ПОЛИСАХАРИД ГАММА-ПЛАНТ (γ-PL), ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОИНФЕКЦИОННЫМ ДЕЙСТВИЕМ И НЕ ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕММАГЛЮТИНИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1995 года по МПК C08B37/00 A61K31/73 

Изобретение относится к биологии и биотехнологии, в частности к новым высокомолекулярным соединениям, выделенным из растительных клеток, и может быть использовано в медицине и ветеринарии как компонент лекарственных веществ с противоинфекционными свойствами, а также в биологии и медицине для научно-исследовательских целей.

Известен дрожжевой глюкан, эффективный при вирусном гепатите, экспериментальной лепре, протозойных инфекциях и при искусственном заражении (1).

При использовании этого вещества наблюдается образование гранулем в печени и развитие аллергических заболеваний.

Известен полисахарид RON (2), выделенный из растительных клеток, содержащий глюкозу в качестве единственного углеводного структурного компонента. Полисахарид RON не проходит через диалитическую мембрану, нерастворим в спирте, ацетоне, гексане, бензоле, этилацетате, четыреххлористом углероде, хлороформе и эфире, растворим в воде, формамиде и диметилсульфоксиде. 1%-ный водный раствор RON имеет нейтральную реакцию. Элементный состав: 40,4-42,4% углерода, 5,8-6,4% водорода, 3,1-3,3% золього компонента. RON дает положительную цветную реакцию с антроном и серной кислотой, фенолом и серной кислотой, с хрометроповой и серной кислотами; отрицательные цветные реакции - биуретовая реакция, реакция Лоури-Фолина, Элсона-Моргана и реакция с иодом.

RON получают экстракцией рисовых высевок горячей водой, добавлением к экстракту полярного органического растворителя или высаливающего агента, отделением выделившегося осадка и его очисткой.

RON используют в качестве активного компонента с противоопухолевым, иммунным и бактерицидным действием.

Известный полисахарид RON не обладает антивирусной активностью, что ограничивает область его применения.

Целью изобретения является создание нового вещества, обладающего противоинфекционным действием и не обладающего гемагглютинирующей активностью.

Сущность изобретения заключается в том, что из делящихся растительных клеток, например, кукурузы, картофеля, гриба, выделено новое вещество - Полисахарид γ -PL (гамма-плант), представляющее собой порошок, имеющий различную окраску в зависимости от выбранного сырья - белый, сероватый, коричневатый, желтоватый.

γ -PL имеет мол. м. 2х10⁶±9х10⁵ Д и элементный состав, мас.%: азот 1,7-1,98; углерод 40,12-40,39; водород 5,81-6,07; остальное зольный компонент, содержит полисахаридную цепь, состоящую из (в мас.%): остатков нейтральных сахаров 35,0-41,0, глюкозы 27,0-33,0, галактуроновой кислоты 19,0-25,0, арабиназы 1,7-2,3, уроновых кислот 12,0-18,0 и не менее 0,5% белка, состоящего из остатков аминокислот в следующих количествах на 0,1 мг γ -PL (в нгр.): аспарагин 126,0-146,0, серин 139,0-159,0, глутамин 263,0-283,0, глицин 117,0-131,0, аланин 80,0-100,0, валин 76,0-96,0, лейцин 85,0-105,0, лизин 65,0-85,0, аргинин 42,0-62,0, в следовых количествах - цистеин, изолейцин, гистидин, фенилаланин, тирозин, треонин.

УФ-спектр γ -PL, имеет два основных максимума в областях 210 нм и 270 нм (размытый максимум в области 260-280 нм) , что подтверждает наличие в нем белка.

ИК-спекр (таблетка КВr) имеет характеристические максимумы: 3350, 2920, 1720, 1620, 1510, 1405, 1378, 1296, 1145, 1080, 1040, 920, 942, 763 см^-1, соответствующие следующим функциональным группам: О-Н; N-H; C-H; OH-X; N-H. ..X; C=0; амид; C-O-С; C-O.

γ -PL растворим в водных и солевых растворителях таких, как изотонический раствор натрия хлорида, физиологические среды и нерастворим в органических растворителях таких, как эфир, хлороформ, ацетон, спирт, диметилсульфоксид.

Раствор 1 мг γ -PL в 1 мл деионизованной воды имеет pH 5,22. Коэффициент преломления раствора γ -PL с концентрацией 2 мг/мл составляет 1,334±0,005.

γ -PL имеет элементный состав отличный от состава RON так как он помимо углерода и водорода содержит азот и характеризуется наличием белка в его структурной организации.

