СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ СОРГО В КУЛЬТУРЕ IN VITRO Российский патент 2001 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции сорго при создании нового исходного материала на основе генной и клеточной инженерии, мутационной селекции в культуре in vltro, при клональном размножении ценных генотипов (стерильных растений, гаплоидов и т.п.).

Известен способ размножения (регенерации) растений сорго в культуре in vitro (авт. св. СССР N 1107799: A 01 H 1/00; 15.06.1982; опубл. 15.10.1984; бюл. N 30), заключающийся в отборе регенерационноспособных типов тканей в каллусных культурах, формирующихся из зрелых зародышей на модифицированной среде по Мурасиге и Скугу (MS), содержащей 2,4-D и цитокинин (кинетин или 6-БАП), и пересадке их на среду для регенерации (MS с ИУК).

Недостатком известного аналога является значительная гетерогенность каллусных культур, формирующихся на среде MS с 2,4-D и цитокинином: в культурах помимо эмбриогенного каллуса, имеющего наибольшее значение для мутационной селекции in vitro и работ по генной и клеточной инженерии, присутствуют дифференцированные меристематические образования ("очаги морфогенеза", ОМ), из которых растения-регенеранты развиваются не только по пути эмбриоидогенеза, но, главным образом, по пути органогенеза. Эмбриогенный каллус на среде с цитокинином быстро дифференцируется, и в культурах в дальнейшем присутствуют ОМ, поддерживающие морфогенную активность культур при пассировании (Эльконин Л.А., Тырнов В.С., Папазян Н.Д., Ишин А.Г. Морфогенез и стабильная регенерация растений в каллусных культурах, полученных от зрелых зародышей Sorghum sp. (Poaceae) // Ботан. журн. - 1989. - Т. 74, N 12. - С. 1740-1746).

Наиболее близким к предлагаемому является способ регенерации растений сорго из эмбриогенных каллусных культур (Elkonin L.A., Lopushanskaya R.F., Pakhomova N. V. Initiation and maintenance of friable embryogenic callus of sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) by amino acids // Maydica, 1995. - V. 40. - P. 153-157), заключающийся в культивировании первичных эксплантов (незрелых зародышей, фрагментов молодых метелок) на питательных средах (MS или N 6), содержащих, в частности, в своем составе ионы NO₃ ^- и NH₄ ⁺ (для MS, соответственно, 39.9 mM и 20.6 mM), 2,4-D и аминокислоты L-аспарагин и L-пролин, добавляемых в среду совместно в высоких концентрациях (2-3 г/л), отборе эмбриогенного каллуса (белой матовой ткани или рыхлого эмбриогенного каллуса), его размножении и пересадке на регенерационную среду (MS с ИУК и кинетином) для получения растений-регенерантов.

Прототип позволяет получать более однородные каллусные культуры, в которых способные к регенерации растений типы тканей представлены только эмбриогенным каллусом, способным к длительной пролиферации при субкультивировании на средах с аминокислотами. Добавка аминокислот подавляет выделение специфического токсического пигмента, характерного для каллусных культур сорго, и у некоторых образцов способствует формированию рыхлого эмбриогенного каллуса - наиболее ценного каллусного морфотипа, формирующегося у злаков в культуре in vitro.

Недостатком данного способа является сравнительно небольшой выход эмбриогенного каллуса у многих образцов сорго - слабый рост, сравнительно низкая частота формирования эмбриогенных культур, - что, в свою очередь, снижает выход растений-регенерантов.

Цель изобретения - повышение выхода эмбриогенного каллуса и растений-регенерантов сорго.

