КОМПЛЕКСЫ МЕДИ (II) И НИКЕЛЯ (II) С 1-(БЕТА-ОКСИЭТИЛ)-2-МЕТИЛ-5-НИТРОИМИДАЗОЛОМ Российский патент 1997 года по МПК C07F1/08 C07F15/04 

Изобретение относится к новым производным метронидазола (1-(β -оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола), обладающим антибактериальным, противотрихомонадным и иммуностимулирующим действием и могущим найти применение в медицине.

Известно, что метронидазол (1-(b -оксиэтил)-2-метил-5- нитроимидазол) обладает антибактериальной, противотрихомонадной и иммуностимулирующей активностью. В то же время показано, что комплексообразование с металлами усиливает антибактериальную активность по сравнению с исходным лигандом [1]
Недостатком метронидазола являются плохая растворимость в воде, низкая антимикробная активность в отношении аэробов, способность нарушать металло-лигандный гомеостаз [2,3]
Задачей изобретения является расширение спектра действия, усиление иммунного ответа и нормализация металло-лигандного гомеостаза.

Поставленная задача достигается комплексами 1-(b-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола с солями меди (II) и никеля (II).

где Ме медь (II) или никель (II).

Способ получения заявляемых соединений основан на реакции взаимодействия 1-(β-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола с солями меди (II) и никеля (II) в среде спирта.

Нижеследующие примеры иллюстрируют получение целевых продуктов и их антимикробную активность.

Пример 1. Получение комплексного соединения 1-(b-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола с меди (II) сульфатом пентагидратом.

0,120 г (0,0007 моль) метронидазола растворяют в 10 мл спирта. К полученному раствору лиганда добавляют 0,058 г (0,0002 моль) меди (II) сульфата пентагидрата (CuSO₄•5H₂O). Смесь помещают на магнитную мешалку на 30 мин до выделения осадка. Образовавшийся голубой осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают спиртом в 3-4 раза порциями по 15-20 мл, сушат на воздухе при комнатной температуре и хранят в эксикаторе над СаСl₂ или MgSO₄.

Получаем комплекс 1-(b-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола с меди (II) сульфатом.

Выход 82,50% 0,099 г.

Брутто-формула С₁₂Н₂₂N₆OCuS
Молекулярная масса 521,95.

Формула целевого продукта Cu(MN)₂•2H₂O•SO₄, где MN 1-(b-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазол.

Полученный комплекс представляет собой осадок голубого цвета. Растворимость: растворим в воде, 30%-ном этаноле, не растворим в хлороформе, ацетоне, ДМСО, ДМФА, четыреххлористом углероде, ацетонитриле.

Данные элементного анализа приведены в табл.1.

Определение содержания металла в комплексе проводили титриметрическим, фотометрическим методами, ААS и АЭС с ИСП.

Пример 2. Определение меди в комплексе титриметрическим методом.

Навеску комплекса (m 0,3510 г) подвергали мокрому озолению смесью азотной и серной концентрированных кислот до влажных солей, затем полученный остаток растворяли в 50 мл дистиллированной воды.

Аликвотную долю раствора (10 мл) подщелачивали до слабосинего окрашивания 10%-ным раствором аммиака. Титрование проводили 0,02 моль/л раствором ЭДТА с индикатором мурексидом до перехода окраски от желтой к фиолетовой.

Пример 3. Определение меди в комплексе фотометрическим методом.

Определение основано на реакции взаимодействия меди с 10% раствором аммиака с образованием аммиаката меди синего цвета.

Навеску комплексного соединения (m 0,0632) растворяли в дистиллированной воде. К аликвотной доле (5 мл) добавляли 5 мл 10%-ного раствора аммиака и 10 мл воды дистиллированной. Определение оптической плотности проводили на ФЭК при длине волны λ = 590 нм в кюветах с 1 2 см. Содержание меди находили по калибровочному графику.

Пример 4. Определение содержания меди методом атомноабсорбционной спектроскопии.

Определение проводили на приборе "Палкер Элмер" модель 5000 с использованием смеси воздуха и природного газа. Анализ проводили после разрушения навески царской водкой. Содержание меди определяли по калибровочному графику.

