СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ КЛЕТОК MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к иммунологии и иммунохимии, касается способа получения диагностикума из антигенов микробактерий и может быть использовано в медицине для определения антител к антигенам микробактерий и сыворотке крови человека.

Известен способ получения диагностикума с фосфатидным антигеном микробактерий (3), очищенного белкового препарата-РРД (1, 2), однако при их использовании только в 50% случаев выявляются антитела в сыворотках больных.

Известен способ получения антигена-60 из цитоплазмы M. bovis BCG (5, 6) при разрушении на гидравлическом прессе, хроматография на сефарозе 6B, сефарозе 4B, конъюгированной с конканавалином А, сефарозе G-100. Из 75 сывороток 70 дали положительный результат с антигеном 60.

К недостаткам способа следует отнести: 1) многоэтапность способа; 2) использованы несколько носителей (3) при экстракции антигенов; 3) в качестве исходного для получения антигенов использовался штамм M. bovis BCG-вакцинный, а к нему у здоровых вакцинированных лиц могут выявляться антитела; 4) для получения антигена-60 использовались антигены только из цитоплазмы микробактерий, исключены антигены из клеточной стенки.

В качестве прототипа взят способ получения белковых фракций (антигенов) методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (4), когда ацетовысушенные клетки подвергают экстракции, центрифугированию, электрофорезу в ПААГ, а далее вырезают из геля зоны определенной электрофоретической подвижности, элюируют антигены (l и ll белковые фракции) 0,85% NaCl, центрифугируют 6 000 об-20 мин, лиофилизируют.

Недостатками способа являются: 1) получение минимальных количеств антигенов (1 опыт около 100 мкг белка); 2) чувствительность 70-80%
Целью изобретения является повышение чувствительности, специфичности и увеличения выхода антигенного препарата для серодиагностики туберкулеза.

Поставленная цель достигается обработкой бактериальной массы M. tuberculosis охлажденным ацетоном (-4^oC), кислым ацетатным буфером, механической экстракцией, центрифугированием 12 000 об 30 мин, гель-хроматографией, концентрацией на мембране Amicon, диализом.

Сущность способа состоит в том, что производят гель-хроматографию центрифугата M. tuberculosis на сефакрил S 200, полученный продукт концентрируют на мембране Amicon, диализуют.

Отличительными признаками способа по изобретению являются: 1) получен более чувствительный и специфичный диагностический препарат, чем существующие; 2) в качестве исходного использован штамм M. tuberculosis, возбудитель туберкулеза человеческого типа; 3) простота получения препарата; 4) в качестве носителя для разделения антигенов сефакрил полимер, обладающий большой ригидностью и меньшей неспецифической сорбцией.

Способ осуществляется следующим образом.

Механическая экстракция ацетонвысушенных клеток M. tuberculosis 10 мМ трис-HCl буфером, содержащем дезоксихолат натрия и NaCl 15 мин, центрифугирование 30 мин 20 000 об/мин, гель-хроматография на сефакрил S - 200, концентрация на мембране Amicon, диализ против трис-HCl в течение 3-х суток, лиофилизация. Полученный антиген представляет собой белково-полисахаридный комплекс, включающий антигены с мол. мас. 30-35 КД.

Полученный нами диагностикум "антиген-3" в сравнении с другими антигенами: l и ll белковыми фракциями, РРД изучен в иммуноферментном анализе (ИФА). Исследованы 50 сывороток больных различными формами туберкулеза: фиброзно-кавернозной, инфильтративной, диссеминированной, очаговой, цирротической, туберкуломы, туберкулез внутригрудных лимфоузлов и 15 сывороток здоровых доноров в разведениях от 1:50 до 1:6400. Первый этап работы подбор планшет для нанесения антигенов. С этой целью нанесения антигенов. С этой целью использованы планшеты Titertek и планшеты NuNG. Как показали полученные данные наилучшая сорбция и чувствительность антигенов отмечена при использовании планшетов NuNG.

Проведение ИФА.

1) Антигены, разделенные в карбонатном буфере в количестве 3 мкг/мл наносили на планшет. Сенсибилизацию проводили 18 ч.

2) Планшеты промывали буфером PBS твин и для забивки свободных мест связывания вносили бычий сывороточный альбумин (БСА), выдерживали 1 ч в термостате.

3) Планшеты промывали буфером PBS-твин и в лунки вносили сыворотки больных в разведениях 1:50 1:6400, инкубировали в термостате 1 ч.

4) Планшеты промывали буфером PBS-твин и во все лунки вносили конъюгат пероксидазы против иммуноглобулинов A, M, G классов, инкубировали в термостате 1 ч.

5) Планшеты промывали буфером PBS-твин, вносили хромогенный субстрат - ортофенилендиамин, реакцию останавливали 4N H₂SO₄. Учет реакции осуществляли с помощью спектрофотометра Titertek Multiskan. Результаты обрабатывали статистически, для каждого антигена по всем группам больных выводили среднюю.

Полученные результаты представлены в табл. 1.

Пример. Больной Варламов Л. А. 52 года; Диагноз: фиброзно-кавернозный туберкулез легких, ВК+(противотуберкулезная больница Захарьина г. Химки). Сыворотка больного на наличие противотуберкулезных антител исследована на 4 месяца лечения в стационаре (табл. 2).

