СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПРИНА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, точнее к гигиене, и может быть использовано при оценке загрязнения воздушного бассейна продуктами микробиологического производства.

Развитие крупнотоннажного производства биомасс кормового назначения поставило проблему защиты окружающей среды от загрязнения продуктами микробиологического синтеза. Поскольку микроорганизмы и получаемые на их основе продукты могут оказывать аллергизирующее, иммуномодулирующее и иное действие на микроорганизм, возникает необходимость санитарно-гигиенического нормирования специфического загрязнения предприятиями данной отрасли. Как известно, гигиеническое нормирование невозможно без специфических методов контроля за уровнем загрязнения воздушного бассейна.

В настоящее время в качестве методов контроля используются следующие микробиологические методы, позволяющие идентифицировать только живые клетки, являющиеся продуцентами кормовой биомассы;
методы определения общего белка в воздухе, основанные на химических реакциях, которые являются неспецифичными и недостаточно чувствительными (метод Лоури - 0,05 мг/м);
иммунохимические методы, основанные на специфической индикации антигенноактивных компонентов готового продукта.

Разработка таких методов особенно актуальна для предприятий, выпускающих различные виды продукции (паприн, гаприн). Так для определения специфического белка паприна - продукта, получаемого путем утилизации н-парафинов нефти дрожжеподобными грибами рода Candida, используется иммуноглобулиновый эритpоцитарный диагностикум в реакции непрямой гемагглютинации.

В 1974 г. начато освоение производства нового продукта - гаприна на основе метанотрофных микроорганизмов.

Для опытно-промышленного производства гаприна рекомендован штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874, селекционированный во "ВНИИсинтезбелок" в 1980 г. После введения в эксплуатацию опытно-промышленной установки (ОПУ) на Светлоярском заводе БВК (1983 г. ) мощностью 10 тыс. т в год гаприна, возникла необходимость в обосновании предельно-допустимой концентрации (ПДК) на этот продукт и соответственно в методе контроля за уровнем загрязненности производственной и внешней среды. В 1991 г. утверждена ПДК для пыли гаприна в рабочей зоне на уровне 0,02 мг/м³ и в атмосферном воздухе 0,0002 мг/м³. Эти нормативы определяют требования к чувствительности метода контроля.

Цель изобретения - специфическая индикация гаприна в атмосферном воздухе.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемый образец раститровывают, а в полученный ряд разведений последовательно добавляют иммунную сыворотку, полученную при иммунизации кроликов биомассой штамма-продуцента, выращенного в стерильных условиях, и диагностикум на основе термостабильного антигена гаприна.

Способ осуществляется следующим образом. Аспирационным методом отбирают пробу воздуха на фильтр или в жидкий поглотитель. Объем отбираемого воздуха определяют степенью его загрязненности (точки забора на выбросе или в селитебной зоне). Полученный образец, переведенный в раствор, прогревают в течение 15 мин при 100^оС. Раститровывают в серологической панели в лунки которой предварительно вносят по 25 мкл 1% -ной нормальной кроличьей сыворотки (НКС). Подбирают заборную дозу иммунной сыворотки, предварительно оттитровав ее в реакции пассивной гемаггютинации (РПГА) с диагностикумом к гаприну. Устанавливают титр сыворотки. Рабочим считают разведение, соответствующее разведению в лунке, в два раза меньшему титра (2 гемагглютинирующие единицы - ГАЕ). В ряд разведений пробы вносят иммунную сыворотку в объеме 25 мкл, разведенной до 2 ГАЕ, а затем 25 мкл диагностикума. Учет реакции производят через 3 ч после оседания диагностикума. В тех разведениях, где произошла нейтрализация искомым антигеном антител, взятых в стандартной дозировке, наблюдают отсутствие агглютинации. По максимальному разведению пробы, где произошла нейтрализация, устанавливают концентрацию искомого продукта. Для количественной оценки гаприна в пробе тест-систему оттитровывают по референс-антигену с известным содержанием специфического белка.

Получение иммунной сыворотки. Иммунную кроличью сыворотку получают путем иммунизации кроликов суспензией лиофилизированной биомассы штамма ВСБ-874 с концентрацией 20 мг (по сухой массе) в 1 мл 0,9% -ного раствора хлорида натрия.

Биомассу штамма-продуцента гаприна получают путем выращивания культуры ВСБ-374 на минеральной среде в атмосфере метан-воздух (1: 1) в условиях стерильного непрерывного культивирования на ферментационной установке с последующей ее лиофилизацией.

Иммунизацию кроликов проводят по следующей схеме: на 1-й и 14-й день суспензию вводят подкожно в область пахового лимфоузла в объеме по 1,5 мл и 2,0 мл соответственно, на 22-й и 33-й день от начала иммунизации с интервалом 30 дн между ними. Через 7 дн после последней инъекции берут кровь для получения сыворотки и определения в ней титра антител в реакции пассивной гемаглютинации. При достаточно высоких титрах (1: 16000)-(1: 32000) - сывороток кроликов обескровливают.

Специфичность иммунных сывороток определяют в опытах с разными культурами метанотрофов и микроорганизмов из рода Paracoccus в непрямой иммунофлуоресценции. Иммунная сыворотка к клеткам штамма ВСБ-874 не дает специфического свечения с другими видами метанотрофов (Methylococcus thermophylus 111-6, Methylomonas methanica 12, Methylosinus sporum МЧ-4, Methylosinus curvatus GB-25) и с микроорганизмами из рода Paracoccus, которые являются гетеротрофными контаминантами промышленных ферментеров и имеют морфологическое сходство со штаммом - продуцентом гаприна.