Поставленная цель достигается тем, что по предлагаемому способу регенерации растений сорго в культуре in vitro, включающему получение эмбриогенных каллусных культур на питательной среде по Мурасиге и Скугу, содержащей в своем составе ионы NO₃ ^- и NH₄ ⁺ в приемлемых концентрациях и индукторы каллусогенеза, например, такие как 2,4-D и аминокислоты L-аспарагин и L-пролин, размножение полученного эмбриогенного каллуса на среде того же состава и пересадку его на среду для регенерации, содержащую индукторы морфогенеза, например, такие как ИУК и кинетин, для получения и размножения эмбриогенных каллусных культур используют модифицированную среду MS с концентрацией ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺, составляющей 61 - 88 mM для ионов NO₃ ^-, лучше всего 72.4 mM, и 48 - 78 mM для ионов NH₄ ⁺, лучше всего 62.5 mM (т.е. среду M2).

Для получения нужной концентрации ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺ концентрацию KNO₃ в стандартной рецептуре среды MS снижают до 9.9 mM, а концентрацию NH₄NO₃ повышают до 62.5 mМ.

Доказательства наличия "изобретательского уровня"
В науке и технике не обнаружено решений, обладающих совокупностью признаков, аналогичной предлагаемому. Необходимо отметить существенную и неочевидную роль предлагаемой высокой концентрации источников неорганического азота в сочетании с добавкой L-аспарагина и L-пролина для достижения цели изобретения. Не является очевидным использование высокой концентрации ионов NH₄ ⁺ и NO₃ ^- для значительного увеличения выхода эмбриогенного каллуса и растений-регенерантов у разных образцов сорго.

Таким образом, предлагаемое техническое решение отвечает критерию "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Первичные экспланты (незрелые зародыши, фрагменты молодых метелок) после стерилизации 70%-ным спиртом (30 с) и 5-7%-ным хлорамином (5 мин) культивируют в темноте (t^o = 26±1^oC) предлагаемым способом на предлагаемой модифицированной среде (M2), минеральный состав которой указан в сноске табл. 1, содержащей также агар, сахарозу (30 г/л), витамины B1, B6, РР, мезоинозит (100 мг/л), 2,4-D (1.0 мг/л), L-аспарагин (1.0 г/л) и L-пролин (2.0 г/л) при pH 5.8-6.0. Из первичных эксплантов на этой среде получают большие массы эмбриогенного каллуса. Полученный эмбриогенный каллус с агрегатами эмбриоидов пересаживают для размножения на среду M2 того же состава, либо для регенерации растений на среду MS, содержащую 1.0 мг/л ИУК и 0.1 мг/л кинетина. На среде для регенерации из эмбриогенного каллуса получают растения-регенеранты, пригодные для пересадки в почву.

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

Молодые метелки (длиной 1.5-3.5 см), находящиеся на стадиях формирования примордиев вторичных веточек или колосков, сортообразцов Волжское-2, Желтозерное-10, Сизый, КВВ-181, Раннее-7, МСТ-140 стерилизовали 70%-ным спиртом (30 с) и 5-7%-ным хлорамином (5 мин), промывали автоклавированной водой, нарезали на фрагменты длиной 3-4 мм и помещали в пробирки на поверхность питательной среды M2, а также для сравнения - других сред (табл. 1).

Среда M2 отличалась от среды MS приблизительно трехкратным увеличением концентрации ионов NH₄ ⁺ и двухкратным увеличением концентрации ионов NO₃ ^-, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 9.9 mM KNO₃ и 62.5 mM NH₄NO₃.

Среда M21 имела уровень ионов NH₄ ⁺ среды MS и уровень NO₃ ^- среды M2, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 51.9 mM KNO₃ и 20.6 mM NH₄NO₃.

Среда M23 имела уровень NH₄ ⁺ среды M2 и уровень NO₃ ^- среды MS, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 7.4 mM KNO₃, 32.5 mM NH₄NO₃ и 15.1 mM (NH₄)₂SO₄.

Среда M24 имела шестикратное увеличение уровня NH₄ ⁺ и четырехкратное увеличение уровня NO₃ ^-, по сравнению со средой MS, т.е. удвоенную концентрацию данных ионов по сравнению со средой M2, что достигалось приготовлением модифицированной среды MS, содержащей 6.6 mM KNO₃ и 125.0 mM NH₄NO₃.

