ШТАММ СИНЕ-ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ SPIRULINA PLATENSIS (NORDST) GEITL КАК ИСТОЧНИК БЕЛКА И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1997 года по МПК C12P21/00 C12N1/12 A23K1/00 C12N1/12 C12R1/89 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства белка с помощью сине-зеленых водорослей, а более конкретно новых штаммов сине-зеленых водорослей, являющихся источниками белка и биологически активных веществ.

Биомасса сине-зеленых водорослей, содержащая до 70% белка, находит применение в качестве корма для сельскохозяйственных животных и птиц. Поэтому сине-зеленые водоросли являются одними из промышленных источников растительного белка.

Достоинства сине-зеленых водорослей как источника белка состоят в том, что они способны расти на дешевых минеральных средах, не требуют органических субстратов, достаточно продуктивны и технологичны, легко поддаются направленному биосинтезу, не имеют плотных оболочек.

Наиболее близким к предложенному является штамм сине-зеленых водорослей Spirulina platensis (Gom.) Geitl, биомасса которого используется в качестве добавки к кормам животных и птицы.

Этот штамм обладает типичными морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками, присущими сине-зеленым водорослям рода Spirulina.

Относительный недостаток известного штамма состоит в сравнительно низком уровне накопления биомассы в условиях промышленного культивирования 0,3 - 0,5 г асв/л в сутки и в нестабильности в условиях длительной непрерывной культуры выраженном полиморфизме, значительном снижении продуктивности.

Цель изобретения получить штамм сине-зеленых водорослей, обладающий повышенной способностью накопления биомассы и пригодный для крупномасштабного промышленного культивирования.

Поставленная цель была достигнута в результате длительной селекционной работы, проводившейся в условиях непрерывной культуры в течение двух лет в проточном режиме, что привело к выделению высокопродуктивного штамма Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437.

Заявленный штамм депонирован в Коллекции Института физиологии растений АН СССР под регистрационным номером IPPAS B-437.

Селекционный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические свойства
На стандартной среде Заррук в оптимальных условиях образует преимущественно прямые и реже спиральные нити сине-зеленого цвета длиной 300 - 500 мкм без жгутиков и выпячиваний.

Подвижность умеренная; в интенсивных условиях выращивания неподвижны.

Чехол слизистый, слабо выраженный, "домика" нет, вакуоли внутриклеточные, на ранних стадиях присутствуют также и газовые вакуоли, ядро прокариотическое.

Таллома нет.

Половое размножение отсутствует, бесполое размножение путем образования гармогоний посредством фрагментации трихомов.

На плотной среде Заррук с 1,2% агара при комнатной температуре и естественной освещенности рост в виде сплошного газона, состоящего из одиночных прямых трихомов длиной 350 700 мкм и диаметром 5 6 мкм. В массе трихомы формируют дерновину сине-зеленого цвета, образованную слабо переплетающимися нитями.

При гибели культуры наблюдается выброс фикобилиновых пигментов. На жидкой среде Заррук рост активный, пенообразование слабое. Рост сохраняется в виде прямых трихомов длиной 300 500 мкм. Трихомы либо одиночные, либо образуют коремии ("щепочки" из нескольких нитей). Слизистый чехол трихома слабо представлен. При длительном проточном культивировании культура полностью синхронизируется, полиморфизм отсутствует. Суспензия в массе сине-зеленая, слабо слизистая. При прекращении перемешивания легко образуется осадок; культура полностью осаждается в течение 40 мин. Осадок аморфный, легко взмучивается. Полное взмучивание осадка в течение 40 мин 1 ч. При длительном прекращении перемешивания возможно обрастание стенок.

Физиолого-биохимические свойства
Азот не фиксирует; использует в качестве источника азотного питания нитратный (преимущественно) и аммонийный азот.

В качестве источников углерода использует бикарбонаты (преимущественно), карбонаты, органические соединения.

