СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/00 A61K39/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть, в частности, использовано для стимуляции образования антител при иммунизации.

Из практики медицины известен способ стимуляции образования антител, заключающийся в том, что антиген перед введением сорбируют на частицах гидроокиси алюминия, являющихся неспецифическим стимулятором образования антител (адъювантом), и эту смесь вводят при иммунизации (А.А. Воробьев, Н.Н. Васильев Конструирование адъювантных вакцин и анатоксинов. Сорбированные антигены. В кн. Адьюваты. Медицина, M. 1969., с.59).

Недостатками известного способа является то, что способ не обладает достаточным стимулирующим действием на процесс образования антител, что обусловлено нестандартностью гидроокиси алюминия по степени дисперсности частиц, их сорбционным свойствам и невозможностью получения стойкой суспензии с антигеном. Кроме этого, гидроокись алюминия не является безвредной, т.к. при ее введении в организм в местах введения возникает местная реакция в виде воспалительной гранулемы. Невысокая сорбционная способность гидроокиси алюминия ограничивает и дозу вводимого с ней антигена. Все это не позволяет получить конкретный технический результат - повышение эффективности способа.

Известен способ стимуляции образования антител, состоящий во введении антигена с мурамилдипептидом (МДП) в качестве адъюванта (Chedid L., Audibert F. , Johnson A. G. Biological activities of muramyl dipeptide, a syntetic glycopeptide analogous to bacterial immunoregulating agents// Prog. Allergy. - 1978. - vol.25. - p.63.).

Недостатком известного способа является выраженная пирогенность МДП и его способность вызывать тромбоцитолиз, лейкопению, а также увеиты и артриты. Это ограничивает возможности использования МДП в качестве адъюванта, т.е. известный способ не позволяет получить конкретный технический результат - повышение эффективности способа.

Наиболее близким к заявляемому является способ стимуляции образования антител, основанный на введении антигена в составе эмульсии минерального масла (адъювант Фрейнда). (Freund J., Stern E., Pisani Т, Isoallergik encephalomyelitis and radiculitis in guinea pigs after one injection of brain and mycobacteria and water-in-oil emulsion. J. Immunol., 1947, 57, 179).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к иммунологии и связаны со стимуляцией образования антител при иммунизации животных смесью антигена и адъюванта.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- недостаточная эффективность способа, обусловленная невысокой сорбционной емкостью эмульсии и нестандартностью эмульсионной смеси антигена и адъюванта;
- адъювант Фрейнда при подкожном и внутримышечном введении вызывает патологические изменения местного и общего характера;
- смесью антигена с адъювантом Фрейнда невозможно проводить внитривенные иммунизации из-за опасности эмболии.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение эффективности стимуляции образования антител при иммунизации. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата.

Решение поставленной задачи заключается в том, что при приготовлении смеси антигена и адъюванта предлагается совокупность признаков, отличающихся от прототипа тем, что при иммунизации животных в качестве адъюванта используют эмульсию перфторорганических соединений "Перфторан".

Предлагаемым способом достигается повышение эффективности способа, т.е. использование эмульсии "Перфторан" в качестве адъюванта более эффективно стимулирует образование антител, чем адъювант Фрейнда, на 20-46%.