Аминокислотный анализ белка, входящего в состав гамма-плант, проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе фирмы Hitachi. Этот метод включает две основные стадии: гидролиз белка до аминокислот и количественное определение продуктов гидролиза. Полный гидролиз белка проводили при кипячении гамма-плант (1 мг) C6N, HCl (1 мл) в запаяной ампуле при температуре 110^оС в течение 48 ч. Предварительно из ампулы откачивали воздух. В этих условиях пептидные связи гидролизуют с количественным выходом и в результате гидролиза обрауются гидрохлориды аминокислот. После полного гидролиза белка производилось количественное определение каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате.

В основе метода разделения смеси аминокислот до индивидуальных аминокислот лежит метод ионообменной хроматографии. Индивидуальные аминокислоты элюируются с колонки и собираются автоматическим коллектором в виде отдельных фракций. Затем они количественно определяются путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии ингидрина.

Элюция, сбор фракций, анализ каждой фракции и регистрация данных выполнялись автоматически. Положение пика, отвечающего каждой из аминокислот на хроматограмме, строго фиксированно временем выхода соответствующей аминокислоты. Так, например, время выхода глутамина - 19,38±04 мин.

Количественное содержание каждой аминокислоты определялось площадью соответствующего пика на хроматограмме.

Предположительно именно эти отличия сообщают новые свойства - антивирусную и антибактериальную активности.

Кроме того, установлено, что γ -PL вызывает деление лимфоцитов и кератиноцитов, что позволяет использовать его для исследования биологии клеток, как митоген.

Возможность осуществления изобретения приведена на примере получения из делящихся клеток кукурузы.

Семена кукурузы приращивают. Отделяют чистые кукурузные проростки и измельчают их в буфере дезоксихолат натрия - фосфат 0,1М pH 8,0. Смесь подогревают до 60^оС и при комнатной температуре охлаждают. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 400 об/мин в течение 20 мин. Проводят повторное экстрагирование осадка кипящей водой в интервале температур 80-100^оС в течение 30 мин. Осадок отделяют центрфугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Оба супернатанта смешивают, смесь подщелачивают до pH 9,0 и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин, затем в полученный супернатант добавляют азид натрия до 0,025%.

Далее проводят диализ полученного вещества с последующим разделением диализата по молекулярным массам любым известным методом, например, ультрафильтрацией. Из полученных фракций выделяют и концентрируют высокомолекулярную фракцию. Это фракцию очищают от примесей известным методом, например, жидкостной хроматографией высокого давления до получения вещества мол. м. 2х10⁶±9х10⁵ Д. Из 1 кг проростков получают 5-10 мг γ -PL.

Режимы приемов описанного способа могут быть откорректированы в соответствии с видом выбранного сырья.

Изучение действия γ -PL в качестве противоинфекционного вещества проводили на животных - лабораторных (мыши, собаки) и промышленных (овцы, свиньи, олени, крупный рогатый скот, птица) при лечении таких инфекционных заболеваний как западный энцефалит лошадей, герпетический менингоэнцефалит, сальмонеллез, легочная инфекция, чума плотоядных, парвовирусный энтерит, инфекцонный гепатит. Для чего порошок γ -PL растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия с концентрацией 1 мг в 10 мл и вводили животным подкожно или внутривенно, однократно или многократно. В таблице представлены данные опытов по изучению антибактериальных и антивирусных свойств γ -PL, подтвержденные приложенными к описанию актами клинических испытаний.

Результаты опытов показывают, что защитный эффект при профилактике и лечении инфекционных заболеваний составляет 60-100%, что значительно превышает защитные эффекты используемых в настоящее время в медицинской практике препаратов. Так, в случае герпетического менингоэнцефалита при использовании дозы вируса 10ЛД(50) защитный эффект γ -PL равен 60%, что в 3 раза превышает защитный эффект употребляемого известного препарата Ара-А, составляющий 20%, а также значительно выше этого показателя при использовании фосфоpноуксусной кислоты с защитным эффектом 33% и ациклогуанезина с защитным эффектом 25%.

На основании данных опытов установлено, что при лечении таких болезней, как парвовирусный энтерит, чума плотоядных, инфекционный гепатит γ -PL воздействует непосредственно на возбудителей этих болезней, в результате чего защитный эффект составил 100%. До настоящего времени неизвестны препараты с аналогичным специфическим терапевтическим действием и лечение этих заболеваний осуществляется симптоматически, т.е. применяют комплекс препаратов подобранных в соответствии с обнаруженными клиническими отклонениями, сопровождающими ту ли иную болезнь.

