СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ АНТИБИОТИКИ Российский патент 1997 года по МПК A61K47/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лечению больных с инфекционными заболеваниями, и к медицинской биотехнологии, в частности к способу повышения эффективности биодоступности ординарного лекарственного препарата.

В условиях лекарственного дефицита и перехода к рыночной экономике, ведущей к удорожанию лекарственных средств, а также с учетом выраженной сенсибилизации населения лекарственными препаратами возникла настоятельная необходимость в повышении их эффективности, сокращении количественного и финансового расхода без ущерба для их лечебно-профилактической надежности.

В настоящее время антибиотики являются самыми распространенными лекарственными средствами. В 1979 году на их долю приходилось до 15% всех вырабатываемых в мире препаратов. Однако антибиотики чаще других химиотерапевтических препаратов вызывают побочные действия в виде аллергических реакций, токсических явлений (с реакцией обострения), дисбактериоза, суперинфекции (Черномордик А.В. Применение антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов. Справочник, 1988, 320 с.).

Бензилпенициллина натриевая соль, бензилпенициллина калиевая соль широко применяются в лечебной практике. К действию препаратов пенициллина чувствительны многие аэробные и анаэробные бактерии, преимущественно грамположительные: стрептококк, стафилококк, некоторые штаммы энтерококка, клостридии газовой гангрены, столбняка, ботулизма, возбудители дифтерии, сибирской язвы, листериоза, эризипелоиза, а из грамотрицательных бактерий менингококк, гонококк, некоторые штаммы протея и спирохеты. Препараты пенициллина действуют на чувствительные микроорганизмы бактерицидно. Они действуют только на активно размножающиеся бактерии, не влияя на клетки, находящиеся в покое. Основным положительным свойством бензилпенициллина является бактерицидное действие на чувствительные микроорганизмы в очень малых концентрациях при полном отсутствии токсического действия больного (М.Д.Машковский. Лекарственные средства). Однако аллергические реакции являются наиболее частым побочным действием пенициллинтерапии. По данным ВОЗ (1979) частота аллергических реакций на пенициллин колеблется в различных странах от 0,7 до 10% Особенно часто наблюдается крапивница, отек Квинке, сывороточная болезнь, эозинофилия, тромбоцитопания, в редких случаях возможно развитие анафилактического шока (А.В.Черномордик, 1988, 320 с.).

В амбулаторной практике широко используется эритромицин препарат из группы антибиотиков-макролидов. Спектр действия эритромицина напоминает спектр пенициллина, но кроме того, действует на устойчивые к пенициллину возбудители коклюша, бруцеллеза, микоплазмы, пневмонии, риккетсии, некоторые простейшие (лямблии, амебы и др.) и хламидии. Эритромицин действует бактериостатически.

Препараты эритромицина очень малотоксичны, они не оказывают кумулятивного действия. Однако при приеме внутрь через рот наблюдается диспепсическое явление, что объясняется раздражающим действием на слизистые оболочки желудка и тонкой кишки. Наблюдается усиление перистальтики кишок, в особенности при значительных дозах, снижаются ферментативные функции и общее количество желудочного сока (А.В.Черномордик, 1988, 320 с.).

Тетрациклина гидрохлорид (из группы тетрациклических антибиотиков) - препарат широкого спектра антимикробного действия, охватывающий многие виды грамположительных и грамотрицательных бактерий, спирохеты, лептоспиры, риккетсии, многие штаммы микоплазмы хламидии и некоторых простейших. На чувствительные микроорганизмы оказывает бактериостатическое действие. Из побочных эффектов препарата чаще наблюдаются диспептические явления: отсутствие аппетита, тошнота, рвота, понос и др. Они не только вызываются прямым токсическим действием на слизистые оболочки желудка и кишок, но связаны и с ферментативной недостаточностью в пищеварительном канале, наблюдаемой почти у всех больных, получающих этот препарат. Уменьшается количество протеолитических и других пищеварительных ферментов, часто отмечается снижение секреции желудка, поджелудочной железы и печени. Тетрациклина гидрохлорид вызывает уменьшение всасывания в кишечнике жиров, углеводов и некоторых других веществ. Из других токсических явлений отмечаются различные нарушения функции печени. В некоторых случаях в результате применения тетрациклина развивается повышенная чувствительность кожи к действию солнечного света, имеющая фототоксический эффект. Сравнительно редко отмечаются аллергические осложнения (А.В.Черномордик, 1988, 320 с.).