Эритроцитарный антигенный диагностикум готовится следующим образом. 20% -ные Формалинизированные эритроциты барана отмывают 3 раза в фосфатно-солевом растворе хлорида натрия (ФСБ) рН 7,2 и готовят 2,5% -ную взвесь эритроцитов в том же растворе.

Танизация эритроцитов. 2,5% -ную взвесь эритроцитов смешивают с равным объемом раствора танита в оптимальной рабочей концентрации, подобранной в предварительном опыте (например 1: 20000). Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 37^оС в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Затем смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов трижды отмывают ФСБ (рН 6,4). Конечный осадок ресуспендируют в ФСБ (рН 6,4), содержащего 0,5% формалина, до 2,5% -ной концентрации танизированных эритроцитов.

Сенсибилизация танизированных эритроцитов. В качестве сенситина используют антиген из гаприна, который готовят следующим образом, К навеске гаприна добавляют 0,2% -ный раствор тритона Х-100 до конечной концентрации 10 мг/мл по сухой массе, выдерживают 15 мин в кипящей бане, затем на магнитной мешалке в течение 20 мин при комнатной температуре. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин и охлаждают на льду. Затем к экстракту добавляют при перемешивании 3-кратный объем охлажденного этилового спирта. Смесь выдерживают в холодильнике в течение 2 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс. об/мин и ресуспендируют в ФСБ, рН 7,2 (1/10 от исходного объема суспензии). Диализуют против ФСБ в течение суток с трехкратной сменной диализующего раствора на холоде при 4^оС. После диализа экстракт консервируют формалином до 0,5% -ной концентрации по формальдегиду и определяют в нем количество белка по методу Лоури.

К 2,5% -ной взвеси танизированных эритроцитов добавляют антиген из гаприна в оптимальном разведении (оптимальное количество антигена для сенсибилизации эритроцитов определяют опытным путем в реакции пассивной гемагглютинации с референс-сывороткой). Смесь инкубируют в течение 2 ч при 37^оС с периодическим перемешиванием и 18 ч при 4^оС.

Сенсибилизированные эритроциты центрифугируют, супернатант сливают, осадок отмывают 3 раза ФСБ (рН 6,4). Отмытый осадок эритроцитов доводят до конечной концентрации 2% ФСБ (рН 7,2), содержащего 0,5% формалина. Готовый диагностикум хранят в холодильнике при 4^оС.

Контроль на этапах приготовления диагностикума.

Контроль танизированных эритроцитов: танизированные эритроциты не должны агглютинировать 1% нормальную кроличью сыворотку (НКС) и иммунную сыворотку к штамму ВСБ-874 - продуценту гаприна.

Контроль сенсибилизированных эритроцитов: сенсибилизированные эритроциты в 1% НКС оседают в виде точки - отрицательный контроль, а с референс-сывороткой - равномерно выстилают дно лунки при разведении сыворотки не менее 1: 8000 - положительный контроль.

Чувствительность диагностикума определяли в реакции нейтрализации антител (РНАт). Минимальная выявляемая доза антигена гаприна с различными сериями препарата находилась в пределах 0,005-0,05 мкг белка в 1 мл. С экстрактами гаприна (опытные образцы), продуцентами которого являются другие метанотрофные организмы Methylococcus thermophylus 111-6, Methylomonas methanica 12, Methylosinus curvatus GB-25 и с экстрактами гаприна при их концентрации 10,0 мг белка в 1 мл РНАт отсутствовала, что доказывает высокую специфичность метода.

П р и м е р. Метод индикации гаприна исследован в модельных опытах с целью определения доли специфического антигена в навесках готового продукта. Для этого были приготовлены водно-солевые экстракты из разных производственных партий гаприна с расчетной концентрацией 10-1000 мкг в 1 мл по сухой массе препарата. В приготовленных экстрактах определяли количество специфического антигена в РНАт.

Результаты исследования представлены в табл. 1. Из приведенных материалов следует, что предложенным методом можно выявить 1/231 часть специфического антигена от сухой массы гаприна.

Предлагаемым методом изучена загрязненность воздуха, гаприном в регионе расположения ОПУ Светлоярского завода БВК. Результаты исследования представлены в табл. 2.

Таким образом было показано, что предложенным методом индикации гаприна можно контролировать эффективность пылегазоочистных установок и степень загрязненности воздушного бассейна на уровне установленных ПДК.

Изобретение относится к гигиене и может быть использовано для оценки загрязнения воздушного бассейна продуктами микробиологического производства. Цель - специфическая индикация гаприна в атмосферном воздухе. Способ заключается в том, что отобранную аспирационную пробу переводят в жидкую фазу. Полученный экстракт титруют в 25 мкл 1% -ной НКС, последовательно добавляют иммунную сыворотку в дозе 2 ГАЕ и диагностикум к термостабильному антигену гаприна. В качестве имунной сыворотки используют сыворотку кроликов, иммунизированных культурой штамма - продуцента гаприна, выращенного в стериальных условиях. В качестве диагностикума используют эритроциты барана, нагруженные термостабильным антигеном гаприна, выделенным из готового продукта. Показано, что способ чувствителен и позволяет контролировать ПДК гаприна на уровне 0.0002мг/м³ по специфическому белку. Предложенный способ высокочувствителен и не дает ложно-положительных реакций с антигенами микроорганизмов, не связанных с производством гаприна.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПРИНА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ путем забора пробы воздуха аспирационным методом перевода ее в жидкую фазу и исследованием в реакции нейтрализации антител, при этом добавляют 2 гемагглютинирующие единицы штаммспецифической антисыворотки, полученной путем иммунизации кролика суспензией лиофилизированной биомассы, штамма - продуцента Methylococcus capsulatus, выращенного в стериальных условиях, и 0,5% взвеси эритроцитов барана, нагруженных термостабильным антигеном гаприна.