ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАПРИНА И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 1994 года по МПК A61K39/385 

Изобретение относится к медицине, а именно к санитарии, и может быть использовано при контроле загрязнения окружающей среды продуктами микробиологического производства.

Санитарно-гигиеническое нормирование загрязнения окружающей среды продуктами микробиологического синтеза потребовало создания методов контроля за уровнем специфического белка в атмосфере. Эта задача решалась индикацией белковых продуктов химическим способом. Наибольшее распространение при этом получил метод Лоури, с помощью которого определяют содержание белка в пробах воздуха [1] . Известно, что такой способ определения загрязнения воздуха не может достаточно надежно охарактеризовать уровень микробного белка в атмосфере воздуха, наличие которого связано непосредственно с основным технологическим процессом. Ложноположительные результаты в данном случае связаны с присутствием в пробе белковых продуктов непромышленного происхождения.

В связи с этим в последние годы появилось направление, связанное с использованием иммунохимических методов для индикации антигенов микроорганизмов, применяемых в биотехнологических производствах. Конструирование таких систем включает создание диагностикумов.

Известен эритроцитарный антительный диагностикум на паприн, представляющий собой взвесь формалинизированных таннизированных эритроцитов, нагруженных антителами к искомому продукту [2] . Недостатком его является невысокая стабильность препарата и нестандартность. Получение такого диагностикума во многом зависит от качества иммунной сыворотки к продукту. Следует отметить, что приготовление высокотитражных сывороток к паприну затруднительно из-за низкой его иммуногенности.

Более эффективными оказались тест-системы для определения паприна в реакции нейтрализации антител. Эти системы включают антигенные эритроцитарные диагностикумы [3] . Такого рода препараты представляют собой 2,5 % -ную взвесь формалинизированных таннизированных эритроцитов, нагруженных поверхностными антигенами штамма дрожжебодобных грибов рода Candida - продуцента паприна. Способ приготовления такого диагностикума включает следующие этапы:
1. 1 мл 20 % -ной взвеси формалинизированных эритроцитов трижды отмывают забуференным физиологическим раствором pH 7,2, после чего готовится 10 % -ная взвесь эритроцитов (2 мл).

2. К 2 мл 10 % -ной взвеси форманилизированных эритроцитов добавляют 2 мл раствора таннина в разведении 1 : 30000, после чего 4 мл полученной 5 % -ной взвеси эритроцитов с таннином инкубируют в течение 1 ч на водяной бане при 37^оС.

3. После таннизации осадок эритроцитов отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000g и 2 раза отмывают забуференным физиологическим раствором pH 7,2, после чего готовят 10 % -ную взвесь эритроцитов.

4. 2 мл 10 % -ной взвеси формалинизированных таннизированных эритроцитов смешивали с 2 мл антигена с концентрацией 200 мкг/мл по белку, после чего получается 4 мл 5 % -ной взвеси эритроцитов в растворе антигена с концентрацией 100 мкг/мл. Сенсибилизация протекает в течение 3 ч на водяной бане при 37^оС при периодическом перемешивании.

5. После сенсибилизации осадок эритроцитов отделяют центрифугированием (15 мин при 3000 g). Отмывают 1 раз забуференным физиологическим раствором pH 7,2, после чего готовят 4 мл 5 % -ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов и добавляют 0,04 мл формалина (1 % ). Хранят при 4^оС
Недостатком описанного диагностикума является нестандартность носителя, обусловленная тем, что используется биологический носитель, свойства которого меняются в зависимости от генетической особенности донора, от возраста донора, от сезона, условий содержания и т. д. Кроме того, на поверхности эритроцитов присутствуют изоантигены, способные вызывать ложноположительные реакции. Все это обусловливает необходимость введения различных контролей при постановке реакции на интактность носителя к используемым иммунным сывороткам и антигенам. Недостатками эритроцитарного диагностикума являются также лабильность эритроцитов к воздействию экстремальных факторов и трудности при стабилизации и стандартизации эритроцитарных препаратов.

Цель изобретения - увеличение чувствительности диагностикума и повышение его стандартности. Поставленная цель достигается тем, что диагностикум для определения паприна, включающий носитель и сенситин, готовится с использованием в качестве носителя окрашенного синим антрахиноновым жирорастворимым полистирольного латекса с активированными аминогруппами с размером частиц 1,12 мкм, с коэффициентом вариации 4,1 % и коэффициентом дисперсии 1,003 концентрацией аминогрупп 2,5˙10⁴ моль/г, а в качестве сенситина - термостабильной фракции препарата поверхностных антигенов (ППА) C. tropicalis ВСБ 928 с мол. м. 2000 кД.

Диагностикум готовится следующим образом.

1. 2 мл 1 % -ной взвеси латексных частиц отмывают забуференным физиологическим раствором pH 82 раза, осадок латекса центрифугируют в течение 20 мин при 4000 g.