Пример 5. Определение содержания меди методом атомноэмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой.

Определение проводили на спектрометре ICAP 9000 фирмы "Термо Джарелл Аш" (США). Содержание меди определяли по калибровочному графику.

Навеску комплекса озоляли концентрированной азотной кислотой до влажных солей и полученный остаток в 2%-ной азотной кислотой.

Результаты определения меди в комплексе различными методами представлены в табл.2.

Пример 6. Определение сульфат-иона в комплексе фотометрическим методом.

Метод основан на фотометрическом измерении интенсивности помутнения раствора комплекса в присутствии солей бария. Для стабилизации полученной суспензии ВаSO₄ в реакционную смесь вводят гликоль.

Навеску комплекса (m 0,0172 г) подвергали озолению смесью соляной и азотной концентрированных кислот. Минерализат переносили в колбу и доводили объем водой до 50 мл. К аликвотной доле (10 мл) раствора прибавляли 5 мл суспензии, содержащей хлорид бария, этиленгликоль и этанол.

Оптическую плотность определяли на ФЭК при длине волны λ 315 нм в кюветах с 1 0,5 см. Содержание сульфат-иона находили по калибровочному графику.

(Вычисленное содержание сульфат-иона 18,40%).

Пример 7. Определение содержания метронидазола в составе комплекса фотометрическим методом.

Определение метронидазола основано на реакции образования основания Шиффа с п-диметиламинобензальдегидом, окрашенного в красный цвет. Определение содержания метронидазола проводят по калибровочному графику.

Навеску комплекса (m 0,0608 г) растворяют в 8М соляной кислоте. К аликвотной доле полученного раствора добавляют 20 мг цинковой пыли, 5,0 мл 0,5% -ного раствора п-диметиламинобензальдегида в 0,5%-ной соляной кислоте, 5,0 мл спирта для стабилизации и объем реакционной смеси доводят 8М соляной кислотой до 11 мл. Определение проводили на ФЭК при длине волны λ 490 нм в кюветах 1 1 см.

(Вычисленное значение содержания метронидазола 65,58%).

Пример 8. Подтверждение строения комплекса данными ИК и УФ спектроскопии.

ИК спектр регистрировали на спектрофотометре "Shimadzu" модель 200-19527 в области от 400 до 4000 см^-1. При определении использовали методику растирания образца в вазелиновом масле. В ИК спектре комплексного соединения по сравнению с ИК спектром лиганда наблюдаются полосы кристаллизационной воды при 3450 и 1740 см^-1; дублет при 1558 и 1550 см^-1 свидетельствует об изменении валентных колебаний имидазольного кольца, а полосы при 1080, 1040 и 1120 см^-1 указывают на ассиметричные валентные колебания сульфогруппы.

Кислород спиртовой группы метронидазола участия в комплексообразовании не принимает, так как полоса 3200 см^-1 присутствует в спектрах комплекса и лиганда.

Таким образом, изменение валентных колебаний имидазольного кольца в области 1500-1700 см^-1 на 5-20 см^-1 свидетельствует о комплексообразовании по атому азота в положении 3 с вовлечением в координационную сферу воды.

Электронные спектры комплекса регистрировали на приборе "Unicam SP-800". В анализе использовали водные растворы комплекса и метронидазола, раствором сравнения служила дистиллированная вода. Комплексное соединение так же, как метронидазол имеет в спектре полосу с λ_max=320 нм. При добавлении кислоты максимум поглощения смещается до 277 нм, оптическая плотность снижается по сравнению с первоначальным раствором. Добавление щелочи вызывает увеличение оптической плотности комплекса. При хранении водных растворов в течение 5 сут характер спектров и величина оптической плотности не изменялись. Коэффициент молярного погашения комплекса составляет 1500; для метронидазола этот коэффициент составляет 9133.

Пример 9. Изучение антимикробной активности комплекса in vitro.

Изучение антимикробной активности комплекса проводили in vitro в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи Х1 издания (ГФ Х1) методом диффузии в питательный агар (ГФ Х1, вып.2, с.210).