Растет при использовании источников света любого спектрального состава в области ФАР.

Оптимальный рост при использовании источника света, близкого по спектральному составу к солнечному.

Отмечен рост при облученности 10 200 Вт/кв.м ФАР; оптимальная облученность 50 100 Вт/кв.м ФАР в зависимости от толщины культурального слоя.

Фотопериод составляет 12 24 ч, оптимально 24 ч; сезонности нет.

Растет в интервале солености 3 30 промилле; оптимум 8 12 промилле.

Наблюдается рост при pH 6,0 11,0; оптимум при pH 9,5. Рост наблюдается в интервале температур 20 30^oC; оптимум 28^oC. Гибель наступает при температуре выше 34^oC и ниже 8^oC.

Агглютинация возможна при нарушении ионного баланса среды при снижении скорости массобмена.

Штамм обладает бактерицидными свойствами при концентрации биомассы более 2 г асв/л количество бактерий в среде снижается.

Устойчивость штамма:
к механическим воздействиям слабая;
к температуре выше 35^oC гибель наступает через 4 6 ч;
к затемнению устойчив лишь при температуре 7 11^oC, но не более месяца;
к инсоляции выдерживает до 200 Вт/кв.м ФАР при толщине культурального слоя 20 мм, стабильном уровне нитратного азота порядка 300 мг/л и концентрации биомассы не менее 1 г асв/л;
к углекислоте при длительном продувании чистой углекислоты устойчивость мала.

Химический состав клеток следующий к асв:
Белок (по Лоури) 68,0
Углеводы 2,0
Жир сырой 5,0
в том числе:
жирорастворимые пигменты 2,0
бета-каротин 0,5 0,8
Водорастворимые
пигменты 3,0 6,0
Зола 8,0
Клетки содержат также
Витамины группы цианкобаламинов 2 гаммы/г асв
Аскорбиновую кислоту 80 мг/100 г асв
Биотехнологические характеристики
Оптимальная температура культивирования 28 30^oC.

Критические температуры +5^oC и +35^oC.

Оптимальное значение pH 9,0 9,5.

Критические значения pH 5,0 и ниже; 11,0 и выше.

Оптимальные уровень облученности 50 100 Вт ФАР/кв.м на поверхности лучеприемника.

Рост отсутствует при облученности ниже 10 Вт ФАР/кв.м; выше 200 Вт ФАР/кв.м.

Оптимальный состав среды культивирования, г/л: нитрат натрия 2,5, двузамещенный фосфат калия 0,6, магний сернокислый 0,5, натрий двууглекислый кислый (бикарбонат) 9,0, кальций хлористый 0,04, хлористый натрий 2,0, железо сернокислое закисное 0,01, натриевая соль ЭДТА 0,03, борная кислота 0,003, марганец хлористый 0,0018, цинк сернокислый 0,0002, молибденовокислый аммоний 0,00003, хлористый кобальт 0,00005.

Равная по эффективности среда может быть приготовлена не на основании чистых солей, а на основе минеральных удобрений. В последнем случае ее состав следующий, г/л: натриевая селитра 1,5 2,5, калимагнезия 0,3 0,5, нитроаммофоска 0,4 0,6, натрий двууглекислый кислый (бикарбонат) 8,0 10,0, натрий хлористый 1,0 2,0, железо сернокислое закисное 0,01, натриевая соль ЭДТА 0,03, борная кислота 0,0029, магний хлористый 0,0018, цинк сернокислый 0,0002, аммоний молибденовокислый 0,00003, кобальт хлористый 0,00005.

Накопление биомассы составляет 1,0 1,2 г абсолютно сухого вещества/л в сутки при освещенности 50 Вт/кв.м и 1,5 1,8 г асв/л в сутки при освещенности 100 Вт/кв.м.

Культура стабильна при длительном культивировании и сохраняет основные морфологические, физиологические и биохимические свойства в течение двух лет при интенсивном режиме культивирования.

