодовый экстракт 1
Выросшую культуру отделяют центрифугированием и 1,3 г отделенного и высушенного клеточного материала смешивают с 2,2 г сахарозы и 3,6 г тонкоизмельченного кремнезема, приготовленного по примеру 1. После лиофилизации и измельчения жизнеспособность микроорганизмов в высушенном продукте составляет 6•10⁹ колоний на грамм продукта, а после 10 недель хранения при 28^oC жизнеспособность составила 2,6•10⁸ колоний на грамм продукта.

Пример 11.

Приготовление фунгицидного дрожжевого препарата на основе кремнезема.

Дрожжи Cryptococcus macerans культивируют на картофельно-декстрозной среде. Выросшую культуру отделяют центрифугированием. 11,8 г отделенной клеточной массы смешивают с 4,0 г сахарозы и 11,7 г тонкоизмельченного кремнезема, приготовленного по примеру 1. После лиофилизации и измельчения жизнеспособность микроорганизмов в высушенном продукте составляет 9•10⁴ колоний на грамм продукта.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ ферментации на плотных культуральных средах предусматривает обработку материала на основе силиката, представляющего собой гидрофильный, по существу, свободный от катионов и пористый кремнезем, полученный путем вымывания катионов из силикатного материала кислотой, источником питательных веществ и посевным материалом. В качестве последнего могут служить грибки, бактерии, растительные клетки и клетки животных. 4 з. п. ф-лы.

1. Способ ферментации на плотных культуральных средах, предусматривающий обработку материала на основе силиката источником питательных веществ, добавление одного или более видов микробов и поддержание полученной таким образом смеси в условиях, оптимальных для развития микробов, отличающийся тем, что в качестве материала на основе силиката используют гидрофильный, по существу свободный от катионов и пористый кремнезем. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофильный, по существу свободный от катионов и пористый кремнезем приготавливают посредством обработки флогопита, биотита, вермикулита, бентонита или каолинита кислотой, возможно в присутствии окислительной или восстановительной добавки. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гидрофильный, по существу свободный от катионов и пористый кремнезем находится в форме геля. 4. Способ по любому из пп.1 3, отличающийся тем, что источник питательных веществ адсорбируют на гидрофильном, по существу свободном от катионов и пористом кремнеземе. 5. Способ по любому из пп.1 4, отличающийся тем, что микробами являются грибы или бактерии.