В опыте использовали эталонные штаммы: Escherichia coli штамм АТСС 25922; Staphylococcus aureus штамм АТСС 6538Р; Pseudomonas aeruginosa штамм АТСС 9027; Candida albicans штамм АТСС 885-653; Bacillus subtilis штамм АТСС 6633; Bacteroides fragilis штамм АТСС 2585; Bacteroides aniformis штамм АТСС 8492.

Изучение антимикробной активности препаратов проводили в интервале концентраций от 32,0 до 0,003 мг/мл, в качестве исходных были взяты равные концентрации 32,0 мг/мл. В качестве контроля выбран метронидазол.

Измерение зон задержки роста проводили с помощью специальной линейки с ценой деления 0,5 мм. Результаты изучения антимикробной активности представлены в табл. 3 8.

На Candida albicans комплекс в изученных концентрациях влияния не оказывал.

Пример 10. Изучение противотрихомонадной активности комплекса.

Исследование чувствительности влагалищных трихомонад к воздействию комплекса проводили методом серийных разведений (ГФ Х1, вып.2, с.191). Тест-штаммом служил клинический изолят, выделенный от пациентки, длительное время страдающей от трихомониаза.

Изучение противотрихомонадной активности комплекса проводили в интервале от 0,5 до 0,05 мг/мл, в качестве исходных были взяты равные концентрации 0,5 мг/мл. В качестве контроля был использован метронидазол.

Результаты исследования приведены в табл.9.

Условные обозначения:
+ трихомонады подвижны;
трихомонады неподвижны.

По противотрихомонадной активности комплекс не уступает метронидазол. В отношении E. coli, S. aureus, P.aeruginosa, Bac.subtilis, Bacter.fragilis, Bacter.aniformis антимикробная активность комплекса выше, чем у метронидазола.

Пример 11. Изучение острой токсичности комплексного соединения.

Изучение острой токсичности проведено на 120 мышах BALB/C (самцы, масса тела 18-22 г) и 120 крысах линии Wistar (самцы, масса тела 180-210 г) при внутрижелудочном введении. Животным вводили 2-4%-ные подогретые свежеприготовленные водные растворы. Определение ЛД₁₆, ЛД₅₀, ЛД₈₄ проведено с использованием пробит-анализа Литчфилда и Уилкоксона. Результаты исследований приведены в табл. 10.

По классификации, принятой ВОЗ, полученное соединение относится к классу малотоксичных веществ.

Пример 12. Изучение влияния комплекса на металло-лигандный гомеостаз.

Изучение влияния комплекса на металло-лигандный гомеостаз проведено на 35 крысах линии Wistar (самцы, масса тела 180-200 г) на модели полнослойной кожной раны. Комплекс наносили на рану в виде 0,5%-ной мази на ПЭО. Определение уровня микроэлементов проводили в крови на 2 и на 5 сут эксперимента в крови методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой на приборе "Labtest UV-25" (Австралия). В качестве контрольной была выбрана группа животных, не получавших лечение. Средние значения содержания микроэлементов приведены в табл.11.

Для оценки степени изменения микроэлементов в крови были расчитаны коэффициенты соотношений между металлами. Примеры изменения этих соотношений приведены на диаграммах 1-3, приведенных на фиг. 1-3, из которых видно, что при использовании комплекса соотношения Fe/Zn, Fe/Cu и Zn/Cu при лечении раны нормализуются быстрее, чем в контроле. Таким образом, комплексное соединение способствует восстановлению металлолигандного гомеостаза.

Пример 13. Получение комплексного соединения 1-(β- оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола с никеля (II) сульфатом гептагидратом.

В круглодонную колбу с обратным холодильником помещают 10 мл спирта, 0,120 г (0,0007 моль) метронидазола и 0,066 г (0,0002 моль) никеля (II) сульфата гептагидрата NiSO₄•7H₂O. Колбу помещают на 30 мин на магнитную мешалку с подогревом до выделения осадка светло-зеленого цвета. Образовавшийся осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 3-4 раза спиртом порциями по 15-20 мл, сушат на воздухе при комнатной температуре и хранят в эксикаторе над СаСl₂ или МgSO₄.

