СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/50 G01N33/569 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для индикации микобактерий туберкулеза в макроорганизме.

Известны способы выявления микобактериальных антигенов, включающие постановку реакции агглютинации латекса, сенсибилизированного микобактериальными антителами с использованием в качестве второго компонента реакции сыворотки крови [1] или посевов патологического материала [2], а в качестве контрольного препарата - латекса с блокированными глицином функциональными группами.

Известные способы выявления микобактериальных антигенов достаточно чувствительны и специфичны, а синтетический носитель позволяет получать стандартные серии диагностикума с высокой степенью воспроизводимости.

Цель изобретения - расширение арсенала воспроизводимых высокочувствительных и специфических способов индикации микобактерий туберкулеза в макроорганизме.

Поставленная цель достигается использованием в качестве второго компонента реакции агглютинации латекса мокроты, а в качестве лиганда контрольного латексного препарата - иммуноглобулинов кролика, полученных до его иммунизации микобактериями туберкулеза.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Осуществление способа.

Получение диагностического антительного препарата.

К 5,0 мл 0,2%-ной водной суспензии латекса ПЗ-Б2 добавляют 0,50 мг иммуноглобулина, выделенного из сыворотки крови кролика, иммунизированного M. tuberculosis. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов, затем в течение 18 часов при температуре 4^oC при осторожном помешивании. Латекс отмывают фосфатным буфером (pH 7,4-7,6), суспендируют в 1%-ном растворе глицина с повторным отмыванием фосфатным буфером (pH 7,4-7,6). Сенсибилизированный латекс суспендируют в стабилизирующем растворе, разливают по ампулам и проводят лиофильное высушивание. Для проверки специфичности и чувствительности препарата готовят растворы антигенов различных видов бактерий. Антигены из M. tuberculosis, M. bovis, Staphylococcus aureus, Streptococcus feacalis, Escherichia coli готовят путем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация бактериального белка в первой лунке планшеты для иммунологической реакции 100 - 110 мкг. Титрование до 1:320 проводят разведением белка в фосфатном буфере (pH 8,6). В лунки планшеты с 50 мкл раствора антигена добавляют по 50 мкл разведенного в фосфатном буфере лиофильно высушенного антительного латексного диагностикума. Титр 1:80 - 1:160, полученный с раствором антигенов M. tuberculosis, M. bovis, свидетельствует о достаточной чувствительности сухого антительного латексного диагностикума, а практическое отсутствие реакции агглютинации с антигенами стафилококков, стрептококков и кишечной палочки - о его специфичности.

Получение контрольного латексного препарата.

Контрольный латексный препарат готовят как диагностический антительный препарат, но в качестве лиганда используют иммуноглобулины кролика, полученные до его иммунизации микобактериями туберкулеза. Отсутствие реакции агглютинации контрольного латексного препарата с антигенами M. tuberculosis, M. bovis, St. aureus, St. feacalis, E. coli подтверждает отсутствие антител к антигенам этих видов бактерий.

Подготовка мокроты.

Мокроту от больного с поражениями легких без выбора по группе учета собирают в специальные флаконы. 100 - 200 мкл мокроты нагревают на водяной бане до 100^oC в течение 1 минуты, разводят фосфатным буфером (pH 7,4-7,6) в соотношении 1:4, тщательно размешивают и центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадок используют до постановки реакции. Начальное разведение мокроты с учетом всех предыдущих разведений в процессе обработки образца - 1:16.

Постановку реакции проводят в микропланшетах для иммунологических реакций, реакцию учитывают через 2,5 - 3 часа. При наличии положительной реакции с диагностическим латексным препаратом и контрольным латексным препаратом (≈ 5,0% всех образцов) проводят повторное исследование образцов при их последовательном разведении до 1:512. Это связано, как правило, с большей мутностью и вязкостью надосадка мокроты. Дополнительно проводят титрование до 1: 512 всех образцов, давших в разведении 1:16 реакцию на 4+.

Пример 2. Определение эффективности способа.

Проводят исследование мокроты от больных с поражениями легких туберкулезной и нетуберкулезной этиологии.

Изготовление диагностического и контрольного препаратов, постановка реакции как в примере 1.

Результаты представлены табл. 1.

В I группе из 18 образцов мокроты с 4+ дополнительно раститровывают: у 3 образцов - титр 1:128, у 12 - 1:256 и у 3 - 1:512.

Во II группе 4 образца мокроты с 4+ дополнительно раститровывают до 1: 512. Получают у 2 образцов титр 1:256, у 2 - 1:128.

Пример 3. Подтверждение эффективности способа.

В табл. 2 приводятся результаты исследования мокроты на наличие микобактерий антигенов и микобактерий туберкулеза. Микобактериальные антигены выявляют предлагаемым способом, как в примере 1, а микобактерии туберкулеза - методом люминесцентной микроскопии (ЛЮМ) и методом посева по общепринятым методикам.

У всех больных с выявленными методами посева и ЛЮМ микобактериями обнаруживаются микобактериальные антигены. Таким образом, в результате одновременного обследования мокроты больных с туберкулезными и неспецифическими поражениями легких с применением антительного латексного препарата и контрольного латексного препарата выявляется наличие микобактериальных антигенов не только у значительной части больных туберкулезом легких, но и у людей с поражениями легких нетуберкулезной этиологии, находящихся на учете и лечении в терапевтических стационарах, что может свидетельствовать и об атипичном течении туберкулезного процесса, или об естественном наличии антигенов микобактерий в тканях легкого, инфицированного микобактериями макроорганизма.

Источники информации, принятые по внимание:
1. Труды МХТИ вып. 135, стр. 88, 1985.

2. Авт. св. СССР N 1723526, 5 МКИ G 01 N 33/659, 1991.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - расширение арсенала воспроизводимых высокочувствительных и специфических способов индикации микобактерий туберкулеза в макроорганизме. Для постановки реакции агглютинации латекса, сенсибилизированного кроличьими иммуноглобулинами к микобактериям туберкулеза, используют мокроту, а в качестве лиганда контрольного латексного препарата - иммуноглобулины кролика, полученные до его иммунизации микобактериями туберкулеза. Изобретение позволяет расширить арсенал воспроизводимых высокочувствительных и специфических способов индикации микобактерий туберкулеза в макроорганизме. 2 табл.

Способ выявления микобактериальных антигенов, включающий постановку реакции агглютинации исследуемого материала с латексом, сенсибилизированным кроличьими иммуноглобулинами к микобактериям туберкулеза, и с контрольным латексным препаратом, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют мокроту, а в качестве контрольного латексного препарата - латекс, сенсибилизированный иммуноглобулинами кролика до его иммунизации микобактериями туберкулеза.