СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/535 A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к получению и производству препаратов, предназначенных для дифференциальной диагностики бруцеллеза.

Известно несколько способов серологической и дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Это такие, как реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция длительного связывания комплемента (РДСК), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), роз-бенгал проба (РБП) и другие.

Недостатком этих методов является отсутствие строгой специфичности этих тест-систем, поскольку во многих случаях у животных выявляются реакции, не связанные с развитием инфекционного бруцеллезного процесса. Это связано с тем, что в качестве основного иммунологического компонента в этих тест-системах применяется единый бруцеллезный антиген, вступающий в реакцию как с S-, так RS-антителами, присутствующими как у больных бруцеллезом, так и привитых противобруцеллезными вакцинами, а также у животных - носителей иерсиний - Y.enterocolitica.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является ИФА (иммуноферментный анализ), при котором для дифференциальной диагностики бруцеллеза проводят серологическую индикацию бруцелл в объектах ветеринарного надзора с использованием моноклональных антител (МКА). При этом в сенсибилизированные бруцеллезным антигеном планшеты вносят моноклональные антитела, а после выдержки при температуре 37-38°С в течение 1 часа добавляют антивидовой иммуноферментный конъюгат. О наличии антигенов в испытуемой пробе судят по степени интенсивности окраски содержимого лунок. Реакцию считают положительной при интенсивности окраски 2-4 креста в разведениях 1/16-1/32. (Плотникова Э.М., Салмаков К.М. - Разработка методов и средств иммуномониторинга бруцеллеза животных. - Ветеринария. - 2003. - №12. - С.16-18.)

Однако дифференциальная диагностика бруцеллеза с использованием ИФА-теста путем индикации возбудителя бруцеллеза (бруцеллезного антигена) сопряжена с технологическими трудностями, ибо процесс индикации возбудителя представляет весьма трудоемкую и сложную задачу, поскольку для обнаружения возбудителя необходимо проводить подготовку проб к исследованию, накопление бактериальной биомассы, обработку антигенного материала и постановку ИФА.

Недостатком этого способа является сложность и дороговизна получения МКА для ИФА, длительная и многоэтапная подготовка к исследованию, накопление бактериальной биомассы, обработка антигенсодержащего материала и т.д. При этом искомый агент может быть и не выделен, поскольку результат предварительной бактериологической индикации при малом количестве микробов в исследуемых пробах (менее 10⁴ микробных клеток на 1 г (мл) пробы) может быть отрицательным, что снижает чувствительность и эффективность серологической диагностики бруцеллеза. При этом способе не достигается главной цели - дифференциации вирулентных штаммов возбудителя от авирулентных и вакцинных вариантов бруцелл, что связано с использованием антигена R-форм бруцелл для гипериммунизации животных-доноров специфических антител.

Задачей изобретения является разработка способа, повышающего специфичность ИФА-теста и позволяющего проводить дифференциацию поствакцинальных иммунологических реакций от постинфекционных, а также дифференциацию перекрестных реакций, индуцированных микроорганизмами, имеющими антигенные родство с бруцеллами, особенно Yersinia entericolica.

Поставленная задача решается за счет использования серологического анализа сывороток крови исследуемых животных в иммуноферментном анализе (ИФА), который проводят с использованием антигенного варианта иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК), в котором в качестве специфического индикаторного компонента используют полипептидную фракцию вирулентного штамма B.abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа, отсутствующую у вакцинных (B.abortus 19,82, R-1096) и других вирулентных видов (B. suis, В. obis) бруцелл, и по феномену иммуноферментной реакции судят о наличии специфических постинфекционных антител в исследуемых сывороток, по степени интенсивности реакции (Ксп) и по титру постинфекционных антител в ИФА ставят дифференциальный диагноз на бруцеллез, за диагностический титр постинфекционных антител принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1:100 и выше с коэффициентом специфичности (Ксп)-2,1 и выше.

Сущность изобретения заключается также в том, что способ получения антигенного варианта иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК) для дифференциации постинфекционных антител от поствакцинальных включает радиоинактивацию бруцелл с последующим лизированием их, выделение специфической антигенной фракции вирулентного штамма B.abortus 54 электрофоретическим методом в полиакриламидном геле (ПААГ) в градиенте концентрации 10-20% в присутствии додецилсульфата Na (SDS), силе тока 80 мА и экспозиции 2,5-3,0 часа, фиксацию пластин геля в растворе, содержащем 40% изопропилого спирта и 10% уксусной кислоты, с последующим окрашиванием геля в 0,1% растворе кумасси бриллиантовым голубым R-250, дополнительным окрашиванием полипептидных фракций серебром с использованием раствора формальдегида, определение молекулярных масс фракционированных полипептидов с использованием калибровочного графика, составленного на основе стандартных маркеров: БСА (67кДа), ЕА (43кДа) и цитохрома С (12,3 кДа), перенос антигенных фракций с пластин ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану ("Miliipore") с буфером, содержащем 0,024 М трис, 0,076 М глицин и 20% метанола при помощи графитовых пластин (3 часа при 100 мА). Для выявления специфической фракции после фиксации нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают гипериммунными сыворотками кроликов пероксидазным конъюгатом и раствором субстрата (бензидин HCI).