При опытах было установлено, что вещество γ -PL не токсично как при введении животным (мыши, собаки) в больших дозах (в 100 и 1000 раз превышающих терапевтическую дозу), так и при добавлении в культуру кератиноцитов и лимфоцитов in vitro в дозах, превышающих 1-2 мг/мл. Вещество γ -PL вводилось и беременным собакам, при этом никаких отрицательных последствий не выявлено. Наблюдение за такими животными велось в течение 5 лет.

γ -PL был исследован на митогенный эффект в культуре лимфоцитов in vitro в стандартной системе Mischell R.J., Putton R.W. (см. журнал J.Exp.Med, 1967, v.126, p.423-432). Действие γ -PL на лимфоциты обнаруживают по образующимся бластным клеткам, которые подсчитывают визуально. Производительность γ -PL сравнима с действием известного митогена-Конканавалина А. В связи с митогенными свойствами γ -PL, следует отметить, что гемагглютинирующая активность у вещества γ -PL отсутствует. Последнее свойство γ -PL было показано при непосредственном контакте γ -PL с различными эритроцитами в солевом растворе.

В результате этих опытов установлено, что γ -PL вызывает деление клеток, что дает возможность использовать его для исследования биологи клеток.

Использование: изобретение относится к биологии и биотехнологии и, в частности к высокомолекулярным соединениям, полученным из растительных клеток и обладающим противоинфекционными свойствами, и может быть использовано в медицине, ветеринарии как активный компонент лекарственных веществ. Полисахарид гамма-плант (γ -PL), выделенный из делящихся растительных клеток имеет мол.м. 2·10⁶-9·10⁵Д и элементный состав мас.%: азот 1,7 - 1,97; углерод 40,12 - 40,39; водород 5,81 - 6,07, остальное зольный компонент, содержащий полисахаридную цепь, состоящую из(в мас.%) остатков нейтральных сахаров (35,0 - 41,0), глюкозы (27,0 - 33,0), галактуроновой кислоты (19,0 - 25,0), арабинозы (1,7 - 2,3), уроновых кислот (12,0 - 18,0) и не менее (0,5%) белка, состоящего из остатков аминокислот в следующих количествах на 0,1 мг γ -PL /Hгр/ = аспарагина 126,0 - 146,0, серина 139,0 - 159,0 глутамина 263,0 - 283,0, глицина 117,0 - 131,0 аланина 80,0 - 100,0, валина 76,0 - 96,0, лейцина 85,0 - 105,0, лизина 65,0 - 85,0, аргинина 42,0 - 62,0 в следовых количеств: цистеин, изолейцин, гистидин, фенилаланин, пирозин, треозин и характеризуется следующим максимума ИК-спектра: (таблетка) КВr - 3350, 2920, 1720, 1620, 1510, 1405, 1378, 1296, 1145, 1080, 1040, 920, 842, 763 cм^-1 при этом гамма-плант нерастворим в органических растворителях и растворим в водных и солевых растворителях, обладающих противоинфекционным действием и не обладающего геммагглютинирующей активностью. 1 табл.

ПОЛИСАХАРИД ГАММА-ПЛАНТ (γ-PL), ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОИНФЕКЦИОННЫМ ДЕЙСТВИЕМ И НЕ ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕММАГЛЮТИНИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ.

Полисахарид гамма-плант (γ-PL), выделенный из делящихся растительных клеток с мол.м. 2 · 10⁶ - 9 · 10⁵ и элементным составом, мас.%: азот 1,7 - 1,98, углерод 40,12 - 40,39, водород 5,81 - 6,07, остальное - зольный компонент, содержит полисахаридную цепь, состоящую из (мас.%) остатков нейтральных сахаров 35,0 - 41,0, глюкозы 27,0 - 33,0, галактуроновой кислоты 19,0 - 25,0, арабинозы 1,7 - 2,3, урановых кислот 12,0 - 18,0 и не менее 0,5% белка, состоящего из остатков аминокислот в следующих количествах на 0,1 мг γ-PL(нгр): аспарагина 126,0 - 146,0, серина 139,0 - 159,0, глутамина 263,0 - 283,0, глицина 117,0 - 131,0, аланина 80,0 - 100,0, валина 76,0 - 96,0, лейцина 85,0 - 105,0, лизина 65,0 - 85,0, аргинина 42,0 - 62,0, в следовых количествах - цистеин, изолейцин, гистидин, фенилаланин, тирозин, треонин и характеризуется следующими максимумами ИК-спектра (таблетка КВч) 3350, 2920, 1720, 1620, 1510, 1405, 1378, 1296, 1145, 1080, 1040, 920, 842, 763 см^-1, при этом γ-PL нерастворим в органических растворителях и растворим в водных и солевых растворителях, обладающий противоинфекционным действием и не обладающий геммаглютинирующей активностью.