В табл. 2 представлены данные по оптической плотности сыворотки больного Варламова Л. А. и пула сывороток доноров с различными антигенными препаратами: антиген-3, I фракция, II фракция, PPD_C15. Сыворотки исследованы в титрах 1:100 до 1:1600. Показатели оптической плотности с анетигеном-3 (в сравнении с пулом доноров) превышали значения, полученные с другими антигенными препаратами, в разведении 1:200 в 2 раза, а в разведении 1:400 и других в 2 раза.

Изучение митогенной активности антигенов микробактерий в РБТЛ.

Изучена митогенная активность антигенных препаратов: антиген-3, белковые фракции I и II, которые получены из туберкулезных микробактерий в коммерческих препаратов PPD_C489 и PPD_C5. Митогенная активность изучена в реакции бластной трансформации, где в качестве культуры клеток использованы гепаринизированная кровь людей и спленоциты мышей линии СВА. Результаты оценивали радиометрическим методом по включению в ДНК делящихся клеток 3H-тимидина.

В качестве контроля пролиферативной активности используемых лимфоидных клеток были взяты неспецифические стимуляторы бластогенеза конакнавалин А (Con A), фитогемагглютинин (ФГА), декстран сульфат (DS), липополисахарид E. coli (ZPS).

Наиболее информативные данные получены при воздействии антигенов на лимфоидные клетки крови человека (табл. 3).

При использовании антигена-3 (III фракция) в дозах 20-50 мкг/мл наблюдалось умеренное повышение пролиферации, а в концентрации 30 мкг антиген-3 не оказывал митогенного воздействия на клетки крови человека.

При использовании I и II белковых фракций показатели реакции бласттрансформации были значительно выше значений, полученных на антиген-3. Воздействие различных серий туберкулина (C489 и C5) на лимфоидные клетки крови человека приводило к более выраженному митогенному эффекту. При увеличении дозы (для всех антигенов) с 50-100 мкг/мл отмечалось угнетение бластообразования.

Изучение туберкулиновой активности антигенов микробактерий на обезьянах, иммунизированных различными антигенными препаратами.

На обезьянах изучались протективные свойства антигенных препаратов: I фракция, II фракция, антиген-3 (III фракция) и вакцина БЦЖ, а также контрольная группа здоровые животные. Каждая группа включала по 4 животных, протективные (защитные) свойства антигена-3 изучены на 8 животных (300 мкг и 1000 мкг). Через месяц все животные были заражены вирулентной культурой микробактерий M. tuberculosis H37Rv. Внутрикожные пробы с антигенными препаратами: I, II белковые фракции, антиген-3, коммерческий терберкулин PPD (25 TE) ставили через месяц после иммунизации и через месяц после заражения (табл. 4).

Как видно из табл. 4, при иммунизации 1 и 3 белковыми фракциями, туберкулиновые реакции до заражения и после, имеют одинаковые значения, т.е. после заражения вирулентной культурой микробактерий реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) остается на том же уровне как и до заражения, значит эти антигены содержат в своем составе компоненты, которые препятствуют развитию ГЗТ. Значения туберкулиновых реакций на 3 фракцию в 1,5-2 раза превышают значения реакции на 1 и 2 фракции и PPD, т.е. антиген-3 является более чувствительным препаратом, активирующим наибольшее количество лимфокинов и медиаторов РЗТ.

У всех групп животных изучены уровни антител ко всем антигенным препаратам в иммуноферментном анализе. При исследовании уровней антител у животных: иммунизированных, иммунизированных, а затем зараженных, здоровых и здоровых, а затем зараженных, выявлено, что в ПФА наиболее чувствительным и специфичным препаратом является 3 белковая фракция. Наибольшие значения оптической плотности выявлены в группе животных иммунизированных, а затем зараженных, наиболее высокие значения отмечались у животных, иммунизированных 2 белковой фракцией.

Список литературы
1. Линникова М.А. Очищенный протеин дериват. Проблемы туберкулеза, 1939, N 12, с. 10.

2. Линникова М.А. Лямнда-Геллер Б.А. Получение высокоочищенной фракции очищенного сухого туберкулеза, ее химическая и биологическая характеристика. Проблемы туберкулеза, 1963, N 9, с. 67.

3. Степанова Э. А. Диагностическое значение серологических реакций при туберкулезе органов дыхания в зависимости от особенностей возбудителя. Докт. дисс. 1981 г.

4. Фадеева Н. И. Дыхно М.М. Кочемасова З.Н. и др. ЖМЭИ, 1980, N 12, с. 39-43.

5. Cocito C, Vanlinden F. med. microbiol. and immunol. 1988 г. 177, N 1, p. 15-25.

6. Raheman S.F. Wagner S. Manch H. et al Бюллетень ВОЗ, 1988, т. 66, N 2, с. 51-57.

Использование: иммунология: микробиология, медицина. Сущность изобретения: для выделения антитела из клеток M. tubersulosis обработанные ацетоном клетки подвергают механическому разрушению, экстрагируют солевым раствором, затем экстракт хроматографируют на Сефакрил S-200 и концентрируют на мембране Amicon. Выделенный антиген имеет м.м. 30-35 кД. 4 табл.

Способ получения антигена из клеток Mycobacterium tuberculosis для создания диагностикума, включающий обработку клеток ацетоном, их механическое разрушение, экстракцию солевым раствором, центрифугирование с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что экстракт хроматографируют на Сефакрил S 200, полученный элюат концентрируют ультрафильтрацией на Amicon, диализуют и выделяют антиген с мол.м. 30 35 кД.