ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 1997 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области биологии, медицине, ветеринарии, а именно к иммуностимуляторам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии как лекарственное средство для человека и животных, а также в биологии и медицине для научно-исследовательских целей.

Известен полисахарид гамма-плант (γ-PL), обладающий противоинфекционным действием и не обладающий геммаглютинирующим действием.

Указанный препарат был представлен на выставке "Здоровье-93", 26.06 - 30.06.93, г. Москва (официальный каталог).

Целью изобретения является применение g-PL как нетоксичного вещества в качестве иммуностимулирующего средства, проявляющего иммуноадьювантную и митогенную активности in vitro и in vivo.

Сущность изобретения заключается в том, что было изучено действие g-PL на фагоцитоз перитонеальных макрофагов мыши, профилеративную активность лимфоцитов периферической крови больных и здоровых людей, активацию деления спленоцитов мышей in vitro, а также на гуморальный иммунный ответ у мышей различных генотипов и иммунный ответ у иммунодефицитных мышей. Критериями оценки действия g-PL служили титры антител (АТ) в сыворотке крови, число антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных животных и число субпопуляций лимфоцитов периферической крови человека.

Пример 1. Влияние g-PL на фагоцитоз эритроцитов барана (ЭБ) перитонеальными макрофагами мыши in vitro.

Фагоцитоз (ЭБ) легко доступен для количественной спектрофотометрии внутриклеточного гемоглобина (Morita T. Perkins E.H. - J.reticuioendothel.Soc. 1965, 2. 406 419).

Для получения перитонеальных макрофагов мышей забивают цервикальной дислокацией и стерилизуют в 70% спирте. В брюшную полость вводят 3 4 мл жидкости (изотонический буфер с добавлением гепарина и 20 мл сыворотки эмбрионов коров из расчета на 1 л). После чего перитонеальную жидкость медленно отсасывают. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 150 g, ресуспендируют осадок в растворе Хенкса. Все процедуры проводят на льду. Клетки в количестве 2•10⁶ в 1 мл заливают в лунки по 200 мкл и инкубируют 4 ч в CO₂ инкубаторе. Затем меняют полную среду и оставляют на 12 ч в CO₂ инкубаторе. Добавляют свежеотмытые ЭБ и проводят инкубацию в термостате. Через 30, 60, 90, 120, 150 мин в отдельных лунках отбирают супернатант и проводят гипотонический шок. В результате этой процедуры удаляются ЭБ, не подвергнутые фагоцитозу. Проводят детектирование при длине волны 405 нм -специфической для поглощения гемоглобина. В опытах исследовали группы макрофагов, инкубировавшиеся различное время с g-PL.

Данные представлены на чертеже. Кривая 1 представляет фагоцитоз ЭБ перитонеальными макрофагами. Кривая 2 отражает фагоцитоз ЭБ перитонеальными макрофагами, которые инкубировались различное время и в разных модификациях с g-PL. Обе кривые построены с вычетом фонового поглощения. Из представленных значений фагоцитоза видно, что g-PL не оказывает какого-либо влияния на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мыши. Переваривающая активность макрофагов и влияние на нее g-PL не исследовались.

Пример 2. Влияние g-PL на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови больных и здоровых людей in vitro.

Лимфоциты периферической крови выделяют из гепаринизированной крови больных и здоровых людей в градиенте 9% раствора фиколл-верографин. Кровь аккуратно наслаивают на раствор градиента (1,0 1,0) и центрифугируют при 400 g 30 40 мин. Отбирают зону, содержащую лимфоциты. Клетки перемешивают в среде RPMI 1640 и центрифугируют при 200 g 15 мин. Осадок ресуспендируют и вновь центрифугируют при тех же условиях. Осадок клеток ресуспендируют в полной среде (RPMI 1640, 10% эмбриональная сыворотка теленка, 0,2М глутамина, 1М HEPES, гентамицин). Смешивают 50 100 мкл клеточной суспензии (1 - 2•10⁷ клеток) с равным объемом соответствующей меченой ФИТЦ антисыворотки и держат во льду 20 30 мин. Затем добавляют холодную среду и осаждают клетки цинтрифугированием. Отмывание клеток повторяют трижды, как указано выше. Окрашенные клетки помещают на предметное стекло и готовят мазок. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют в этаноле. Затем проводят микроскопию.

В табл. 1 представлены показатели T-клеточных субпопуляций на 3, 5 и 7 сут культивирования лимфоцитов здоровых (A) и больных (Б) людей.

