НОВЫЙ РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГЛЮКАН КАК ИММУНОАДЪЮВАНТ Российский патент 2008 года по МПК A61K36/81 A61P37/04 

Изобретение относится к биологии и биотехнологии, в частности к новым соединениям, выделенным из растительных клеток, и может быть использовано в медицине и ветеринарии как адъювантное средство, усиливающее иммунологический ответ к различным антигенам в сочетании с вакцинами разнообразного генеза, а также в биологии и медицине для научно-исследовательских целей.

Известны, как наиболее близкие по структуре, полисахариды дрожжевых клеток (Saccharomyces cerevisia). Это: 1) зимозан - нерастворимая часть оболочек дрожжевых клеток, сотоящих из протеина, липидов и сложных полисахаридов - маннанов и глюканов (Басс-Шадхан Х.Ф. Зимозан: Методы получения, биохимическая характеристика и перспективы применения. - Рига: Зинатне, 1970. - 313 с.); 2) маннозим - нерастворимый полисахарид мембран дрожжевых клеток, в составе которого 85,7% углеводов, из них 70,8% маннанов и 10,9% глюканов (Cseh G., SzaboI., Bagdy D. Procedure for the production of yeast cell wall polysaccharides. Pat. 147791 (Hung), 1959); 3) глюканы - полимеры глюкозы, состоящие из остатков D-глюкозы, связанных - β(1-3)-глюкозидными связями (Herbert D., Phipp P.S., Strange R.E. Chemical analysis of microbial cells. // Methods Microbiol. - 1971. - Vol 5B. - P.209-344).

Однако применение этих препаратов в клинике затруднено из-за недостаточности биологических и иммунологических сведений о механизме взаимодействия этих препаратов с системами организма, особенно с иммунной; из-за трудностей установления оптимальных доз, времени и пути их введения; наличия нарушений иммунорегуляции, усиливающихся иногда при введении данных препаратов.

К настоящему времени предложено значительное количество материалов различного происхождения, позволяющих использовать их с целью получения высокого иммунного ответа к различным антигенам (полиакрилаты, ДДА, Квил А, полистиренсульфонат, модифицированый хитозан, Фикол С 400, полимеры молочной и гликолевой кислот, DEAE-декстран и сульфатдекстран, полиаминокислоты и т.д.). Однако присущие им недостатки (сложность производства, способность вызывать толерантность или временную иммуносупрессию, токсичность некоторых изомеров, низкая устойчивость к действию агрессивных сред ЖКТ) накладывают ограничения на их применение.

Целью изобретения является создание биодеградируемого, нетоксичного адъюванта, относящегося к новому поколению адъювантов, активизирующего образование соответствующих цитокинов, регулирующих функции лимфоцитов. При этом достигается решение нескольких проблем таких, как: получение высокого и специфического гуморального и клеточного ответов к возбудителям инфекционных заболеваний, против которых в настоящее время нет вакцин, а также к возбудителям или вакцинам, проявляющим слабое иммуногенное действие (например, синтетические пептидные вакцины); возможность вакцинации лиц, страдающих иммунологической недостаточностью, для которых вакцины обычного состава часто не эффективны; придать иммунному ответу желаемое направление - например, образование только Т×1 или Т×2.

Сущность изобретения заключается в том, что из водного экстракта проростков картофеля выделяется новое вещество - полисахарид глюкановой природы - адва, представляющий собой порошок, имеющий белую или беловато-сероватую окраску.

Заявленный глюкан "Адва" имеет мол.м. больше 20×10³ Да и меньше 300×10³ Да, содержит полисахаридную цепь, состоящую из остатков сахаров (мас.%): глюкозы - не более 85, арабинозы и галактозы - в следовых количествах, уроновых кислот - не более 15. Содержит преимущественно β-(1-4)-глюкозидные связи и практически не содержит α-связей. Адва плохо растворим в воде и нерастворим в органических растворителях таких, как эфир, хлороформ, ацетон, спирт, диметилсульфоксид и хорошо растворим в солевых растворителях со значениями рН ниже 6.

УФ-спектр адва имеет основной максимум в области 210-220 нм.

Раствор 1 мг адва в 1 мл деионизованной воды имеет рН 5-7.

Глюкан адва имеет структуру, отличную от структуры глюкана из Saccharomyces cerevisia, так как он характеризуется наличием β-(1-4)-глюкозидных связей, тогда как глюкан дрожжевых клеток - β-(1-3)-глюкозидных связей.