Специфическую полипептидную антигенную фракцию, полученную после очистки указанными компонентами и имеющую молекулярную массу 41,8 кДа, конъюгируют (сшивают) с ферментной меткой (пероксидазой хрена) из расчета 1 мг фермента на 5 мг полипептида, используя перйодатный метод (Иммуноферментный анализ. /Под ред. Г.Г.Нго, Г.М.Ленхофф. - М. - 1988. - с.240-243).

Полученный противобруцеллезный антигенный иммуноферментный конъюгат (АГ ИФК) консервируют или подвергают лиофильной сушке. Существенным отличием способа дифференциации постинфекционных от поствакцинальных и гетерологичных (иерсиниозные) антител является то, что для этой цели используют высокоспецифическую чувствительную тест-систему (ИФА) на основе моноспецифического индикаторного компонента - меченную пероксидазой изолированную из вирулентного штамма B. abortus 54 полипептидную фракцию с мм. 41,8 кДа, отсутствующую у вакцинных (19,82, R-1096) штаммов бруцелл и гетерологичных микроорганизмов (иерсиний).

Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза и способ получения диагностического препарата осуществляется следующим образом.

Начальным этапом изготовления диагностического препарата - меченного ферментом пероксидазой хрена специфического антигена бруцелл, является выделение моноспецифической полипептидной антигенной фракции вирулентного штамма бруцелл, отсутствующей у авирулентных и вакцинных штаммов бруцелл, которая служит основным иммунологическим индикаторным компонентом антигенного диагностикума - противобруцеллезного иммуноферментного конъюгат (ИФК).

Моноспецифическую полипептидную антигенную фракцию бруцелл получают путем электрофоретического разделения лизатов бруцелл, предварительно инактивированных гамма-лучами ⁶⁰Со в дозе 3,0-3,5×10⁴ Гр.

Для этой цели берут вирулентные штаммы видов B.abortus (54,544), B.suis (1330, S-40, 0302, 0303), B.canis (RM 6/66), В. melitensis (16M), В. obis (101, 31) и вакцинные штаммы бруцелл (19, УФ-1,82, R-1096), выращивают их на печеночно-пептонной среде в течение 24 ч, полученную бакмассу отделяют центрифугированием и разводят физиологическим раствором до концентрации 1·10⁹ м.к./см³ и подвергают лучевой инактивации (радиоинактивации) на гамма-установке с источником излучения ⁶⁰Со в дозе 3,0,-3,5×10⁴ Гр.

Радиоинактивированные бруцеллы лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCl-буфере, рН 6,8, и содержащем 2-5% додецилсульфата натрия (SDS) и 5% β-меркаптоэтанола. Бактериальные клетки в лизирующем растворе прогревают на кипящей водяной бане в течение 1 мин, затем к пробам приливают глицерин с бромфеноловым синим до конечной концентрации 10% и 0,001% соответственно. Для проведения диск-электрофореза пробы в лунки концентрирующего геля наносят в количестве 50-100 мкг по белку. Режим электрофореза до вхождения красителя в разделяющийся гель составляет 40 мА на 2 пластины геля. Дальнейший электрофорез проводят при силе тока 80 мА на 2 пластины геля в течение 3-3,5 часов. Пластины геля по окончании электрофореза фиксируют в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты, в течение 1 часа или оставляют на ночь. Гели окрашивают в 0,1%-ном растворе "кумасси". Окраску фракционированных в ПААГ полипептидов серебром проводят согласно методу Э.И.Гребиножко и др. /Простой метод обнаружения белков в полиакриламидном геле с помощью импрегнации их серебром. - Украинск. биохим. журнал. - 1986 - Т.58, №5. - С.62-65/ с использованием раствора формальдегида. Денситотометрирование пластин гелей производят на сканере Sharp 330 Yx в проходящем свете. Определение молекулярных масс и расчет процентного содержания белковых (антигенных) фракций осуществляют по программе Imayemachn 1 D prime.