Данные (табл.1, Б), полученные in vitro в культуре лимфоцитов периферической крови людей с различными иммунодефицитными состояниями (нарушение T-звеньев, связанное с хроническими инфекциями), свидетельствуют о том, что непосредственное воздействие g-PL на лимфоциты приводит к восстановлению нормального соотношения субпопуляций T-лимфоцитов. При исходно нормальном количестве субпопуляций T-лимфоцитов (табл.1, А) совместное культивирование с g-PL не приводит к каким-либо количественным сдвигам.

Пример 3. Гуморальный иммунный ответ у мышей различных генотипов к корпускулярному и водорастворимому антигенам (АГ) и иммунный ответ у иммунодефицитных мышей до и после введения g-PL.

Была изучена динамика антительного (АТ) ответа у мышей F1(CBAxC57B1/6) к белку возбудителя сибирской язвы (СЯ). Динамика титров АТ вторичного иммунного ответа к антигену СЯ при совместном введении с g-PL свидетельствует о значительном (в 10 20 раз) увеличении титров специфичных к СЯ AT IgG-типа. При этом пик вторичного иммунного ответа в отличие от контрольного (иммунизация мышей только белками СЯ) проявлялся раньше (с 7 сут), был выше и продолжительнее.

Гуморальный иммунный ответ изучают у мышей линий CBA, C 57 B 1/6 и (CBA•C 57 B 1/6)F1. В качестве АГ используют эритроциты барана (ЭБ). Для выявления клеток, образующих АТ, применяли метод локального гемолиза. (Иммунологические методы. М. Медицина, 1987). Совместное введение g-PL с корпускулярным АГ ЭБ 2•10⁶ вызывает максимальное образование АОК. Коэффициенты стимуляции приведены в табл.2.

В качестве иммунодефицитных мышей были выбраны B-мыши и мыши nude. Для получения B-мышей используют F1(CBAхC57B1/6). Тимэктомированным, летально облученным мышам (850 р) переносят клетки костного мозга (2•10⁷) и после восстановительного периода изучают иммунный ответ к ЭБ. В табл.3 приведено число АОК в селезенках мышей, иммунизированных различными дозами ЭБ. Видно, что у B-мышей и nude значительно снижен ответ к ЭБ.

Экспериментальные данные обработаны с вычислением средней арифметической и доверительного интервала (p≅0,05).

Коэффициенты стимуляции гуморального иммунного ответа к ЭБ под воздействием g-PL в дозе 10 мкг/мышей у контрольных и опытных мышей приведены в табл.4.

Из табл. 4 видно, что значения коэффициентов стимуляции у контрольных и опытных мышей сравнимы.

Пример 4. Митогенные свойства g-PL.

Митогенные свойства g-PL исследуют in vitro в культуре спленоцитов мышей (CBAхC57B1/6)F1 (Meschell R.J. Dutton R.W. J.Exp.Med. 1967, v.126, p.423-432). Доза g-PL 10 мкг на 1•10⁶ клеток приводит к максимальному ответу лимфоцитов и вызывает появление 60 80% бластных клеток на вторые сутки культивирования. Кривая бластной трансформации g-PL имеет S-образную форму и подобна кривой бластной трансформации конканавалина A.

Использование: медицина, ветеринария, в качестве иммуностимулирующего средства для человека и животных, а также для научно-исследовательских целей. Сущность изобретения: изучено действие γ-PL на фагоцитоз перитонеальных макрофагов мыши, пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови больных и здоровых людей, активацию деления спленоцитов мышей in vitro, а также на гуморальный иммунный ответ у мышей различных генотипов и иммунный ответ у иммунодефицитных мышей. Было показано, что γ-PL не оказывает какого-либо влияния на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мыши; in vitro в культуре лимфоцитов периферической крови людей с различными иммунодефицитными состояниями непосредственное воздействие γ-PL на лимфоциты приводит к восстановлению нормального соотношения субпопуляций T-лимфоцитов, тогда как при исходно нормальном количестве субпопуляций T-лимфоцитов совместное культивирование с γ-PL не приводит к каким-либо количественным сдвигам; γ-PL является иммуноадьювантом широкого спектра действия, существенно повышает титр антител к белковому и корпускулярному антигенам, проводит коррекцию иммунного ответа у иммунодефицитных мышей (B-мышь, nude); γ-PL проявляет митогенные свойства in vitro в культуре спленоцитов мышей (CBAxC57B1/6)FI и вызывает появление 60 - 80% бластных клеток на вторые сутки культивирования. 4 табл., 1 ил.

Применение гамма-плант (γ-PL) в качестве иммуностимулирующего средства, проявляющего иммуноадьювантную и митогенную активности in vivo и in vitro.