Проблема стимуляции иммунного ответа, и в частности образования антител, остается одной из наиболее актуальных в современной иммунологии. Для усиления реакции образования антител иммунизацию проводят смесью антигена с веществами, усиливающими иммунный ответ (адъювантами). В качестве адъювантов используют вещества, способные образовывать в водных растворах эмульсии, поверхность частиц которых сорбирует молекулы антигена, а также другие неспецифические стимуляторы образования антител. При получении диагностических и лечебных гипериммунных сывороток, особенно к низкомолекулярным антигенам, используют адъюванты на этапе первичной иммунизации. Важное значение имеет проблема иммуностимуляции и при вакцинации людей и животных. Вакцинация должна быть максимально эффективной и не вызывать побочных отрицательных эффектов. Адъюванты при иммунизации выполняют роль переносчиков и депо антигена и тем самым способствуют иммуностимуляции. Идеальным адъювантом является препарат химически инертный и не токсичный, с большой сорбционной емкостью, способный образовывать стойкую эмульсию с размерами частиц, которые могут поглощаться фагоцитами. Такой препарат не вызывает патологических изменений при многократном введении. Наиболее полно отвечает этим требованиям препарат искусственной крови на основе перфторорганических соединений "Перфторан". "Перфторан" представляет собой физиологический раствор, в котором находятся во взвешенном состоянии частицы перфторорганических соединений размерами 0.03-0.15 мкм. Эмульсия стабильна, не токсична, химически инертна. При однократном и многократном введении внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно и внутримышечно не вызывает патологических изменений. Высокая неспецифическая сорбционная емкость перфторорганических частиц в составе эмульсии позволяет сорбировать на них антигены различной природы - белки и липиды. Малый размер префторуглеродных частиц в составе эмульсии обуславливает высокую емкость антигена в малом объеме препарата, а также способность фагоцитирующих клеток сразу захватывать частицы эмульсии с антигеном и запускать иммунный ответ. Отсутствие патологических изменений общего и местного характера при введении "Перфторана" позволяет проводить реиммунизации с адъювантом, что дополнительно стимулирует образование антител.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Антиген в объеме 0,1 мл смешивают с 0,2 мл эмульсии "Перфторан" (производства ОАО НПФ "ПЕРФТОРАН'" Российской Академии наук) и используют для иммунизации мышей линии СВА подкожно или внутрибрюшинно в объеме 0,3 мл. На 7 и 14 сутки после иммунизации у мышей берут кровь, в которой определяют содержание специфических антител к используемому антигену в реакции непрямой гемогглютинации и иммуноферментным методом.

Определение содержания специфических антител к М.lufu классов IgG и IgM проводили с помощью иммуноферментной тест-системы, разработанной в НИИ по изучению лепры. В качестве антигена для тест-системы использовали обработанные ультразвуком M.lufu (УЗ-дезинтеграция на приборе MSE-100 при 18 кГц, 10 мин дробно). Суспензию центрифугировали 20 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость с содержанием белка 1.5-2.0 мг/мл использовали в качестве антигена. ИФА проводили следующим образом. Полистироловые планшеты фирмы Costar сенсибилизировали антигеном M.lufu (5 мкг/мл) в течение ночи при 4^oС. Сыворотку мышей раститровывали с 1:40 до 1:2560, и каждое разведение вносили в лунки планшета. Одновременно в качестве контроля вносили раститрованный сывороточный пул интактных мышей. В качестве коньюгата использовали коммерческие диагностические антитела к IgG и IgM мыши, меченные пероксидазой производства ОАО НИАРМЕДИК. Субстратом служила 0,033% перикись водорода в цитратно-фосфатном буфере (рН - 5.2) с ортофенилендиамином в качестве хромогена. Реакцию останавливали 2N H₂SO₄. Фотометрическую оценку результатов проводили на ридере УНИПЛАН при 490 нм в единицах оптической плотности (ОП). За положительное принимали то разведение сыворотки опытных мышей, показатель ОП которых в 2 и более раз превосходил показатель ОП соответствующего разведения сыворотки интактных мышей.

Определение общего содержания специфических антител к фракции-1 чумного микроба проводили методом титрования в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в соответствии с действующими "Инструктивно-методическими материалами по применению серологических методов диагностики при эпизоологическом обследовании природных очагов чумы" (Москва, 1983, с. 1 1-15). Исследуемые сыворотки разводили 1:10 0.15М раствором NaCl, pH 7.4 и инактивировали 30 мин при 56^oС. В лунки планшета для иммунологических реакций вносили по 0.4 мл разводящей жидкости (Твин-80 1:5000) и готовили ряд последовательных двукратных разведений каждой сыворотки от 1:20 до 1:10240. В каждую лунку вносили по 50 мкл чумного жидкого антигенного диагностикума производства Казанского научно-исследовательского противочумного института (КазНИПЧИ). В положительных пробах, содержащих антитела к фракции 1, эритроциты выпадали в осадок в виде "зонтика". В отрицательных пробах эритроциты скатывались на дно лунки и образовывали осадок в виде "пуговки". За титр реакции принимали последнее разведение исследуемой сыворотки, вызывающее непрямую агглютинацию эритроцитов.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в лаборатории биохимии и иммунологии НПМК "Экологическая медицина", в лаборатории иммунохимии НИИ по изучению лепры, в лаборатории иммунологии Астраханской областной противочумной станции в течение 2000 г. Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Для иммунизации использовали 45 мышей линии СВА. Препарат для иммунизации - M.lufu выращивали на среде Левенштейна-Иенсена. Адъювант Фрейнда - коммерческий препарат производства фирмы Difco. Перфторан - коммерческий препарат производства ОАО НПО "ПЕРФТОРАН" номер партии 781298.