Детектирование моносахаридов, входящих в состав адва, было проведено с использованием метода газо-жидкостной хроматографии.

В стеклянную пробирку объемом 10-15 мл помещают точную навеску (около 2 мг) образца и приливают точный объем 2 мл 2М трифторуксусной кислоты с инозитом. Пробирку запаивают и нагревают при температуре 121°С в течение 2 часов в нагревательном шкафу. После охлаждения пробирку открывают, содержимое переливают в круглодонную колбу на 50-100 мл, добавляют 2 мл спирта этилового и упаривают на роторном испарителе при 40°С (операцию с добавлением 2 мл и упариванием спирта повторяют дважды).

К остаткам прибавляют 3 мл 1М раствора аммиака, содержащего 10 мг/мл боргидрида натрия. Смеси выдерживают при 40°С в течение 1 часа, после чего избыток боргидрида натрия превращают в борную кислоту, добавляя 1 мл уксусной кислоты. К полученной смеси прибавляют 2 мл смеси - метанол: уксусная кислота 9:1 (отношение объемов) и упаривают на роторном испарителе при 40°С. Операцию повторяют 3 раза. Затем добавляют 2 мл метанола, упаривают. Операцию повторяют 4 раза.

К полученным остаткам прибавляют 1 мл пиридина и 1 мл уксусного ангидрида. Колбы плотно закрывают пробками и нагревают в течение 1 часа при 100°С, затем охлаждают. Для удаления пиридина добавляют 2 мл воды очищенной и 1 мл толуола, упаривают на роторном испарителе. Операцию повторяют 3 раза. К сухим остаткам добавляют 3 мл воды и ацетаты экстрагируют хлороформом 3 раза по 2 мл. Органические вытяжки объединяют и упаривают до 0,5 мл. Этот раствор анализируют на ГЖХ.

ГЖХ выполняют на хроматографе Hewlett-Packard 5890A (США) с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой Ultra 2 (Crosstlinked 5% Ph Me Silicon 25 m × 0.2 mm × 0.33 μm film thickness) и интегратором НР-3393А (или на аналогичном оборудовании) в режиме программирования температуры от 175°С до 290°С со скоростью 10°/мин. Стандартные образцы нейтральных сахаров используют для идентификации сигналов на хроматограмме ГСО.

Количественное содержание (в %) каждого сахара в образце определяется по формуле:

К_сах=М_иноз×S_сах×100/М×S_иноз,

где М_иноз - масса инозита в образце, мг;

М - навеска исследуемого образца, мг;

S_cax - площадь пика данного сахара, полученная из хроматограммы;

S_иноз - площадь пика инозита, полученная из хроматограммы.

Для идентификации характера гликозидной связи в глюкане адва использовали β-(1-3)- и β-(1-4)-гликозилгидролазы и α-амилазу. Обработка ферментами показала, что глюкан адва содержит преимущественно β-(1-4)-глюкозидные связи и практически не содержит α-связей.

Предположительно именно это отличие сообщает новое свойство адва, которое проявляется в его адъювантной активности, и как следствие - получение высокого и специфического гуморального и клеточного ответов к возбудителям инфекционных заболеваний.

Возможность осуществления изобретения приведена на примере получения адва из проростков картофеля.

Клубни картофеля закладывали в темную комнату с влажной атмосферой при 37°С. Через 3-4 недели с проросших клубней собирали ростки. Промывали проточной водой и сушили на воздухе.

Чистые, сухие ростки картофеля измельчали электрической мясорубкой и полученный гомогенат заливали кипящей дистиллированной водой в соотношении 1:1 (w:w) при постоянном перемешивании. Затем клеточный дебрис удаляли отжимом, а водный экстракт центрифугировали при 4000 g в течение 20 мин, диализовали против дистиллированной воды при 4°С и высушивали лиофильно.

Навеску, полученную после высушивания, растворяли в минимальном объеме 0,01М цитратного буфера рН 6,6, наносили на колонку (2.7 см × 9.0 см) TSK-GEL DEAE-TOYOPEARL 650 М (TOYO SODA). Элюирование осуществляли 0,1 М цитратным буфером рН 6,6. Детектирование проводили при 220 нм.

Основной пик вещества собирали и высушивали на лиофильной сушке.