В последнее время широкое применение в лечебной практике находит новый бактериальный препарат для перорального применения таривид (эфлоксацин).

Таривид представляет собой антибактериальный препарат широкого спектра действия (из группы фторированных хинолонов), обладает бактерицидным действием на грамположительных и грамотрицательных возбудителей. Побочные эффекты при лечении таривидом проявляются редко, в виде аллергической сыпи, фотодерматоза, аллергического отека лица или глотки, затруднения дыхания. В редких случаях наблюдаются нарушения со стороны центральной нервной системы (головные боли, головокружение, нарушение сна, мышечной координации). Отмечаются нарушения желудочно-кишечного тракта (абдоминальные боли, потеря аппетита, тошнота, рвота или понос) (Таривид. Научная монография, 1987. 60 с.).

Таким образом, применяемые в лечебной практике в настоящее время антибиотики, например пенициллин, эритомицин, таривид, обладают в большей или меньшей степени побочным действием, которое может усиливаться при увеличении доз этих препаратов с целью увеличения их концентрации в каком-либо органе.

Эти недостатки могут быть устранены включением антибиотиков в липосомы. Получение липосом описано в ряде источников. Наиболее близким по технической сущности является способ, описанный в работе Л.Б.Морголиса, Д.Д.Боргельсона. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М. Наука, 1986, с. 7-33.

Техническим результатом предложения являются повышение стабильности липосом, степени включения антибиотиков в сравнении с липосомами из фасфолипидов куриного желтка, повышение антибактериальной активности антибиотиков.

Технический результат достигается тем, что приготавливают липосомальные варианты препаратов антибиотиков, способные, не рассеивая лекарственные вещества по организму больного, прицельно поступать к микроорганизмам, находящимся в определенной ткани. Эта способность связана с тканевым тропизмом липоидных компонентов, из которых приготовлены липосомы.

В качестве основы для приготовления липосом нами был использован подкожный жир морского зверя тюленя ларги.

Липосомы готовили традиционным способом.

Размер получаемых липосомальных частиц в виде многослойных мембран (шариков) был от 350 до 1500 нм. Контроль размера липосом велся электронно-микроскопическим способом. Липидная основа для мембран получалась из тюленьего жира после удаления твердых глицеридов. Основным биологически активным компонентом явились жирные кислоты олеиновая, линолевая, арахидоновая. Смесь жирнокислотной основы в 0,85%-ном растворе хлорида натрия и фосфатном буфере pH 6,8 диспергировали ультразвуком в течение 20-40 с и получали стабильную липосому. pH фосфатного буфера 6,8 выбран с целью глубокого проникновения антибиотика в кожу (поверхность кожи pH 3-5, роговой слой pH 5-6, зернистый и верхняя половина шиповатого слоя pH 6,7-6,9) (А.М.Чернух с соавт. 1982, 336 с. Муравьев И.А. Кононихина Н.Ф. 1990). Для включения в липосомы антибиотиков, например пенициллина, используют метод замораживания-оттаивания в трех-шести повторностях по В.Г.Будуеру с соавт. 1987, с целью включения в липосомальный препарат как можно большего количества исходного лекарственного вещества. После этого в липосомы инкапсулировали различные концентрации антибиотика, понижающиеся по отношению к его минимальной лечебной дозе.