При анализе электрофореграмм после разгонки лизатов исследуемых штаммов бруцелл в градиенте 15-20% ПААГ у вирулентного штамма 54 обнаруживают более широкий набор полипептидов (до 59 фракций) по сравнению со всеми другими штаммами и видами бруцелл, у которых количество их колеблется в пределах от 29 до 49 фракций с молекулярной массой (м.м.) от 20 до 60 кДа. При сопоставительном анализе электрофореграмм всех испытанных видов и штаммов у B. abortus 54 закономерно обнаруживают полипептидную фракцию с молекулярной массой 41,8 кДа, отсутствующую у других видов и штаммов бруцелл, что имеет принципиальнее значение для использования этого компонента для конструирования специфического диагностикума.

С целью определения специфичности и серологической активности проводят иммуноблотинг путем переноса антигенных фракций с пластин ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану ("Millipore") согласно методу H.Touibm et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - V.76. - P.4350-4354) в буфере, содержащем 0,024 М трис, 0,076М глицин и 20% ментола, при помощи графитовых пластин (3 часа при 100 мА).

Для выявления серологической активности и иммунологической компетентности фракций бруцелл после фиксации нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают соответствующими гипериммунными кроличьими S-, SR-, R- сыворотками к антигенам использованных в опытах штаммов и видов бруцелл.

Антигенную фракцию, проявляющую наиболее высокую серологическую активность и специфичность, т.е. вступающую в иммунологическую реакцию только с антисыворотками к вирулентным штаммам вида B. abortus bovis, изолируют и используют в дальнейшем для изготовления антигенного противобруцеллезного иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК).

Для приготовления АГ ИФК антигенную фракцию из шт.54, изолированную вышеописанным способом, подвергают конъюгированию (сшивке) с ферментом периодатным методом. В качестве метки используют пероксидазу хрена, а мечение антигена осуществляют следующим образом.

Предварительно пероксидазу хрена растворяют в дистиллированной воде до конечной концентрации 5 мг/мл. Концентрацию фермента в растворе и степень чистоты фермента контролируют спектрофотометрически, определяя показатель чистоты (Rz) и концентрацию фермента в растворе по формуле:

С_ПХ мг/мл: Р.=Д₄₃₀/Д₂₈₀

С_ПХ мг/мл=Д₄₀₃×0,44 разв. образца,

где Д₄₀₃, Д₂₈₀ - оптическая плотность раствора, измеренная на спектрофотометре при длине волн 403 нм и 280 нм соответственно;

0,44 - коэффициент пересчета.

К раствору фермента добавляют 0,1 н. водный раствор натрия метапериодата (21,4-1 мл д.в.) из расчета по 0,2 мл на каждые 5 мг пероксидазы.

Смесь выдерживают при 18-24°С 20 мин, встряхивая, и далее диализуют против ацетатного буфера рН 4,4 в течение суток с трехкратной сменой буферного раствора при соотношении, равном 1:500.

По окончании диализа раствор фермента декантируют из диализного мешочка, проверяя рН, которая должна быть в пределах 4-4,5, и хранят при 0-4°С при соотношении объема раствора фермента буферного раствора, равном 1:500.

К полученному раствору модифицированный пероксидазы добавляют 0,2М карбонат-бикарбонатный буфер рН 9,5-10,0 (к 1 мл раствора фермента добавляют 0,1-0,15 мл буфера) до установления рН в растворе фермента 9,5-9,7, после чего немедленно добавляют к нему прогретые при 56°С в течение 30 мин фракции в объеме не более 1 мл, содержащем количество белка, в 4 раза превышающее количество пероксидазы (то есть на каждые 5 мг пероксидазы брали 20 мг фракции). Объем антигенной фракции доводят до 1 мл 0,01М карбонат-бикарбонатным буфером рН 9,5. Концентрацию белка определяют по формуле:

К=Д₂₈₀ × а (разведение образца)/1,3,

где 1,3 - постоянный коэффициент расчета. Смесь выдерживают после проверки рН (которая должна быть в пределах 9,5-10,0) при 18-24°С, при постоянном встряхивании в течение 2 часов, после чего ее диализуют против 500-кратного объема 0,01 М фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,2-7,4 при 4°С в течение суток с 2-3-кратной сменой буфера.

Меченную ферментом антигенную фракцию - иммуноферментный конъюгат - консервируют добавлением мертиолята до конечной концентрации 1:100000 в растворе препарата и хранят в нативном виде в условиях холодильника.