Получен комплекс 1-(b-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола с никеля (II) сульфатом. Выход 59% 0,0708 г Брутто-формула С₁₂Н₂₀N₆O₁₁SNi Молекулярная масса 515,087 Формула целевого продукта Ni(MN)₂•H₂O•SO₄, где MN - 1-(b-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазол.

Полученный комплекс представляет собой осадок светлозеленого цвета. Растворимость: растворим в воде, 30%-ном этаноле, не растворим в хлороформе, ацетоне, ДМСО, ДМФА, четыреххлористом углероде.

Данные элементного анализа представлены в табл.12.

Определение содержания металла в комплексе проводили титриметрическим, фотометрическим методами и АЭС с ИСП.

Пример 14. Определение никеля в комплексе титриметрическим методом.

Навеску комплекса (m 0,2484 г) подвергали мокрому озолению смесью азотной и серной концентрированных кислот до влажных солей. Затем полученный остаток растворяли в 50 мл дистиллированной воды. Аликвотную долю полученного раствора (10 мл) подщелачивали 10%-ным раствором аммиака и титровали 0,01 моль/л раствором ЭДТА с индикатором мурексидом до перехода окраски от желтой к фиолетовой.

590 нм
Пример 15. Определение содержания никеля в комплексе фотометрическим методом.

Определение основано на реакции взаимодействия между никелем и 10% раствором аммиака с образованием аммиаката никеля голубого цвета.

Навеску комплексного соединения (m 0,2588 г) растворяли в 25 мл дистиллированной воды. К аликвотной доле раствора (10 мл) добавляли 5 ил 10%-ного раствора аммиака и 10 мл воды дистиллированной. Определение оптической плотности проводили на ФЭК при длине волны λ в кюветах с 1 2 см. Содержание никеля находили по калибровочному графику.

Пример 16. Определение содержания никеля в комплексе методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой.

Определение проводили на спектрометре ICAP 9000 фирмы "Термо Джарел АШ" (США). Содержание никеля находили по калибровочному графику.

Навеску комплекса (m 0,0508 г) подвергали озолению концентрированной азотной кислотой до влажных солей, остаток растворяли в 2%-ной азотной кислоте.

Результаты определения никеля различными методами представлены в табл. 13.

Пример 17. Определение сульфат-иона в комплексе.

Определение основано на фотометрическом определении интенсивности помутнения раствора комплекса в присутствии солей бария.

Навеску комплекса (m 0,0134 г) подвергали озолению смесью концентрированных соляной и азотной кислот до влажных солей. Минерализат переносили в колбу и объем доводили водой дистиллированной до 25 мл. К аликвотной доле раствора (5 мл) добавляли 5 мл суспензии, содержащей хлорид бария, этиленгликоль и этанол.

Оптическую плотность определяли на ФЭК при длине волны λ 315 нм в кюветах с 1 0,5 см. Содержание сульфат-иона проводили по калибровочному графику.

(Вычисленное значение содержания сульфат-иона 18,65%).

Пример 18. Определение метронидазола в составе комплекса фотометрическим методом.

Определение проводят по реакции взаимодействия между метронидазолом и п-диметиламинобензальдегидом с образованием основания Шиффа, окрашенного в красный цвет. Определение содержания метронидазол проводят по калибровочному графику.

Навеску комплекса (m 0,0600) растворяют в 25 мл 8М соляной кислоты. К аликвотной доле раствор добавляли 20 мг цинковой пыли; 5,0 мл 0,5%-ного раствора п-диметиламинобензальдегида в 0,5%-ной соляной кислоты; 5,0 мл спирта для стабилизации и объем реакционной смеси доводят 8М соляной кислотой до 11 мл. Определение содержания метронидазол проводят на ФЭК при длине волны λ 490 нм в кюветах с 1=10 мм. (Вычисленное значение содержания метронидазола - 66,46%).

Пример 19. Подтверждение строения комплекса данными ИК и УФ спектроскопии.