Диметилсульфоксид обладает высокой проникающей способностью, поэтому выполняет функции переносчика лекарственных веществ через биологические мембраны (Родионова Г.С. канд. дисс. 1972).

Липосомы получали следующим образом.

1 кг свежего подкожного жира морского млекопитающего, например тюленя, ларги, гомогенизируют и обрабатывают 10-15%-ным раствором хлорида натрия при температуре 40-50^oC, затем фракционируют на центрифуге при 500 об/мин в течение 30 мин, верхний жидкий слой сливают, в осадке общие фосфолипиды. В осадке определяют общие фосфолипиды по Васьковскому В.Е. с соавт. (1975). Осадок фосфолипидов трижды промывают 0,85%-ным раствора хлорида натрия.

Фосфолипиды растворяют в этаноле. Готовят раствор фосфолипидов в этаноле от 30-50 мг фосфолипидов на 100 мл этанола.

Введение антибиотика в липидную фазу. Растворяют амфифильный антибиотик в этаноле, 30 мг/мл, и добавляют к этанольному раствору фосфолипидов.

Вводят стеориаламин (для создания положительного заряда, 1 мг/мл и диметилсульфоксид, транспортный агент, 1 мг/мл).

На роторном испарителе при 20^oC ведут упаривание. Получают тонкую прозрачную пленку, равномерную.

Для уничтожения следов воды и этанола продувают в течение 1 ч азот, предварительно очищенный по стандартной методике, сушат пленку липидов в вакууме 10^-2 мм рт. ст. в течение 4 ч на лиофильной сушке.

Предварительно измельченный антибиотик суспензируют (антибиотики - производные оксихинолонкарбоновой кислоты, обладающие ограниченной растворимостью, при pH 6,7-6,9 в смеси забуферного изотонического раствора) 0,05 моль и 0,10 моль NaCl, концентрации таривида 1-10 мг/мг.

Вносят в колбу 1 мл забуферного антибиотиксодержащего изотонического раствора (на стеночку колбы, осторожно). Образование молочного цвета суспензии признак получения целебного продукта.

Доводят суспензию до 100 мл при постоянном перемешивании магнитной мешалкой, зашитой в инертный полиэтилен.

Получены мультиламаллярные липосомы, размер 500-800 нм.

Суспензию антибиотиксодержащих липосом отделяют от водной среды, если это необходимо, центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15 мин. К осадку липосом, содержащих антибиотики, добавляют вновь забуферный изотонический раствор. Осадок липосом лиофилизовали и хранили без изменений в течение 3,5 мес.

Характеристика получаемого по предлагаемому способу целебного продукта, позволяющая его идентифицировать, приведена в табл.1.

Физико-химические показатели эффективности липидного носителя и стабильности получаемых липосом приведены в табл.2.

Степень включения в липосомы антибиотика определялась на приборе КФК-2 (фотоэлектроколориметрическим методом: Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М. Высшая школа, 1979, 1979, с.176-178; Гров Д.С. Рендаля В.А. Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков. М. 1958).

Концентрация антибиотиков определялась в водной среде, степень включения рассчитывалась по разнице между нагруженным и невключающимся в липосому.

Степень включения антибиотика и стабильность инкапсулированной формы приведены в табл.3.

Таким образом, предлагаемый способ получения липосом, содержащих антибиотики (производные оксихинолонкарбоновой кислоты), обладает рядом преимуществ:
повышением эффективности за счет органотропности липидного носителя,
более высокой степенью включения амфифильного антибиотика за счет инкапсулирования его как в липидную, так и в водную фазу,
удешевлением источника липидного носителя за счет применения неутилизируемого пищевой и фармацевтической промышленностью фосфолипидов подкожного жира морских млекопитающих,
отсутствием в процедуре токсичных растворителей, таких как хлороформ или метанол или, эфир,
повышением транспортных возможностей липосом за счет введения транспортного агента диметилсульфоксида,
повышением биодоступности за счет отобранного значения pH. Токсических эффектов в экспериментах 1n y1y0 на белых беспородных мышах в концентрациях, указанных в данном ответе, мы не наблюдали.

