СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IN VITRO СЕЛЕКЦИОННОЙ ПОПУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАНТОВ ПРИ САМОКЛОНАЛЬНОМ СОРТОУЛУЧШЕНИИ КАРТОФЕЛЯ Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к селекции растений и к селекционным биотехнологиям, и может использоваться для получения сортовых модифицированных форм и нового исходного материала картофеля.

Ускорение селекционного процесса и создание новых форм растений с улучшенными характеристиками признаков вызывает более масштабное применение в селекционно -генетических исследованиях метода клеточно-тканевой культуры "in vitro" (Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений, М. Наука, 1964, с. 272). Известно, что при длительном культивировании "in vitro" изолированных растительных тканей в виде каллуса в клетках накапливаются наследственные изменения (Шамина З.Б. Генетическая изменчивость растительных клеток "in vitro". В кн. Культура клеток растений. Киев: Наукова думка, 1978, с. 80-93). Кунах В.А. Цитогенетическая изменчивость клеточных популяций в культуре изолированных тканей растений. В сб. Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М. ВАСХНИЛ, 1979, с. 38-51. Shepard J.Bidney D. Shahin E. potato protoplasts in srop improvement science, 1980, 208, 4439:17-24.

Появляется возможность использования этого явления для селекционного улучшения культуры картофеля (Хромова Л.М. Седнина Г.В. Бутенко Р.Г. и др. Клеточная селекция картофеля. Сельскохозяйственная биология, 1983, N 6, с. 3-11. Хромова Л.М. Седнина Г.В. Бутенко Б.Г. и др. Возможность методов культуры тканей для выявления вариабельности генотипов картофеля. Доклады ВАСХНИЛ, 1983, N 10, с. 21-23. Хромова Л.М. Возможность сомаклональной вариабельности генотипов картофеля для улучшения сортов. Научные труды НИИКХ. Исследования по клеточной селекции картофеля. М. 1984, с. 68-75).

Предложена питательная среда для реализации явления (А. с. СССР N 1276308, кл. A 01 H 3/00).

Получение вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля по способу, предложенному Бутенко Р.Г. Хромовой Л.М. Седниной Г.В. прототип предлагаемого в данной заявке способа (Бутенко Р.Г. Хромова Л.М. Седнина Г. В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля. М. ВАСХНИЛ, 1984, с. 28 ).

Недостатки этого способа: слабая и не гарантированная регенерация или очень длительный по времени процесс морфогенеза в многократно пассированной каллусной ткани; получение ограниченной по объему популяции вариантов, сильно захламленной грубыми аберрантами и малоценными для практической селекции формами с сильно разрушенной наследственной основой (монстры-уроды, нежизнеспособные хлорифилдефектные альбиносы, деградированные по продуктивности и болезнеустойчивости регенеранты и т.д.). Эти недостатки мешают эффективному использованию возможностей клеточной вариабельности (соматический мутагенез) в практической селекции картофеля.

Целью изобретения является получение более качественных, крупных и практически значимых популяций вариантных клеточных линий-регенерантов у образцов картофеля, вовлеченных в процесс сортоулучшения путем сомаклональной селекции.

Поставленная цель достигается последовательным клеточно-тканевых трансформаций "in vitro": эксплантация фрагмента листа-ускоренный каллусогенез-эффективный морфогенез успешное ускорение и развитие регенеранта. При этом наблюдается ступенчатое накопление мягких и разнообразных эффектов, постоянная браковка и отсев нежизнеспособных вариантов и накопление крупной популяции регенерантов с ожидаемой коррекцией отдельных признаков и с сохранением в основном ранее удачно сложившихся параметров исходных сортообразцов.

Способ осуществляют следующим образом.