2. К 2 мл 1 % -ной взвеси латекса добавляют 2 мл антигена с концентрацией 100 мкг/мл по белку, после чего получается 4 мл 0,5 % -ной взвеси латекса в растовре антигена с концентрацией 50 мкг/мл, которую инкубируют в течение 1 ч в термостате при 37^оС.

3. После инкубации частицы латекса центрифугируют в течение 20 мин при 4000 g.

4. К осадку латекса добавляют 2 мл глицинового буфера pH 7,8 для блокирования оставшихся связей на частицах латекса. Инкубация латекса в глициновом буфере длится 1 ч в термостате при 37^оС.

5. После инкубации латекс центрифугируют в течение 20 мин при 4000 g и отмывают фосфатным буфером pH 8. После этого готовят конечную концентрацию латекса 0,5 % (4мл). Хранят при 4^оС с добавлением азида.

Пример использования.

Приготовлено 4 вида диагностикумов.

1. Эритроцитарный диагностикум на основе препарата поверхностных антигенов (ППА) C. tropicalis ВСБ 928 (прототип).

2. Эритроцитарный диагностикум на основе термически обработанного ППА C. tropicalis ВСБ 928.

3. Эритроцитарный диагностикум на основе высокомолекулярной фракции термически обработанного ППА C. tropicalis ВСБ 928.

4. Латексный диагностикум на основе высокомолекулярной фракции термически обработанного ППА C. tropicalis ВСБ 928.

Диагностикумы исследованы в реакции агглютинации с антисывороткой на живую культуру C. tropicalis ВСБ 928. Все виды диагностикумов взаимодействовали с данной сывороткой в титре 1 : 1024. Это указывает на независимость агглютинабельности диагностикумов от свойств сенситина, взятого для нагрузки носителя, т. е. агглютинационный титр определяется активностью сыворотки.

На следующем этапе была исследована чувствительность диагностикумов в реакции нейтрализации антител. С этой целью в четырех рядах панели раститровали референс-препарат - ППА C. tropacais ВСБ 928, во все лунки внесли стандартное количество антител к культуре (2 гемагглютинирующие единицы), а затем в каждый ряд добавили соответствующий диагностикум. После инкубации в термостате определили концентрацию антигена при которой происходила инактивация 2 гемагглютинирующих единиц сыворотки. Результаты опыта приведены в табл. 1.

Из приведенных данных следует, что наименьшее количество ППА блокирует антитела при разрешении реакции на основе высокомолекулярной фракции термостабильного ППА, а латексный диагностикум на основе высокомолекулярной фракции термостабильного ППА не менее эффективен.

Таким образом, показано, что очищенная высокомолекулярная фракция термостабильного ППА является оптимальным сенситином для нагрузки носителя. Отличия предлагаемого диагностикума и прототипа даны в табл. 2 и 3. (56) 1. Немыря В. И. и Влодавец В. В. Охрана окружающей среды от выбросов предприятий микробиологической промышленности. - М. , 1979.

2. Методические указания по оценке загрязненности окружающей среды выбросами предприятий микробиологической промышленности при производстве паприна с помощью иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума. - М. -Л. , 1984.

3. Заключительный отчет по научно-исследовательской работе. Разработка иммунохимических реагентов для медико-гигиенической оценки модернизированного биотехнического производства на Волжском гидролизном заводе. 1990, УДК 579.841.4.083.334, N госрегистрации 019.00046730, инв. N 02910044099.

Новый диагностикум для определения специфического белка паприна в воздухе рабочей зоны и региона расположения предприятий микробиологической промышленности. Диагностикум готовится на основе полистирольного латекса с активированными аминогруппами, окрашенного синим антрахиноновым жирорастворимым, и высокомолекулярной фракции с мол. м. 2000 кД термически обработанного препарата поверхностных антигенов C. tropicalis ВСБ 928. Предлагаемый диагностикум может быть использован в тест-системе на основе реакции торможения пассивной гемагглютинации для медикобиологического контроля биотехнологических производств, использующих в качестве продуцента дрожжеподобные грибы Candida.

1. Диагностикум для определения паприна, включающий носитель и сенситин, отличающийся тем, что в качестве носителя используют крашенный синим антрахиноновым жирорастворимым полистирольный латекс с активированными аминогруппами с размером частиц 1,12 мкм, с коэффициентом вариации 4,1% и коэффициентом дисперсии 1,003 и концентрацией аминогрупп 2,5 · 10⁴ моль/г, а в качестве сенситина - термостабильную фракцию препарата поверхностного антигена C. tropicalis ВСБ 928 с мол. м. 2000 кД, содержащую при нагрузке частиц латекса в концентрации 0,5% 50 мкг/мл белка, при этом латекс нагружают путем ковалентного связывания. 2. Способ приготовления диагностикума для определения паприна путем предварительной отмывки носителя, сенсибилизации, повторной отмывки диагностикума и его конвервации, отличающийся тем, что предварительно отмытые частицы полистирольного латекса смешивают в концентрации 1% с раствором антигена, содержащим 100 мгк/мл белка, и перед повторной отмывкой его обрабатывают глициновым буфером при pH 7,8 для инактивации оставшихся аминогрупп.