Полученный вышеописанным способом антигенный вариант противобруцеллезного иммуноферментного конъюгата проверяют на активность и специфичность с использованием прямого метода иммуноферментного анализа (ИФА). При этом в качестве положительного контроля используют сыворотки заведомо больных бруцеллезом животных, а в качестве отрицательного контроля - сыворотки интактного и привитого против указанной болезни животных, а в качестве гетерологичного контроля - сыворотки носителей бруцелл B. suis, B. canis, В. obis. Положительная реакция с сывороткой больных бруцеллезом животных с максимальным титром в разведении 1:100 и отрицательная реакция с сыворотками привитых противобруцеллезными вакцинами и контаминированных гетерологичными антителами животных свидетельствует о специфичности и активности полученных иммуноферментных конъюгатов.

Постановку дифференциального диагноза на бруцеллез крупного рогатого скота (КРС) осуществляют следующим образом. У обследуемых животных берут кровь из яремной вены в объеме 10 см³ и получают сыворотку общепринятым методом.

Полученную сыворотку используют в качестве антител в прямом варианте ИФА, постановку и оценку результатов которого проводят в соответствии с методическими рекомендациями Х.Фремеля и Г.Хольцхайдта ("Иммунологические методы", М., 1987, с.162-170).

В качестве специфического антигена в прямом варианте ИФА используют полученный по вышеописанному способу антигенный вариант иммуноферментного конъюгата (АГ ИФК).

Реакцию сопровождают следующими контролями:

- сыворотка интактных (здоровых, непривитых животных);

- сыворотка привитых шт.19 животных;

- сыворотка привитых шт.R-1096 животных;

- сыворотка носителей Y. enterocolitica;

- сыворотка контаминированных шт.B. suis;

- сыворотка контаминированных шт.B. bovis;

- сыворотка контаминированных шт.B. melitensis.

За положительную реакцию ИФА принимают разведение 1:100 с коэффициентом специфичности (Ксп) - 2,1 и выше при отрицательной реакции с гетерологичными и общегрупповыми сыворотками (от привитых бруцеллезными вакцинами и другими видами бруцелл).

Положительная реакция ИФА с использованными сыворотками в разведениях 1:100 и выше (коэффициент специфичности Ксп - 2,1 и выше) свидетельствует о наличии в организме обследуемых животных вирулентного штамма бруцелл вида B. abortus.

Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза апробирован на лабораторных (морских свинках и кроликах) и комиссионно на сельскохозяйственных (крупном рогатом скоте) животных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах.

Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза и способ получения препарата для ее осуществления иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение специфической антигенной фракции B. abortus.

Бруцеллезный антиген получали общепринятыми методами путем термоэкстрагирования бруцелл, ультразвукового разрушения, гамма-облучения, этанолового и фенолового экстрагирования, лизирования клеток с последующим гель-электрофорезом в полиакримидном геле (ПААГ). Спектрометрический анализ полученных антигенов показал, что они содержат не более 2-3 основных фракций антигенов, которые вступали в серологические реакции как с S-, SR-, так и с R- сыворотками, полученными как от носителей видов бруцелл В. abortus, В. suis, В bovis, В canis, В melitensis, так и от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами животных. Использование для этой цели методов радиоинактивации, разрушения клеток в лизирующем растворе с последующим гель-электрофорезом в ПААГ обеспечивает выделение строго специфичного компонента B. abortus 54, который вступал в реакцию ИФА только с антисыворотками контаминированных вирулентными штаммами вида B. bovis.

Пример 2. Получение антигенного иммуноферментного конъюгата.

Иммуноферментный конъюгат получали путем сшивки антигенной фракции бруцелл шт.54 с иммуноферментной меткой-ферментом пероксидазой хрена в соотношении антигена (белка) и метки 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 при режимах конъюгирования 5, 10, 15, 20, 25 мин.

При этом установлено, что оптимально время конъюгирования составило 20 минут, а соотношение антигена и метки - 1:20.

Изменение режимов конъюгирования (соотношения компонентов, времени конъюгирования, сшивки, метки и другие параметры) не обеспечивало получения конъюгатов с достаточной серологической активностью, ибо титр антигенов при этом не превышал 1:30.