1-ая группа мышей (15 животных) была иммунизирована подкожно в область спины смесью M.lufu (бакмасса - 50 мг в 0.1 мл 0.9% раствора NaCl) и 0.2 мл адъюванта Фрейнда.

2-ая группа мышей (15 животных) была иммунизированна подкожно в область спины смесью M.lufu (бакмасса - 50 мг в 0.1 мл 0.9% раствора NaCl) и 0.2 мл Перфторана.

3-я группа мышей (15 животных) была иммунизирована подкожно в область спины M.lufu - бакмасса 50 мг в 0.2 мл 0.9% раствора NaCl (контроль).

Животных 1, 2 и 3 групп иммунизировали одновременно. На 7 и 14 дни у мышей всех групп производили забор крови из ретроорбитального синуса, отделяли сыворотку и определяли в ней содержание специфических антител к М.lufu классов IgG и IgM с помощью иммуноферментной тест-системы, разработанной в НИИ по изучению лепры. В качестве антигена для тест-системы использовали обработанные ультразвуком M.lufu (УЗ-дезинтеграция на приборе MSE-100 при 18 кГц, 10 мин дробно). Суспензию центрифугировали 20 мин при 10000 об/мин, надосадочную жидкость с содержанием белка 1.5-2.0 мг/мл использовали в качестве антигена.

Иммуноферментный анализ проводили следующим образом. Полистироловые планшеты фирмы Costar сенсибилизировали антигеном M.lufu (5 мкг/мл) в течение ночи при 4^oС. Сыворотку опытных мышей раститровывали с 1:40 до 1:2560 и каждое разведение вносили в лунки планшета. Одновременно в качестве контроля вносили раститрованный сывороточный пул интактных мышей. В качестве коньюгата использовали коммерческие диагностические антитела к IgG и IgM мыши, меченные пероксидазой (производства ОАО НИАРМЕДИК). В качестве субстрата использовали 0,033% перикись водорода в цитратно-фосфатном буфере (рН 5.2) с ортофенилендиамином в качестве хромогена. Реакцию останавливали 2N H₂SO₄. Фотометрическую оценку результатов проводили на ридере УНИПЛАН при 490 нм в единицах оптической плотности (ОП). За положительное принимали то разведение сыворотки опытных мышей, показатель ОП которого в 2 и более раз превосходил показатель ОП соответствующего разведения сыворотки интактных мышей. Результаты титрования исследуемых сывороток животных сравниваемых групп вносили в электронную таблицу и обрабатывали статистически с использованием программы EXCEL-97 for WINDOWS-95.

Изложенная сущность изобретения поясняется табл. 1.

Из приведенных в примере 1 данных видно, что у мышей, иммунизированных антигеном M.lufu в смеси с Перфтораном, в качестве адъюванта уровень антител в крови выше, чем у мышей, иммунизированных антигеном с адъювантом Фрейнда, и у мышей, иммунизированных антигеном без адъювантов. Такая зависимость прослеживается на 7 и 14 сутки после иммунизации и характерна для антител классов IgM и IgG. Степень усиления эффекта образования антител к антигенам M.lufu новым способом по сравнению с прототипом составляет 20-35%.

Пример 2.

Группу из 45 мышей линии СВА иммунизировали белковым антигеном, выделенным из чумного микроба (фракция-1). Каждой мыши внутрибрюшинно вводили смесь антигена (0,1 мл раствора, содержащего 50 мкг специфического белка) и адъюванта (0,2 мл). Адъювант Фрейнда - коммерческий препарат производства фирмы Difco. Перфторан - коммерческий препарат производства ОАО НПФ "ПЕРФТОРАН" номер партии 781298.