Все среды содержали 1.0 мг/л 2,4-D, 1.0 г/л L-аспарагина и/или 2.0 г/л L-пролина, витамины B1 (1.0 мг/л), B6 (1.0 мг/л), PP (1.3 мг/л), 100 мг/л мезоинозита, 3% сахарозы, агар (6 г/л) и имели pH 5.8-6.0. Культивирование проводили в темноте (t^o = 26^oC).

Для регенерации растений эмбриогенный каллус, имеющий вид компактной белой матовой ткани, пересаживали на среду для регенерации (MS, 1.0 мг/л ИУК, 0.1 мг/л кинетина) и культивировали на свету (t^o = 26^oC; фотопериод 16 ч).

Для оценки влияния равных сред учитывали долю культур с эмбриогенным каллусом (ЭК), интенсивность роста ЭК, количество регенерантов (развитых побегов) длиной более 3 см на среде для регенерация. Интенсивность роста каллуса оценивали взвешиванием и/или визуально (в баллах шкалы: 0 - отсутствие роста, ... , 4 - интенсивный рост).

Результаты культивирования, приведенные в табл. 1, показали, что среда M2АП (с 72.4 mM NO₃ ^- и 62.5 mM NH₄ ⁺) значительно превосходила среду MSАП (с 39.9 mM NO₃ ^- и 20.6 mM NH₄ ⁺ - прототип) по интенсивности роста каллуса, при этом рост эмбриогенного каллуса стимулировался наиболее эффективно: масса ЭК на среде M2АП превышала массу ЭК на среде MSАП в 2 раза. Наибольший стимулирующий эффект неорганического азота среды M2 наблюдали при добавке обеих аминокислот: L-аспарагина и L-пролина. Увеличение концентрации только ионов NO₃ ^- (среда M21АП с 72.5 mM NO₃ ^- и 20.6 mM NH₄ ⁺) или только ионов NH₄ ⁺ (M23АП с 39.9 mM NO₃ ^- и 62.5 mM NH₄ ⁺) вызывало значительно более слабый стимулирующий эффект, чем увеличение уровня концентрации обоих ионов. Дальнейшее пропорциональное увеличение концентрации ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺ (среда M24АП с 131.6 mM NO₃ ^- и 125.0 mM NH₄ ⁺) оказывало ингибирующий эффект как на увеличение общей массы каллуса, так и массы эмбриогенного каллуса. Двухфакторный дисперсионный анализ подтвердил значимость наблюдавшихся различий и достоверность (p<0.05) взаимодействия ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺ в индукции и росте эмбриогенного каллуса сорго (табл. 2).

Таким образом, увеличение концентрации ионов NH₄ ⁺ и NO₃ ^- в питательной среде, содержащей аминокислоты L-аспарагин (1.0 г/л) и L-пролин (2.0 г/л), значительным образом стимулировало рост эмбриогенного каллуса сорго.

Зависимость массы ЭК от концентрации ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺ при одновременном увеличении их содержания в питательной среде, как было описано выше, графически представлена на чертеже (А и Б соответственно). Учитывая, что в прототипе концентрация ионов NO₃ ^-составляет 39.9 mM, а также величину ошибки средней (99 мг), очевидно, что статистически значимый эффект наблюдается в диапазоне концентраций 61-88 mM NO₃ ^-. Аналогичным образом, учитывая, что в прототипе концентрация ионов NH₄ ⁺ составляет 20.6 mM, статистически значимый эффект наблюдается в диапазоне концентраций 48-79 mM NH₄ ⁺.