Штамм является экологически чистым; при концентрации биомассы выше 2,0 г асв/л устойчив к контаминации бактериями.

Предлагаемый штамм по ряду признаков заметно отличается от известного штамма, что показано в следующей таблице.

В таблице приведены некоторые сравнительные характеристики известного штамма Spirulina и предложенного штамма Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437.

Преимущества предложенного штамма перед известным состоят в том, что он адаптирован к интенсивным условиям длительного промышленного культивирования и в этих условиях в отличие от известного штамма сохраняет высокий уровень накопления биомассы.

Пример 1. Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437 выращивают в колбах вместимостью 350 мл на среде, содержащей, г/л: нитрат натрия 3,0, двузамещенный фосфат калия 0,6, сульфат магния 0,6, бикарбонат натрия 9,0, хлористый кальций 0,04, хлористый натрий 2,0, сернокислое железо 0,01, натриевая соль ЭДТА 0,03, борная кислота 0,0029, хлористый марганец 0,0018, сернокислый цинк 0,0002, молибденовокислый аммоний 0,00003, хлористый кобальт 0,00005.

Культивирование проводят при pH среды 9,0, температуре 28^oC и интенсивности освещения 50 кв.м ФАР в течение 5 суток. Освещение осуществляли круглосуточно лампами КГ-1500 W и люминесцентными. По завершении процесса выход биомассы составил 6,5 г асв/л или 1,2 г асв/л в сутки.

Пример 2. Штамм водорослей Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437 выращивают в стеклянном культиваторе объемом 0,3 л на среде, содержащей г/л: нитратная селитра 1,9, калимагнезия 0,4, нитроаммофоска 0,5, бикарбонат натрия 10,0, хлористый натрий 1,6, железо сернокислое закисное 0,01, натриевая соль ЭДТА 0,03, борная кислота 0,0029, хлористый магний 0,0018, сернокислый цинк 0,0002, молибденовокислый аммоний 0,00003, хлористый кобальт 0,00003.

Выращивание проводили при уровне освещенности 50 Вт/кв.м ФАР, при температуре 28^oC, при pH 9,0, постоянном барботаже воздухом и непрерывном световом дне.

Режим культивирования проточный; полная замена среды за 2 суток. Общий цикл культивирования 27 дней.

Средний уровень накопления биомассы составил 1,1 г асв/л в сутки.

Пример 3. Штамм Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437 выращивают в тонкослойном трубчатом культиваторе объемом 5 л на среде, содержащей, г/л: нитратная селитра 2,5, калимагнезия 0,5, нитроаммофоска 0,6, бикарбонат натрия 9,0, хлористый натрий 2,0, железо сернокислое закисное 0,01, натриевая соль ЭДТА 0,03, борная кислота 0,0029, хлористый магний 0,0018, сернокислый цинк 0,0002, молибденовокислый аммоний 0,00003, хлористый кобальт 0,00003.

Выращивание осуществляли при постоянной облученности 100 Вт/кв.м ФАР в проточном режиме. Интенсивность воздухообмена 70 г/л суспензии /ч. Рабочая плотность суспензии 3 4 г асв/л. Общий цикл культивирования 20 дней.

Средний уровень накопления биомассы 1,8 2,0 г асв/л в сутки.

Представленные данные свидетельствуют о значительных физиолого-морфологических отличиях предлагаемого штамма от известного и о его технологических преимуществах перед известным штаммом сине-зеленых водорослей.

Использование: биотехнология, получение белка. Сущность изобретения: новый штамм сине-зеленых водорослей Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437, обладающий повышенной продуктивностью и пригодный для крупномасштабного промышленного культивирования. В результате длительной селекции был выведен указанный штамм Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS B-437, способный накапливать биомассу в количестве 1,0 - 1,5 г асв/л/сутки. 1 табл.

Штамм синезеленых водорослей Spirulina platensis (Nordst) Geitl IPPAS В-437 как источник белка и биологически активных веществ.