Для быстрого получения (в течение месяца) объемной и потенциально морфогенной каллусной ткани достаточно крупные (5 х 5 мм) листовые фрагменты, взятые от стерильных (оздоровленных) пробирочных растений, помещают на только что застывшую питательную среду следующего состава: минеральные элементы по Мурасиге и Скугу с содержанием в 1 л по 20 г сахарозы и глюкозы, 6-7 г агар-агара (типа "Дифко"), 1 г гидролизата казеина, 100 мг мезоинозита, по 1 мг глицина и аденина, по 0,5 мг тиамина, пиридоксина и фолиевой кислоты, 5 мг никотиновой кислоты, 2 мг 2,4 Д и 0,3-0,6 мг кинетина. Культивируют в пробирках с ватно-марлевыми пробками первые трое суток в темноте и при комнатной температуре, а в дальнейшем при круглосуточной интенсивной светокультуре (7-10 тыс. люкс) и температуре 26-28^o С. Через месяц после эксплантации фрагментов листа крупные фрагменты (d≈ 5 мм) образовавщейся каллусной ткани помещают для гарантированной регенерации параллельно на две лучших для большинства сортов свеже застывшие питательные среды для индукции морфогенеза НИИКХа и Шепарда; через 2-3 месяца после посадки фрагментов на морфогенные среды снимают для укоренения и подращивания (в течение 20-25 дней) на обеденную питательную среду, используемую обычно для регенерации меристем при оздоровлении и при микроклональном размножении картофеля, следующего состава: минеральные элементы по Мурасиге и Скугу с содержанием в 1 л 20 г сахарозы, 6-7 г агар-агара, 100 мг гидролизата казеина, по 0,2 мг тиамина и аскорбиновой кислоты, по 0,1 мг пиридоксина и ИУК, 0,05 мг кинетина и 0,02 мг феруловой кислоты. Полученные регенеранты микроклонально размножают, в начале июня высаживают для получения необходимого клубневого потомства.

В ДальНИИСХ проводились исследования по получению популяции регенерантов от трех сортов: Евгирия, Поинер, Амурец по предлагаемому способу. Лучшие условия каллуогенеза. Крупные (5•5 мм) листовые фрагменты со стерильных пробирочных растений помещали на только что застывшую питательную среду указанного выше состава, культивировали в пробирках с ватно-марлевыми пробками первые трое суток в темноте и при комнатной температуре, а затем при круглосуточных интенсивной светокультуре (7-10 тыс.люкс) и температуре 26-28^o С. Лучшие условия каллусогенеза были определены экспериментально (Анненков Б.Г. Белуга Т.А. Каллусообразование у сортов картофеля. Доклады ВАСХНИЛ, 1991, N 3, с. 14-17. Питательная среда для каллусогенеза практически соответствовала прототипу. Бутенко Р.Г. Хромова Л.М. Седнина Г.В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля. М. ВАСХНИЛ, 1984, с. 28). Свежезастывшая среда, имеющая линзу конденсата влаги на поверхности, обязательное условие тесного контакта экспланта и субстрата в первые сутки после эксплантации, а, следовательно, более результативной приживаемости фрагментов листовой и каллусной ткани. Через месяц после эксплантации фрагментов листа крупные фрагменты (d≈5 мм) образовавшейся каллусной ткани (по прототипу - клеточная суспензия или мелкие каллусные агрегаты) помещали для гарантированной регенерации параллельно на две лучшие для большинства сортов только что застывшие питательные среды для индукции морфогенеза НИИКХа и Шепарда, состав которых приведен в Методических рекомендациях по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля (М. ВАСХНИЛ, 1984, c.28. Авторы Бутенко Р.Г. Хромова Л. М. Седнина Г.В. (прототип).

Исследования, проведенные в ДальНИИСХе по каллусогенезу, показали, что относительно медленно растущие листовые каллусы (табл. 1) были более сухими в наших условиях, чем каллусы из других органов картофельного растения, но обладали более высокой способностью к морфогенезу (табл. 2 и 3). Способность к регенерации (тотипотентность) у картофеля генетически детермирована, но реализация этой способности у различных сортов зависит от используемой для этого питательной среды. Одни генотипы удовлетворительно регенерируют на обеих морфогенных средах (НИИКХа и Шепарда), другие генотипы склонны к быстрому органогенезу только на одной из них. Поэтому для гарантированного получения регенерации у вновь вовлекаемых в сортоулучшение сортов параллельно использовали две морфогенные среды. Через 2-3 месяца после посадки фрагментов каллусов на морфогенные среды снимали образовавшиеся на каллусных агрегатах побеги и эксплантировали их для укоренения и подращивания (в течении 20-25 дней) на обеденную среду, обычно используемую для регенерации меристем при оздоровлении и при микроклональном размножении картофеля (Трофимец Л.Н. Остапенко Д.П. Бойко В.В. и др. Оздоровление и ускоренное размножение семенного картофеля. Методические указания. М. ВАСХНИЛ, 1985, с. 35) следующего состава: минеральные элементы по Мурасиге и Скугу, с содержанием в 1 л 20 г сахарозы, 6 7 г агар-агара, 100 мг гидролизата казеина, по 0,2 мг тиамина и аскорбиновой кислоты, по 0,1 мг пиридоксина и ИУК, 0,05 мг кинетина и 0,02 мг феруловой кислоты.