Было проведено изучение адъювантных свойств адва на двух моделях:

1. В модели in vitro по влиянию на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 была показана иммуномодулирующая активность. Определение содержания ИЛ-1 проводили с помощью ИЛ-1 чувствительной линии D10.G4.1, а содержание ИЛ-6 - с помощью ИЛ-6-зависимой гетерогибридомы D6C8. Активность ФНО в супернатантах определяли по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток мышиной фибросаркомы L-929. Было показано, что адва действует как стимулятор, когда продукция ИЛ-1 низкая, и как ингибитор в случае высокой его продукции. При внесении глюкана в культуру мононуклеарных клеток периферической крови человека была обнаружена статистически значимая стимуляция продукции ФНО, отличная от синтеза ФНО контрольными культурами. Глюкан адва стимулировал также продукцию ИЛ-6 мононуклеарами периферической крови. Цитокиновая сеть формирует систему инициирующих, амплифицирующих и супрессорных сигналов, что приводит к формированию и интеграции физиологических и патологических реакций организма на антигенное воздействие, микробную инвазию, воспаление, повреждение тканей, развитие опухолей, стресс и др. Под влиянием ряда факторов патогенности, в первую очередь токсинов инфекционного возбудителя, индуцируется синтез провоспалительных цитокинов. ИЛ-1 и ФНО-α опосредуют общие метаболические и гематологические сдвиги, наблюдаемые при развитии инфекционного процесса. ФНО является одним из ключевых цитокинов, регулирующих процесс воспаления. Патогенетическое значение повышения продукции ФНО показано для таких состояний, как септический шок, синдром полиорганной недостаточности, системная красная волчанка, сахарный диабет, ВИЧ-инфекция и др. Способность препарата влиять на продукцию цитокинов является важной характеристикой его иммуномодулирующей активности.

2. В модели in vivo по выявлению специфических антител к хантавирусу Сеул в сыворотках крови мышей после трехкратного внутримышечного и аэрозольного введения экспериментальной хантавирусной ДНК вакцины, приготовленной на основе вируса Сеул. Всего было исследовано 72 сыворотки крови от экспериментальных мышей, включая 57 сывороток после внутримышечного, 10 сывороток после аэрозольного введения хантавирусной ДНК вакцины и 5 контрольных сывороток после внутримышечного введения смеси липосом с адъювантом. Детекцию проводили непрямым иммуноферментным методом с сорбцией стандартного антигена на интактную твердую фазу. В качестве твердой фазы использовали полистирольные иммунопанели "Costar", в качестве антигена - рекомбинантный пептид хантавируса Сеул. Специфические IgM и IgG антитела к вирусу Сеул были выявлены только у мышей, которым вводили внутримышечно ДНК вакцину и в группе мышей с применением адъюванта. Причем применение адва приводило к повышению уровня иммунного ответа.

В токсикологических опытах было установлено, что глюкан адва не токсичен как при введении лабораторным животным в больших дозах - в 100 и 1000 раз превышающих терапевтическую дозу, так и при добавлении в культуру лимфоцитов in vitro.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности. Вещество, обладающее способностью активизировать образование соответствующих цитокинов, регулирующих функции лимфоцитов для получения высокого специфического гуморального и клеточного ответов к возбудителям инфекционных заболеваний, а также к слабоиммуногенным возбудителям и вакцинам, характеризующееся тем, что оно выделено из водного экстракта проростков картофеля, имеет определенную молекулярную массу и представляет собой полисахаридную цепь с преимущественнными β-(1-4)-глюкозидными связями, состоящую из остатков сахаров с определенным содержанием, при этом вещество нерастворимо в органических растворителях и хорошо растворимо в солевых растворителях со значениями рН ниже 6. Вышеописанное вещество эффективно активизирует образование соответствующих цитокинов, регулирующих функции лимфоцитов для получения высокого специфического гуморального и клеточного ответов к возбудителям инфекционных заболеваний, а также к слабоиммуногенным возбудителям и вакцинам.

Вещество, обладающее способностью активизировать образование соответствующих цитокинов, регулирующих функции лимфоцитов для получения высокого специфического гуморального и клеточного ответов к возбудителям инфекционных заболеваний, а также к слабоиммуногенным возбудителям и вакцинам, характеризующееся тем, что оно выделено из водного экстракта проростков картофеля, имеет молекулярную массу больше 20×10³ Да и меньше 300×10³ Да, и представляет собой полисахаридную цепь с преимущественнными β-(1-4)-глюкозидными связями, состоящую из остатков сахаров, мас.%: глюкозы не более 85, арабинозы и галактозы в следовых количествах, уроновых кислот не более 15, при этом вещество нерастворимо в органических растворителях и хорошо растворимо в солевых растворителях со значениями рН ниже 6.