Пример 3. Эффективность способа дифференциации постинфекционных антител от поствакцинальных испытывали на морских свинках. С этой целью 40 морских свинок подвергали заражению вирулентными штаммами возбудителя бруцеллеза B. abortus 54 (1-я), 99 (2-я), 544-(3-я) группа (по 5 животных на каждый штамм), иммунизированными вакцинными штаммами 19 (4-я), 82 (5-я) и R-1096 (6-я) (по 5 морских свинок на каждый вариант вакцины), а также заражали возбудителем иерсиниоза (Y. enterocolitica) (7-я группа); 8-ю группу животных не иммунизировали и не заражали (биологический контроль). У всех животных в динамике (через 3, 7, 14, 21 и 28 сутки после введения антигенов бруцелл) брали пробы крови для серологического исследования в ИФА. Установлено, что во все сроки исследования у контрольных и иммунизированных животных (4-я, 5-я, 6-я, 7-я и контрольная группы) антитела не были выявлены. В отличие от иммунизированных у зараженных вирулентными штаммами возбудителя бруцеллеза (1-я, 2-я, 3-я группы) были обнаружены противобруцеллезные антитела в титрах от 1:4-1:8, 1:16-1:32, 1:64-1:128 на 7, 14, 21 и 28 сутки после заражения соответственно. При параллельном исследовании испытуемых сывороток в PA, PCK и РИГА у всех иммунизированных и зараженных вирулентными штаммами бруцелл были выявлены антитела в титрах 1:10-1:50 на 14, 21 и 28 сутки после заражения и иммунизации. При этом ни по титру, ни по срокам появления антител дифференцировать их по классу, т.е. поствакцинальные или постинфекциональные, не представлялось возможным.

Пример 4. Эффективность предлагаемого способа дифференциальной диагностики бруцеллеза и возможность дифференциации больных бруцеллезом животных от вакцинированных проверяли на крупном рогатом скоте в благополучных, привитых штаммами 19 и 82, а также в не благополучных по бруцеллезу КРС хозяйствах Тульской области и Республики Татарстан. Установлено, что результаты регламентированных при бруцеллезе тест-систем (РА, PCK, РБП) с использованием известного диагностикума (единого бруцеллезного антигена) не позволяли дифференцировать больных бруцеллезом животных от вакцинированных, поскольку сыворотки как вакцинированных, так и спонтанно зараженных животных реагировали положительно с известным антигеном. В отличие от общепринятых тест-систем предлагаемая тест-система (ИФА) с использованием предлагаемого диагностикума (иммуноферментный конъюгат на основе полипептидной фракции бруцелл из шт.54) позволяла идентифицировать сыворотки больных бруцеллезом от привитых против этой болезни животных.

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для дифференциальной диагностики бруцеллеза, и к способу дифференциальной диагностики бруцеллеза. Способ заключается в серологическом анализе сывороток в ИФА с использованием антигенного ИФК, представляющего собой меченую пероксидазой хрена электрофоретически очищенную полипептидную фракцию вирулентного штамма B.abortus 54. Диагноз на бруцеллез ставят при обнаружении в сыворотках больных животных противобруцеллезных антител в разведениях 1/100 и выше при степени интенсивности реакции Ксп 2,1 и выше. Технический результат: разработка способа, повышающего специфичность ИФА теста и позволяющего проводить дифференциацию поствакцинальных иммунологических реакций от постинфекционных, а также дифференциацию перекрестных реакций, индуцированных микроорганизмами, имеющими антигенные родство с бруцеллами, особенно Yersinia entericolitica, 2 н.п. ф-лы.

1. Способ дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что проводят серологический анализ сывороток крови животных в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием антигенного противобруцеллезного иммуноферментного конъюгата, представляющего собой меченную пероксидазой хрена электрофоретически очищенную в полиакриламидном геле полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа, и дифференцируют больных бруцеллезом животных от вакцинированных при обнаружении в сыворотках у больных животных противобруцеллезных антител в разведениях 1/100 и выше при степени интенсивности реакции Ксп.2,1 и выше и при отсутствии противобруцеллезных антител в сыворотках у вакцинированных.2. Способ получения противобруцеллезного антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК) для дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что вирулентный штамм бруцелл вида В. abortus 54 инактивируют гамма-лучами ⁶⁰Со в дозе 3,0-3,5×10⁴ Гр, лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCL-буфере, рН 6,8, содержащем 2-5% додецилсульфата натрия и 5% β-меркаптоэтанола, наносят пробы в лунки концентрирующего геля в количестве 50-100 мкг по белку, проводят электрофорез при силе тока 40 мА на две пластины геля до вхождения красителя в гель и затем при силе тока 80 мА на две пластины 3-3,5 ч, фиксируют пластины в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 1 ч, окрашивают в 0,1%-ном растворе "кумасси" бриллиантовым голубым R-250, затем фракции полипептидов окрашивают серебром с использованием раствора формальдегида, денситометрируют пластины геля на сканере SHARP-330Y х в проходящем свете, определяют молекулярную массу и иммунологическую компетентность фракций методом иммуноблотинга, полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма бруцелл В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа конъюгируют с ферментной меткой - пероксидазой хрена из расчета 1 мг белка на 20 мг пероксидазы при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 20 мин.