После этого с жизнеспособных и нормально развившихся регенерантов вновь эксплантировали крупные фрагменты листьев на питательную среду для каллусогенеза и повторяли весь ускоренный цикл клеточно-тканевых манипуляций "in vitro". Всего проводили 4 6 циклов (1,5 года), в зависимости от взятого исходного сорта (его способности к быстрому морфогенезу). Через полтора года сравнительных клеточно -тканевых трансформаций "in vitro" по прототипу и по предлагаемому способу были получены популяции регенерантов от трех сортов - Евгирия, Пионер, Амурец. (табл. 4). Наблюдалось увеличение выхода регенерантов по предлагаемому способу по сравнению с прототипом. Присутствие грубых абберантов (глазомерно малоценных, с заметными внешними отклонениями от исходного типа) в процентном выражении на популяцию было на порядок ниже, чем по прототипу.

Полученные по прототипу и по предлагаемому способу регенеранты микроклонально размножали, отбросив грубые абберанты; в начале июня высаживали по 10 пробирочных растений в почву на орошаемом участке для получения необходимого клубневого потомства (40 штук). При этом часть номеров из популяций выпало в связи с плохой приживаемостью в нестерильных условиях. Собранные клубни нормального семенного размера на следующий год высаживали в поле для проведения сравнительных селекционных испытаний. Посадка проводилась 15 мая на гряде с междурядьем 140 см, делянки десятиклубневые длиной 6 м, повторность в опыте четырехкратная. Уборка ручная, покустная 15 сентября. Данные сравнительной продуктивности популяций, обусловленной уровнем их жизнеспособности и приспособленности к конкретно складывающимся полевым условиям, приведены в табл. 5.

Сравнительная полевая оценка продуктированости исходных меристемных сортов картофеля и полученных из них популяций вариантных регенерантов (второе клубневое потомство) представлена в табл. 1.

Обнаружено, что средний уровень общей продуктивности популяций, полученных по предлагаемому способу, выше, чем у популяций, полученных по прототипу. Любые незначительные (точечные), а тем более сильные и многочисленные мутации и хромосомные перестройки могут вести к сильной разбалансировке сложной генетической взаимосвязанной системы, каковой является сортовой геном картофеля. Поэтому предлагаемый способ позволяет получать более качественную для практики селекционную популяцию, чем по прототипу.

Все образцы популяций, полученных по прототипу, были менее урожайны, чем исходные сорта. Среди популяций, полученных по предлагаемому способу, встречались образцы с большей общей урожайностью, чем у исходных для сортоулучшения сортов. Кроме этого, при достаточно высоком уровне продуктивности отмечены разнообразные новые качества, в т.ч. такие хозяйственно-значимые, как скороспелость (у позднеспелого сорта Евгирия), лучшее ягодообразование (что позволяет размножать картофель через настоящие семена), повышение крахмалостости и улучшение вкуса, изменение компактности куста и стеблестойкости (что позволяет проводить дополнительную механическую обработку в посевах), увеличение клубневости (что позволяет эффективнее вести семеноводство бывших крупноклубневых сортов), мелколистность, повышающую полевую устойчивость к грибным листовым пятнистостям, и т.д.

Предлагаемый способ при примерно одинаковых затратах времени и трудозатратах с прототипом, позволяет получать количественно на порядок большую популяцию регенерантов, которая также качественно ценнее для практического использования при сомаклональном сортоулучшении, поскольку возрастает вероятность появления на заключительном этапе создания популяций желаемых коррекций отдельных важных признаков при сохранении в основном удачно сложившихся параметров общей продуктивности и жизнеспособности исходных образцов картофеля, вовлеченных в сортоулучшение методом сомаклональной селекции.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: способ заключается в накоплении наследственного изменения путем последовательного повторения 4-6 циклов получения растений регенерантов из исходного листового экспланта. При этом листовой эксплант высевают на свежеприготовленную питательную среду, имеющую линзу конденсата на поверхности, получают из экспланта недефференцированную ткань, из которой индуцируют морфогенез. 2 з. п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения in vitro селекционной популяции регенерантов при самоклональном сортоулучшении картофеля, включающий накопление наследственной изменчивости за счет высева листовых эксплантов питательную среду, получение недифференцированной каллусной ткани, индукцию в ней морфогенеза до получения побегов, укоренения их и получения растений-регенерантов, отличающийся тем, что накопление наследственной изменчивости осуществляют путем последовательного повторения 4 6 циклов получения растений-регенерантов из исходного листового эксплантанта. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для высева на питательную среду используют листовые эксплантанты размером 5 х 5 мм. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что высев эксплантантов осуществляют на свежезастывшую питательную среду, имеющую линзу конденсата на поверхности.