Стимулирующий эффект среды M2 с аминокислотами L-аспарагином и L-пролином был проверен нами на четырех различных сортообразцах сорго. Было выявлено, что среда по предлагаемому способу благоприятна для получения эмбриогенного каллуса у равных сортообразцов, превосходя все другие среды, разработанные ранее для получения морфогенных каллусных культур у сорго: MS с 6-БАП (по аналогу), а также MS с аминокислотами L-аспарагином и L-пролином (по прототипу) (табл. 3).

Для получения растений-регенерантов ЭК, полученный у сортообразцов Сизый и MCT-140 на средах M2АП и MSАП, пересаживали на среду для регенерации (MS+ИУК+кинетин). Было обнаружено, что эмбриогенный каллус, полученный на среде M2 с L-аспарагином и L-пролином, обладает значительно более высокой регенерационной способностью по сравнению с морфологически сходным каллусом, полученным на среде M2 с L-аспарагином и L-пролином (табл. 4). Так, у образца Сизый ЭК со среды M2АП дал значительно более высокую частоту культур с регенерантами (в 3 раза) и большее количество регенерантов в расчете на одну такую культуру (в 12 раз). У образца MCT-140 было также получено значительно большее количество регенерантов из ЭК со среды M2АП, поскольку ЭК на данной среде в каждой культуре имел большую массу, и, следовательно, количество регенерантов в расчете на один ЭК, пересаженный на среду для регенерации, для данной среды было значительно выше. Всего при использовании предлагаемого способа у двух испытанных образцов было получено 170 регенерантов против 31 по прототипу.

Таким образом, приведенные данные и их анализ показывают, что среда M2 по предлагаемому способу с увеличенной концентрацией ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺ в сочетании с добавкой аминокислот (L-аспарагином и L-пролином) значительно усиливает рост ЭК сорго и его регенерационную способность, т.е. позволяет получать большую частоту культур с ЭК, его большую массу и большее количество растений-регенерантов по сравнению с прототипом и другими средами и может использоваться в прикладных и фундаментальных работах, связанных с получением больших количеств ЭК и растений-регенерантов у разных сортообразцов сорго.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть применено в селекции сорго при создании нового исходного материала на основе генной и клеточной инженерии, мутационной селекции в культуре in vitro, при клональном размножении ценных генотипов (стерильных растений, гаплоидов и т. п. ). Для получения и размножения эмбриогенных каллусных культур и регенерации растений сорго используют модифицированную среду Мурасиге и Скуга с увеличенной концентрацией ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺, составляющей 61-88 mM для ионов NO₃ ^-, лучше всего 72,4 mM, и 48-78 mM, для ионов NH₄ ⁺, лучше всего 62,5 mM (среда М2). Концентрация индукторов каллусогенеза составляет 1 г/л L-аспарагина и 2 г/л L-пролина. Предлагаемый способ значительно усиливает рост эмбриогенного каллуса (ЭК) и его регенерационную способность у разных образцов сорго и тем самым позволяет получать большую частоту формирования культур с ЭК, большую массу ЭК и большее количество растений-регенерантов. 1 з.п.ф-лы, 4 табл., 1 ил.

1. Способ регенерации растений сорго в культуре in vitro, включающий получение эмбриогенных каллусных культур на питательной среде по Мурасиге и Скугу, содержащей в своем составе ионы NO₃ ^- и NH₄ ⁺ в приемлемых концентрациях и включающий индукторы каллусогенеза 2,4 - D и аминокислоты L-аспарагин и L-пролин, размножение полученного эмбриогенного каллуса на среде того же состава и пересадку его на среду для регенерации, содержащую индукторы морфогенеза ИУК и кинетин, отличающийся тем, что для получения и размножения эмбриогенных каллусных культур используют модифицированную среду Мурасиге и Скуга с концентрацией ионов NO₃ ^- и NH₄ ⁺, составляющей 61-88 mM для ионов NO₃ ^-, и 48-78 mM для ионов NH₄ ⁺. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация ионов предпочтительно составляет для NO₃ ^- - 72,4 mM, а для NH₄ ⁺ - 62,5 mM.