Действие препаратов проверено на грамотрицательной и грамположительной микрофлоре. Для этого использовали мясо-пептонный агар, на который сплошным газоном высеивали индикаторную тест-культуру, наносили стандартный стерильный диск фильтровальной бумаги с липосомальным препаратом с определенной концентрацией антибиотиков. Вокруг диска с препаратом наблюдалась зона задержки роста или стерильная зона. Минимальная концентрация липосомального препарата с антибиотиком, дающая стерильную зону, равную обеспеченной чистым антибиотиком, принимали за лечебную. Таким образом проверено 4 наиболее часто употребляемых с лечебной целью антибактериальных препарата.

Результаты проведенных исследований на примере суммированы в табл.4 и 5.

Для сравнения бактерицидных свойств компонентов липосомального варианта таривида изучали размеры зон задержки роста у ДМСО (диметилсульфоксида) и липидной основы липосом (эмульсии на ПНЖК + фосфатный буфер (pH 6,8) + 0,85% -ный раствор натрия хлорида).

Чистая эмульсия не давала зоны задержки роста бактерий, а у диметилсульфоксида зона составляла всего 13 мм, то есть ниже стандартной зоны (14-15 мм). Как видно, наиболее высокой зоной задержки роста бактерий обладает из низких концентраций липосомальный вариант с концентрацией 0,27%
Для подтверждения повышения биодоступности антибиотиков аналогичные исследования были проведены еще с тремя антибиотиками пенициллином, эритромицином, тетрациклином.

Результаты исследования помещены в табл.5.

В табл.6 представлены данные об антимикробной активности липосомальной и традиционной форм антибиотиков.

Таким образом, положительный эффект предполагаемого изобретения достигается рядом его преимуществ, суть которых состоит в повышении эффективности способа лечения, что достигается путем увеличения биодоступности. К увеличению биодоступности антибиотика приводит включение его в липосому, носитель которой состоял из органотропных, обеспечивающих специфичность доставки лекарств фосфолипидов подкожного жира млекопитающих.

Липосомальный носитель состоял из биологически активных полиненасыщенных жирных кислот, что в свою очередь положительно влияло на эффективность способа лечения кожных заболеваний, сопровождающихся пиодермией. Кроме того, липофильный антибиотик таривид концентрировался и в липосомальном носителе, что в свою очередь позволило снизить лечебную дозу употребляемого антибиотика и его побочное действие.

Предлагаемый способ обладает и экономическим эффектом, т.к. он дешевле способа лечения кожных заболеваний, предложенных в качестве аналогов, в 40 раз.

Использование: лечение больных с инфекционными заболеваниями, медицинская биотехнология для повышения биодоступности антибиотиков. Сущность изобретения: готовятся липосомальные варианты антибиотиков, в которые добавляется диметилсульфоксид. Антимикробное действие приготовленного по предлагаемому способу антибиотика возрастает в 1,5-2 раза в сравнении с чистым препаратом. Липосомы готовятся на основе жидких глицеридов из подкожного тюленьего жира, что способствует повышению биодоступности инкапсулированного антибиотика в присутствии сильного проникающего агента -диметилсульфоксида. 6 табл.

Способ получения липосом, содержащих антибиотики, включающий приготовление растворов фосфолипидов и антибиотиков, их контактирование с последующей лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что используют фосфолипиды из подкожного жира морского млекопитающего, введение антибиотика осуществляют в липидную фазу и в свободный объем липосомы, для чего концентрируют антибиотик в фосфолипиде носителя в присутствии диметилсульфоксида, а затем лиофильно высушенный продукт контактируют с суспензией антибиотика, имеющий рН 6,7 6,9.