ИК спектр комплекса регистрировали на спектрофотометре "Shimadzu" модель 200-19527 в области от 400 до 4000 см^-1. При определении использовали методику растирания образца в вазелиновом масле. Появляющаяся в ИК спектре комплекса полоса при 1556 см свидетельствует об изменении валентных колебаний имидазольного кольца, полосы при 630 см^-1 указывают на ассиметричные деформационные, а при 1120, 1080, 1060 см^-1 на ассиметричные валентные колебания сульфогруппы. Кислород спиртовой группы метронидазола участия в комплексообразовании не принимает, так как полоса 3200 см^-1 присутствует в спектре комплекса.

Таким образом, изменение валентных колебаний имидазольного кольца в области 1500-1700 см^-1 на 5-20 см^-1 свидетельствует о комплексообразовании по атому азота в положении 3 имидазольного кольца.

УФ спектры комплекса регистрировали на приборе "Unicam SP-800", использовали водные растворы, анализ проводили в кюветах 1 10 см. В качестве раствора сравнения использовали дистиллированную воду. Комплекс, так же, как и метронидазол, имеет полосу с λ_max 320 нм. При добавлении кислоты максимум поглощения сдвигается до 277 нм и оптическая плотность снижается. Добавление щелочи не влияет на спектр комплекса. При хранении водных растворов в течение 5 сут характер спектра и величина оптической плотности не изменялись. Коэффициент молярного погашения для комплекса равен 18899, для метронидазола 9133.

Пример 20. Определение антимикробной активности комплекса метронидазола с никеля (II) сульфатом.

Изучение антимикробной активности проводили in vitro в соответствии с требованиями ГФ Х1 методом диффузии в питательный агар (ГФ Х1, вып.2, с. 210).

В опыте использовали эталонные штаммы: Escherichia coli штамм АТСС 25922; Staphylococcus aureus штамм АТСС 6538Р; Pseudomonas aeruginosa штамм NCTC 2134; Bacillus subtilis штамм АТСС 6633; Bacteroides fragilis штамм АТСС 25285; Bacteroides aniformis штамм АТСС 8492; Candida albicans штамм АТСС 885-653.

Изучение антимикробной активности проводили в интервале концентраций от 32,0 до 0,06 мг/мл. В качестве исходных взяты равные концентрации 32,0 мг/мл. В качестве контроля был выбран метронидазол.

Измерение зон задержки роста проводили с помощью специальной линейки с ценой деления 0,5 мм. Результаты изучения антимикробной активности комплекса представлены в табл.14-20.

Полученные данные свидетельствуют об усилении антимикробной активности комплекса по сравнению с метронидазолом. Кроме того, комплекс обладает фунгицидной активностью.

Пример 21. Изучение острой токсичности комплексного соединения.

Изучение острой токсичности проведено на 120 мышах ВАLВ/С (самцы, масса тела 18-22 г) и 120 крысах линии Wistar (самцы, масса тела 180-210 г) при внутрижелудочном введении. Животным вводили 2-4%-ные подогретые свежеприготовленные водные растворы. Определение ЛД₁₆, ЛД₅₀, ЛД₈₄ проведено с использованием пробит-анализа Литчфилда и Уилкоксона. Результаты приведены в табл. 21.

По классификации, принятой ВОЗ, полученное соединение относится к классу малотоксичных веществ.

Изобретение относится к новым производным (1-(β-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазола) обладающим антибактериальной, противотрихомонадной, фунгицидной и иммуностимулирующей активностью. Комплексные соединения способны восстанавливать металлолигандный гомеостаз. Задачей изобретения является расширение спектра действия, усиление иммунного ответа. Заявляемые комплексные соединения 1-(β-оксиэтил)-2-метил-5- нитроимидазола с солями меди (II) и никеля (II) обладают более выраженной активностью в отношении E.coli, S.aureus, P.aeruginosa, C.albicans, Bac.subtilis, Bacter. fragilis, Bacter. aniformis, чем метронидазол, способны восстанавливать металло-лигандный гомеостаз. 21 табл., 3 ил.

Комплексы меди (II) и никеля (II) с 1-(бета-оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазолом формулы

где Ме медь (II) или никель (II).