1-й группе мышей (15 животных) антиген вводили с адъювантом Фрейнда. Смесь антигена с адъювантом и ее эмульгирование проводили непосредственно перед иммунизацией.

2-й группе мышей (15 животных) антиген вводили с эмульсией Перфторан.

3-й группе мышей (15 животных) антиген вводили в смеси с физиологическим раствором (0,9% NaCl) вместо адъюванта (контроль).

Животных 1, 2 и 3 групп иммунизировали одновременно. На 7 и 14 дни у мышей всех групп проводили забор крови из ретроорбитального синуса, отделяли сыворотку и определяли в ней общее содержание специфических антител методом титрования в реакции пассивной гемаглютинации (РПГА) в соответствии с действующими "Инструктивно-методическими материалами по применению серологических методов диагностики при эпизоологическом обследовании природных очагов чумы" (Москва, 1983, с.11-15). Исследуемые сыворотки разводили 1:10 0.15 М раствором NaCl, pH 7.4 и инактивировали 30 мин при 56^oС. В лунки планшета для иммунологических реакций вносили по 0.4 мл разводящей жидкости (Твин-80 1: 5000) и готовили ряд последовательных двукратных разведений каждой сыворотки от 1: 20 до 1:10240. В каждую лунку вносили по 50 мкл чумного жидкого антигенного диагностикума производства КазНИПЧИ. В положительных пробах, содержащих антитела к фракции 1, эритроциты выпадали в осадок в виде "зонтика". В отрицательных пробах эритроциты скатывались на дно лунки и образовывали осадок в виде "пуговки". За титр реакции принимали последнее разведение исследуемой сыворотки, вызывающее непрямую аглютинацию эритроцитов. Результаты титрования исследуемых сывороток животных сравниваемых групп вносили в электронную таблицу и обрабатывали статистически с использованием программы EXCEL-97 for WINDOWS-95.

Изложенная сущность изобретения поясняется табл.2.

Из приведенных данных в примере 2 видно, что у мышей, иммунизированных антигеном чумного микроба (фракция-1) в смеси с Перфтораном в качестве адъюванта, уровень антител в крови выше, чем у мышей, иммунизированных антигеном с адъювантом Фрейнда, и у мышей, иммунизированных антигеном без адъювантов. Такая зависимость прослеживается на 7 и 14 сутки после иммунизации. Степень усиления эффекта образования антител к антигенам (фракции 1 чумного микроба новым способом по сравнению с прототипом составляет 44-46%.

Таким образом, предлагается никем ранее не предлагавшийся способ стимуляции образования антител при иммунизации, в котором в качестве адъюванта используют эмульсию перфторорганических соединений "Перфторан", которая позволяет получить более высокий уровень антител и добиться положительного результата в виде повышения эффективности способа.

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом поясняются табл. 3.

В табл. 3 показано, что эффективность предлагаемого способа стимуляции образования антител к различным антигенам на 20-46% выше способа-прототипа.

Таким образом, преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом состоят
- в повышении эффективности способа стимуляции образования антител на 20-46%;
в возможности проводить иммунизацию внутривенно и внутримышечно (в прототипе - только подкожно и внутрибрюшинно);
- в повышении стабильности эмульсии антиген-адъювант;
- в отсутствии патологических изменений общего и местного характера (безвредность);
- в высокой сорбционной емкости частиц эмульсии "Перфторан".

Предложенный способ может быть рекомендован для осуществления в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся получением специфических антител, диагностических и лечебных гипериммунных сывороток, а также вакцинных препаратов.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть, в частности, использовано для стимуляции образования антител при иммунизации. Предлагаемый способ решает основную задачу - повышение эффективности стимуляции образования антител при иммунизации. Поставленная задача решается в изобретении тем, что при иммунизации животных в качестве адъюванта используют эмульсию перфторорганических соединений "Перфторан". Способ обеспечивает повышение образования антител на 20-46%. 3 табл.

Способ стимуляции образования антител при иммунизации лабораторных животных антигеном в смеси с адъювантом, отличающийся тем, что при иммунизации лабораторных животных антигеном из Mycobacterium lufu или фракции-1 чумного микроба в качестве адъюванта используют эмульсию перфторорганических соединений “Перфторан”.